Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología

Instituto Nacional de Higiene: 70 años

María Isabel Urrestarazu

Identificación de una secuencia de ADN genómico de Leishmania especifica del subgénero Leishmania

Leishmania es el agente causante de la compleja enfermedad conocida como leishmaniasis. Las distintas especies de este parásito protozoario se encuentran agrupadas en dos subgéneros, Viannia y Leishmania, de acuerdo a su desarrollo en el mosquito vector. Un ensayo de PCR, β500-PCR, específico del subgénero Viannia, ha sido desarrollado utilizando la secuencia de ADN genómico denominada β500. En este trabajo se presenta el aislamiento e identificación de una secuencia genómica de 280 pb, L280, a partir del ADN genómico de Leishmania (Leishmania) mexicana luego de aplicar el ensayo β500-PCR en condiciones de baja rigurosidad. La secuenciación parcial de L280 permitió diseñar un ensayo de PCR (L280-PCR) que generó un producto de amplificación de 260 pb, en distintas condiciones de rigurosidad, cuando se utilizó el ADN genómico de distintas especies pertenecientes al subgénero Leishmania. El ensayo L280-PCR resultó negativo para el ADN genómico de distintas especies del subgénero Viannia al igual que para el ADN de otros organismos kinetoplastidos o humano. Los resultados sugieren que el ensayo L280-PCR es específico del subgénero Leishmania.

Leishmania is the causal agent of the leishmaniasis disease. The different species of this protozoa parasite are grouped in two subgenera, Viannia and Leishmania, according to their development in the sandfly vector. A specific PCR assay, β500-PCR, has been developed for the Viannia subgenus using the genomic β500 DNA sequence. In the present work we present the isolation and identification of a genomic sequence of 280 bp, L280, obtained from genomic DNA of Leishmania (Leishmania) mexicana after application of the β500-PCR assay at low stringency. After partial sequencing of L280 a PCR assay was generated, L280-PCR, this yielded a product of 260 bp at different conditions of stringency, when genomic DNA of different species of Leishmania subgenus was used. The L280-PCR assay was negative to genomic DNA of species belonging to the Viannia subgenus and also to other kinetoplastid organisms and human. The results suggest specificity of the L280-PCR assay for the Leishmania subgenus.

Geohelmintiasis intestinal en preescolares y escolares de una población rural: realidad socio-sanitaria. Estado Falcón, Venezuela

Las geohelmintiasis constituyen un problema de salud pública, por lo que su presencia en preescolares y escolares de la población de Macuquita, estado Falcón, Venezuela, se estudió mediante la técnica de Kato-Katz. Se evaluaron las características clínicas y las condiciones socio-sanitarias. El estado socio-económico de los núcleos familiares se estableció por el método de Graffar, encontrándose que el 100% (p< 0,05) de la población pertenece al estrato social V. La frecuencia de geohelmintiasis en los escolares fue de 64% (n=9) y 43% (n=6) en los preescolares. Las especies de geohelmintos más reportados fueron A. lumbricoides (41.1 %), T. trichiura (23.5%) y S. stercoralis (29.4%). En conclusión, la promoción de medidas que contribuyan a mejorar las condiciones socio-sanitarias son muy importantes para poder controlar la alta incidencia de esta patología. Se sugiere continuar el estudio ampliando el método diagnóstico y abarcando también los animales que cohabitan en el peridomicilio.

Geohelminthiasis constitutes a public health problem, due to which its presence in pre-school and school children from the Macupita population, Falcon state, Venezuela, was studied through the Kato Katz technique. Clinical characteristics and social-economical conditions were evaluated. The social-economical status of family nuclei was established by the Graffar method, determining that 100% (p<0.05) of the population belongs to social stratus V. Geohelminthiasis frequency in school children was 64% (n=9) and 43% (n=6) in preschool children. The most reported geohelminth species were A. lumbricoides (41.1%), T. trichiura (23.5%), and S. stercoralis (29.4%). In conclusion, the promotion of measures that contribute to improve the social-sanitary conditions are very important to control this pathology. It is suggested to continue the study increasing diagnostic methods and also including the animals that inhabit peri-household areas.

