Determinación de la actividad

Antimicrobiana de los Extractos de la Azadirachta Indica A. Juss (Neem)

María Gualtieri¹ ,Carolina Villalta, Ana M. Guillén, Elisa Lapenna, Emma Andara

¹ Laboratorio de Investigación de Medicamentos Orgánicos "Dr. Ramón Masini Osuna". Facultad de Framacia y Bioanálisis. Escuela de Farmacia. Universidad de Los Andes. Mérida. 0274-2403485. E-mail: gualtier@ula.ve

RESUMEN

Azadirachta indica A. Juss, conocida como Neem, árbol sagrado,originaria de la India, utilizada en la medicina tradicional del África por sus propiedades bactericidas, antiinflamatorias, antivirales,antipiréticas, insecticidas y fungicidas. Posee sustancias químicas activas capaces de combatir eficazmente numerosas enfermedades. En este estudio se realizó una evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos, etanólicos y cetónicos de las hojas sobre varios microorganismos como fueron: E. coli enteroinvasiva y E. coli enterotóxica, S. aureus ATCC 25923 , P. aeruginosa ATCC 27853 , C. krusei ATCC 6258 y C. albicans ATCC 90028. Los resultados obtenidos en esta evaluación microbiológica muestran que dichos extractos, a la dosis de 0,02g/ml ,presentaron una acción antibacteriana y antifúngica sobre los diferentes microorganismos de una manera selectiva. Los extractos etanólicos y cetónicos mostraron actividad contra E. coli enteroinvasiva y E. coli enterotóxica, S. aureus ATCC 25923 , P. aeruginosa ATCC 27853 y C. krusei ATCC 6258. Los extractos acuosos no presentaron actividad contra ninguno de los microorganismos ensayados en la dosis empleada. Ninguno de los extractos evaluados fue activo contra la levadura C. albicans ATCC 90028.

Palabras claves: Azadirachta indica, Neem, antimicrobiano.

ABSTRACT

Azadirachta A. Juss, known as Neem, is a sacred tree native from India,its leaves are used in traditional African Medicine for their bactericide,anti-inflammatory, anti-viral, antipyretic, insecticide and fungicide properties. It is believed that its chemical compounds could be active against several diseases. In this investigation,evaluations on the anti-microbial activity of aqueous, ethanolic and ketonic leaves extracts were carried out against several microorganismos sucas: entero-invasive E. coli and enterotoxic E. coli , ATCC 25923; S. aureus ,ATCC 27583; P. aeuroginosa, ATCC 6258; C. krusei and ATCC 90028; C. albicans. Antibacterial and antifungic activity was observed at a dose of 0.02 g/ml against several microorganisms in a selective way. The ethanolic and ketonic extracts showed activity against entero-invasive E. coli and enterotoxic E. coli ATCC 25923, S. aureus ATCC 27853, P. aeuroginosa and C. krusei ATCC 6258. The aqueous extract was devoid of activity against any of the tested microorganism at the used dose. None of the assessed extracts were active against C. albicans ATCC 90028.

Key words: Azadirachta indica, Neem, antimicrobiano.

INTRODUCCIÓN

Existe habitualmente en el mundo un amplio uso de preparaciones a base de hierbas e ingredientes activos de plantas medicinales para el cuidado de la salud. Esto es particularmente cierto en las áreas rurales de los países asiáticos, donde la medicina herbaria es en muchos casos el único procedimiento de elección para el tratamiento de las dolencias, humanas. Con relación a esto, la Azadirachta indica A. Juss (Neem) es una de las plantas más utilizadas; en la India está considerada popularmente como una panacea desde hace más de 5.000 años. Sus propiedades  han sido corroboradas por la ciencia actual. Se saca provecho de todas las partes del árbol, principalmente tiene muchas aplicaciones en la medicina ayurvédica, sobre todo para heridas, lesiones y problemas en la piel, entre otras; el aceite que se obtiene del prensado de las semillas se utiliza contra la mosca de la fruta, actuando como insecticida y antiséptico; la corteza y las hojas son altamente efectivas para prevenir enfermedades dentarias, tales como gingivitis y las caries (1).

El aceite de Neem es utilizado en la agricultura biológica por ser biodegradable y no tóxico; se cree que podría sustituir a los insecticidas petroquímicos. Es muy activo contra los insectos fitófagos e inactivo contra abejas y fauna auxiliar. El principal componente insecticida es la azadirachtina (2). Es repelente de insectos, antifúngico,antibacterial, antiinflamatorio, antipirético, analgésico, estimulante del sistema inmunológico, antihelmíntico, antiemético, antitumoral, antiulceroso, antimalárico, antifertilidad, antiviral, hepatoprotector, antioxidante, hipoglicemiante y diurético. En su acción interna no elimina la flora intestinal beneficiosa y no tiene efectos secundarios. Fácilmente previene y elimina la Candida y el herpes. Se ha probado su eficacia en el tratamiento de la úlcera de estómago. Sus componentes antihistamínicos y antibacterianos reducen la inflamación y destruyen las bacterias que la causan. En el sistema cardiovascular actúa reduciendo la presión sanguínea, el colesterol y las irregularidades cardíacas. Otra de las propiedades que presenta el Neem, es que puede ser la solución para reforestar terrenos erosionados o desérticos, a causa de que crece en forma óptima en las zonas cálidas y bajas, en suelos pobres en nutrientes, desde el nivel del mar hasta más o menos los 900 metros de altura. Entre los principales compuestos bioactivos del Neem tenemos los siguientes: nimbidina, nimbidato de sodio, nimbolida, gedunina, azadirachtina, ácido gálico, margolona y polisacáridos,entre otros (3).

Igualmente hay estudios sobre la relación que existe entre la actividad biológica y la composición química de la planta, como se refiere en los siguientes trabajos: se ha demostrado la propiedad moluscicida de Azadirachta indica A .Juss (Neem) en lombrices de tierra (Lymnaea acuminata y Indoplanosbis exustus), que son las responsables de producir la fascioliasis en el ganado vacuno (4). Así mismo, se ha verificado que el extracto hexanoico de las semillas de Neem produce la abolición del embarazo en post-implantación en roedores y primates, dando como resultado que la fracción activa pura de la semilla de Neem puede ser utilizada para la contracepción (5). Se demostró el efecto de antifertilidad por administración intrauterina del aceite de Neem en monos y ratas (6). Se realizaron ensayos que demostraron que el extracto acuoso de Melia azedarach, especie vegetal de la misma familia del Neem, tiene un efecto tripanostático, pero no tripanocida,sobre Trypanosoma cruzi en cultivos in vitro, impidiendo su crecimiento normal (7). La administración por vía oral en ratones del extracto de las hojas y del aceite de Azadirachta indica A. Juss (Neem), tenía efecto analgésico (8). Se demostró el efecto inhibitorio de una fracción del aceite de Neem (NIM-76) en el crecimiento de ciertos patógenos tales con Esche richia coli, Salmonella typhi, Shigella dysenteroides, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus y Candida albicans; además,esta fracción presentó actividad espermaticida (9).

El objetivo del presente trabajo es evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos y orgánicos de las hojas de la planta en estudio,empleando el método de difusión en agar; y comprobar la acción que pueden tener los principios activos de esta planta contra una serie de microorganismos patógenos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal: La especie vegetal Azadirachta indica A.Juss (Neem) fue recolectada en la avenida Lara con calle 8 de la ciudad de