Zigomicosis en el Complejo Hospitalario Universitario Ruiz y Páez, Ciudad Bolívar, período 1984-2007

La zigomicosis es una infección grave en pacientes inmunocomprometidos. El objetivo de este estudio fue presentar los casos de zigomicosis registrados en un período de 23 años en el hospital de referencia del estado Bolívar. Se realizó una investigación retrospectiva de las historias clínicas de pacientes en el hospital de referencia del estado Bolívar. Todos los pacientes a quienes se les realizó diagnóstico de zigomicosis por biopsia entre enero 1984 y enero 2007 fueron incluidos en este estudio. Se identificaron 6 casos de pacientes con zigomicosis. Todos los casos tuvieron como factor predisponente la diabetes mellitus. Tres casos correspondieron a la forma rinosinusal, de los cuales uno tuvo complicación cerebral y los otros 3 casos presentaron compromiso cutáneo. Hubo 2 casos de mortalidad. El tratamiento agresivo de la enfermedad localmente invasiva es importante para prevenir la diseminación rápida y fatal de esta micosis. Los pacientes con diabetes mellitus descompensada están en riesgo de desarrollarla.

Zygomycosis is a serious infection in immunocompromised patients. The purpose of this study was to present the zygomycosis cases registered during a 23 year period at the reference hospital in Bolivar State. A retrospective analysis of all the clinical case histories was done at the mentioned hospital in Bolivar State. All patients who were diagnosed with zygomycosis through a biopsy between January 1984 and January 2007 were included in the study. Six patients were identified with zygomycosis. All cases had diabetes mellitus as predisposing factor. Three cases corresponded to the rinosinusidal form, one of which had a cerebral complication, and the other 3 presented cutaneous compromise. There were 2 deaths. Aggressive treatment of the locally invasive disease is important to prevent a fast and fatal dissemination of this mycosis. Patients with uncompensated diabetes mellitus are under risk of developing it.

Diagnóstico de leptospirosis mediante la PCR en pacientes con síndrome febril icterohemorrágico

El objetivo del estudio fue evaluar la utilidad de la PCR en el diagnóstico de la leptospirosis humana, utilizando dos pares de iniciadores específicos para las leptospiras patógenas. Se examinaron por la prueba serológica MAT y la PCR muestras de orina y suero de 73 pacientes con SFIH y epidemiología compatible con leptospirosis. Muestras de 10 pacientes (55,5%) con diagnóstico confirmado de leptospirosis por MAT resultaron positivas por PCR. El 28% de los sueros de pacientes clasificados por serología como casos no confirmados resultó PCR positivo, lo que demuestra el valor de la PCR en el diagnóstico temprano de la leptospirosis humana. La comparación de los resultados de PCR en muestras de orina y suero determinó una mayor sensibilidad de esta técnica en muestras de orina. Considerando las diferentes fases de la leptospirosis en el análisis de los resultados de la PCR, se demostró la utilidad de las muestras de orina en el diagnóstico precoz de la enfermedad. Se concluye que la PCR es un método sensible y específico que aplicado en muestras clínicas y de manera complementaria a las pruebas serológicas sirve para detectar casos de leptospirosis, especialmente en pacientes graves en los que es necesario hacer diagnóstico diferencial.

The purpose of this study was to evaluate the usefulness of PCR for the diagnosis of human leptospirosis using two pairs of specific pathogenic Leptospira initiators. Urine and serum samples from 73 patients with ictohaemorrhagic fever syndrome (IHFS) epidemiologically compatible for leptospirosis were examined by the MAT serologic test and by PCR. Ten (55.5%) samples from patients with MAT confirmed leptospirosis were also PCR positive. Sera from 28% of patients classified as non serologically confirmed cases were PCR positive, which shows the importance of PCR for the early diagnosis of human leptospirosis. A comparison of the PCR results in urine and serum samples determined the greater sensibility of this technique in urine samples. The usefulness of urine samples for the early diagnosis of leptospirosis was demonstrated by considering the different leptospirosis phases in the analysis of the PCR results. It is concluded that PCR is a sensitive and specific method which, applied to clinical samples and as complement to serological tests, if useful to detect leptospirosis cases, especially in patients with severe symptoms, when it is necessary to reach a differential diagnosis.

Extracción y purificación de glucosa oxidasa para fines diagnósticos producida en medios a base de fertilizantes y azúcar industrial

La enzima glucosa oxidasa (GOX) es componente esencial de reactivos para determinación de glicemia y otros parámetros paraclínicos. Para su producción suele utilizarse Aspergillus niger cultivado en medios con sustratos costosos de grado analítico. Por tanto, se planteó purificar GOX producida por A. niger, cultivado con nutrientes complejos y económicos, y evaluar su efectividad en mediciones de concentración de glucosa. Para ello se formularon 4 tipos de medio, uno estándar y tres alternativos con azúcar industrial y fertilizantes. Los cultivos se realizaron en fiolas con 50 mL de medio bajo un diseño de bloques al azar, evaluando el crecimiento y la actividad enzimática. El medio alternativo con mejor rendimiento fue seleccionado para producción en biorreactores de 5 L y posterior purificación de GOX (fraccionamiento salino y cromatografías en Sephadex G-25 y DEAE-Sephacel). Se obtuvieron altos rendimientos de enzima (7 mg por carga) de alta pureza (39000 U/g) y un K M aparente para glucosa de 22 ± 1 mM. El reactivo de diagnóstico formulado presentó un intervalo de linealidad óptima (de 50 a 600 mg/dL de glucosa). Por lo que se concluyó que los sustratos en el medio de cultivo alternativo no interfieren en la calidad y cantidad del producto purificado.

The enzyme glucose oxidase (GOX) is an essential component of reagents used for determining blood sugar and other clinical parameters. Aspergillus niger grown in media prepared with expensive analytical grade substrates is used for its production. Therefore, we decided to purify GOX produced by A. niger grown in media with complex and inexpensive nutrients and to evaluate its efficiency in glucose concentration measurement assays. For this purpose we formulated four types of media, one standard and other three alternatives in which we used industrial sugar and fertilizers. The cultures were done in 50 mL flasks under a random block design, evaluating growth and enzymatic activity. The alternative medium with the best yield was selected for production in 5 liter bioreactors and later GOX purification (saline fractioning and Sephadex G-25 and DEAE-Sephacel chromatography ). Two large enzyme yields were obtained (7 mg per load), highly purified (39000 U/g), and with an apparent 22 ± 1 mM glucose K M. The diagnostic reagent formulated presented an optimal linearity interval (between 50 and 60 mg/dL glucose). Therefore, it was concluded that the substrates in the alternative culture medium did not interfere in the quality and quantity of the purified product.

**Primer reporte de infección natural por Nocardia cyriacigeorgica en ratones BALB/c**

Las bacterias del género Nocardia son actinomicetos aerobios cuyo hábitat es el suelo y la materia orgánica en descomposición. La infección natural por especies de este género ha sido reportada en humanos y animales, sin embargo, la infección natural en ratones no ha sido descrita. En este estudio se demuestra por primera vez el aislamiento de la especie recientemente descrita, Nocardia cyriacigeorgica, en pulmones de ratones Balb/c. El estudio microbiológico de las muestras de pulmón reportó la presencia de filamentos grampositivos ramificados fragmentados en forma cocobacilares. Los estudios de PCR demostraron que la especie aislada fue N. cyriacigeorgica. Se evidencia en este trabajo que N. cyriacigeorgica es potencialmente patógena en ratones Balb/c.

Bacteria belonging to the Nocardia genus are aerobic actinomycetae whose habitat is the ground and decomposing organic material. Natural infection by species belonging to this genus has been reported in humans and animals; nevertheless, natural infection in mice has not been described until now. This study demonstrates for the first time the isolation of a recently described species, Nocardia cyriacigeorgica, rom the lungs of Balb/c mice. The microbiological study of the lung samples reported the presence of branched Gram positive filaments with a cocobacillar shape. PCR studies demonstrated that the species isolated was N. cyriacigeorgica. This study demonstrates that N. cyriacigeorgica is potentially pathogenic for Balb/c mice.

Bacteroides fragilis enterotoxigénico aislado de pacientes con vaginitis

La vaginitis es un diagnóstico común en ginecología. Su presencia obedece a diversas causas, algunas aún desconocidas. Bacteroides fragilis es el anaerobio más importante desde el punto de vista clínico. Entre otros factores de virulencia, algunas cepas producen una enterotoxina asociada con diarrea. Estas cepas han sido aisladas tanto de muestras intestinales como extra intestinales. Por la existencia de procesos inflamatorios en la mucosa cérvico-vaginal de etiología desconocida se investiga a B. fragilis enterotoxigénico en pacientes con vaginitis. Se procesaron 140 muestras de pacientes y 40 de controles sanos. De las pacientes sintomáticas se aislaron 15 cepas de B. fragilis y ninguna en los controles (P<0,05). Posteriormente, fueron cultivadas en anaerobiosis, usando caldo cerebro-corazón suplementado con vitamina K1 y hemina durante 48 horas a 36°C. El sobrenadante se obtuvo por centrifugación y su actividad se ensayó en células HT-29. Doce (80%) cepas produjeron alteraciones en la monocapa celular, manifestada por desprendimiento, disolución de los acúmulos, expansión y disgregación de las células, superando en algunos casos la toxicidad observada en el control positivo. En siete pacientes, B. fragilis enterotoxigénico no estuvo asociado a patógenos específicos. La presencia de B. fragilis enterotoxigénico en pacientes con vaginitis plantea la necesidad de definir su papel en la etiología de esta entidad clínica.

Vaginitis is a common diagnosis in the centers of gynecological attention. It is due to several causes, some even unknown. Bacteroides fragilis is the most important anaerobe in clinical practice; some strains produce an enterotoxin associated with diarrhea. Enterotoxigenic B. fragilis has been isolated from intestinal as well as extra intestinal samples. Because inflammatory processes unknown etiology it was investigated B. fragilis in the cervical-vaginal mucous in the patients with vaginitis. 140 samples were processed from symptomatic patients and 40 from healthy controls. 15 strains of B. fragilis were isolated from symptomatic patients while none were found in controls (P<0,05). These strains were cultivated in anaerobic chambers, cultured in brain heart infusion supplemented with vitamin K1 and hemine during 48 hours at 36°C. Supernatant were obtained by centrifugation and its activity assayed in HT-29 cells. Twelve (80%) of the isolated induced alterations in target cell morphology characterized by cell detachment, breakup of cell clumps, expansion and degradation of cells, some cases revealed a higher cytotoxic activity than the positive control. In seven patients enterotoxigenic B. fragilis was not associated to specific pathogens. The presence of enterotoxigenic B. fragilis in patients with vaginitis raises the necessity to define its role in the etiology of this clinical entity.

Estafilococos oxacilino resistentes en queso blanco fabricado en el estado Anzoátegui, Venezuela

El objetivo de esta investigación fue detectar especies estafilocócicas oxacilino resistentes en quesos blanco duro y blando, fabricados artesanalmente en diversos municipios de la zona norte del estado Anzoátegui. Las cepas de Staphylococcus fueron aisladas e identificadas empleando métodos convencionales y se confirmaron las especies coagulasa negativas mediante galerías API 32 Staph (BioMérieux); la susceptibilidad a oxacilina y otros antibióticos por el método de difusión en disco y la presencia del gen mecA, por prueba de látex MRSA Slidex (BioMérieux) que pone de manifiesto la proteína PBP2a. De 130 quesos evaluados, se aislaron 171 cepas estafilocócicas, 26 (15,2%) resistentes a oxacilina (61,5% con presencia del gen), distribuidas como sigue: 14 cepas de S. epidermidis (8,2%), 6 de S. capitis (3,4%), 2 de S. aureus (1,2%), 2 de S. hominis (1,2%), 1 de S. warneri (0,6%) y 1 de S. saprophyticus (0,6%). La presencia del gen que codifica para la proteína PBP2a se detectó tanto en cepas con homorresistencia (76,9%) como con heterorresistencia (23,1%). S. haemolitycus fue 100% sensible a oxacilina. La presencia de cepas estafilocócicas oxacilino resistentes en el queso blanco, puede representar un riesgo para salud pública ya que podría servir como fuente de diseminación de éstas y acrecentar el problema de la resistencia.

The purpose of this study was to detect oxacyllin resistant Staphylococcus species in hard and soft white cheese manufactured by artisans at various municipalities of the northern area of Anzoátegui State. The Staphylococcus strains were isolated and identified using conventional methods and coagulase negative species were confirmed through API 32 Staph (BioMérieux) galleries; susceptibility to oxacyllin and other antibiotics was determined by the disk diffusion method and presence of the mecA gene with the MRSA Slidex (BioMérieux) latex test that identifies PBP2a protein. From 130 cheeses evaluated, we isolated 171 Staphylococcus strains, 26 of which (15,2%) were oxacyllin-resistant (61,5% with presence of the gene), distributed as follows: 14, S. epidermidis strains (8,2%); 6, S. capitis (3,4%); 2, S. aureus (1,2%); 2, S. hominis (1,2%); 1, S. warneri (0.6%); and 1, S. saprophyticus (0.6%). Presence of the protein PBP2a codifying gene was detected in both homoresistant (76.9%) and heteroresistant (23.1%) strains. S. haemolitycus was 100% oxacyllin sensitive. Presence of oxacyllin resistant strains in white cheese can represent a public health risk since it could serve as a dissemination source, increasing the resistance problem.

Etiología de diarrea aguda en niños menores de 5 años Ciudad Bolívar, Venezuela

Se determinó la etiología infecciosa de la diarrea aguda en niños menores de 5 años en Ciudad Bolívar, Estado Bolívar. Para ello, se procesaron 110 muestras de heces. Se realizó un examen directo de heces, métodos de concentración Kato-Katz, formol-éter y Kinyoun para identificación de parásitos; detección de antígenos virales de Adenovirus y Rotavirus mediante Látex Diarlex®, coprocultivo y Tricrómica modificada de Ryan-Blue para Microsporidium spp. La prevalencia de parasitosis intestinal fue 27,3%, siendo Blastocystis hominis y Giardia lamblia las más frecuentes (11,8% y 9,2% respectivamente). Once muestras resultaron positivas para Rotavirus (10,0%) y 3 para Adenovirus (2,7%). Las enterobacterias diagnosticadas fueron Escherichia coli enteropatógena (2,7%; 3/110), Salmonella spp (1,8%; 2/110) y Shigella spp (0,9%; 1/110). Los síntomas más frecuentes fueron: fiebre (40,1%) y dolor abdominal (27,3%). No se observó Microsporidium spp. No hubo asociación significativa entre la presencia de enteropatógenos y los síntomas (p>0,05). Se concluye que la etiología de las diarreas agudas en niños menores de 5 años en Ciudad Bolívar, durante el período de estudio, fue principalmente de origen parasitario y viral.

The infectious etiology of acute diarrhea in children under five years of age in Ciudad Bolivar, Bolivar State was determined. One hundred and ten stool samples were processed. The tests included direct examination, the Kato-Katz concentration method, the formol-ether method and the Kinyoun method for parasite identification, detection of viral Adenovirus and Rotavirus antigens through Latex Diarlex ®, stool culture, and modified Ryan-Blue trichromic stain for Microsporidium spp. Prevalence of intestinal parasitosis was 27.3% and Blastocytis hominis and Giardia lamblia were the most frequent parasites (11.8% and 9.2% respectively). Eleven samples were positive for Rotavirus (10.0%) and 3 for Adenovirus (2.7%). The enterobacteria diagnosed were enteropathogenic Escherichia coli (2.7%; 3/110), Salmonella spp (1.8%; 2/110) and Shigella spp (0.9%; 1/110). The most frequent symptoms were: fever (40.1%) and abdominal pain (27.3%). Microsporidium spp was not observed. There was no significant association between presence of enteropathogens and symptoms (p>0.05). It is concluded that the etiology of acute diarrhea in children under five years of age in Ciudad Bolivar during the study period was mainly of parasite and viral origin.

Cryptococcus spp. in Venezuela and its relationship with the MicroScan^® biotype

El lector del panel microbiológico automatizado autoScan®-4 detecta el crecimiento del hongo en diversos sustratos bioquímicos, presentes en los pozos de los paneles del MicroScan®. El propósito de este estudio fue relacionar el ¨biotipo¨ identificado por el MicroScan® con la especie causante de criptococosis, con el objeto de permitir una identificación en el menor tiempo posible. Se evaluaron 82 cepas de Cryptococcus spp. aisladas a partir de muestras clínicas entre 1995 y 2004. Para garantizar la pureza de las cepas, se realizó la identificación de las mismas por métodos convencionales; para identificar las especies se utilizó el medio L-canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB). Se utilizó también el panel de identificación rápida de levaduras del MicroScan®, con el fin de determinar el ¨biotipo¨. El MicroScan® reveló 27 diferentes ¨biotipos¨. De los 82 aislados tipificados con el uso del medio CGB, el 91,46 % correspondieron a C. neoformans y 8,54 % a C. gattii. No se encontró una diferencia significativa entre los ¨biotipos¨ y las especies (p>0,05). Sin embargo, se encontró significancia estadística entre las especies C. gattii y C. neoformans y la asimilación de p-nitrofenil-N-acetil-ß-D-glucosamina (NAG) (p<0,05). El panel de identificación rápida de levaduras del MicroScan® no fue capaz de diferenciar ambas especies.

The automated reader of the AutoScan® -4 microbiological panels detects fungi growth in various biological substrates present in the MicroScan® panel wells. The purpose of this study was to relate the biotype identified by the MicroScan® with the species causing the criptococcosis, in order to obtain identification in the shortest possible period. The evaluation included 82 Cryptococcus spp. strains isolated from clinical samples between 1995 and 2004. To guarantee the purity of the strains they were also identified by conventional methods; to identify the species we used L-canavanin-glycine-bromthymol blue medium (CGB). We also used the fast yeast identification MicroScan® panel with the purpose of determining the biotype. The MicroScan® revealed 27 different biotypes. Of the 82 isolates typed with the CGB medium, 91.46% corresponded to C. neoformans and 8.5% to C. gattii. No significant difference was found among the biotypes and the species (p<0,05). Nevertheless, there was a statistically significant difference between the assimilation of p-nitrophenil-N-acetyl-ß-D-glucosamine (NAG) (p<0.05) by the C. gattii and the C. neoformans species. The fast yeast identification MicroScan® panel was not able to differentiate between both species.

**Comportamiento biológico de Blastocystis hominis en pacientes tratados con Secnidazol (Unidazol^®)**

Blastocystis hominis, clasificado como Stramenopile, es el parásito intestinal más frecuente en el hombre. En las heces y cultivos se observan formas con cuerpo central (FCC), granulosas (FGra), globulosas, ameboides, en división binaria y quistes. Su elevada prevalencia, asociación con síntomas en el humano y carencia de tratamiento efectivo, justificó la evaluación del Secnidazol (Unidazol® ZUOZ-PHARMA) en 14 individuos (7 varones y 7 hembras), infectados con B. hominis, con edades entre 5-79 años, quienes fueron evaluados clínica y parasitológicamente antes y después del tratamiento, con una dosis del medicamento: 2g (adultos) y 30 mg/Kg/peso (niños). En el examen seriado de heces (3 muestras), se evaluó la morfología, número por campo microscópico (400X), formas de reproducción y crecimiento en el cultivo. En 14,3% (2/14) de los pacientes se eliminó el parásito y en el resto, se observó disminución significativa del número por campo (p< 0,05), de la frecuencia de FCC (p=0,001) y FGra (p<0,05) y disminuyó la positividad del examen directo (p<0,001). Estos resultados demuestran que el fármaco en dosis única, ocasionalmente erradicó a B. hominis, disminuyó la excreción de las formas vegetativas e indujo la aparición de quistes. Estos estudios deben continuarse.

Blastocystis hominis, classified as Stramenopile, is the most frequent intestinal parasite in humans. In feces and cultures, forms with a central body (FCB), granulose forms (GraF), as well as globulous and ameboid forms in binary division or in cysts are seen. Its elevated prevalence, association with symptoms in humans, and lack of effective treatment, justified the evaluation of secnidazol (Unidazol ® ZOUZ-PHARMA) in 14 individuals (7 males and 7 females) infected with B. hominis, with ages between 5-79 years, who were clinically and parasitologically evaluated before and after treatment; with one dose of the drug: 2 g for adults and 30 mg/Kg body weight for children. In feces serial examinations we evaluated morphology, number of parasites per microscopic field (400X), reproductive forms, and growth in culture. The study showed that in 14.3% (2/14) of patients the parasite was eliminated, and there was a significant decrease of the number per field (p< 0.05), of the FCB (p= 0.001) and of GraF (p< 0.05) frequency in the rest, as well as a decrease of positive direct examinations (p< 0.001). These preliminary results show that the drug in a single dose occasionally eradicated B. hominis, decreased the excretion of vegetative forms and induced the occurrence of cysts.These studies should be continued.

Investigaciones clínico-epidemiológicas de patógenos transmitidos del médio ambiente al hombre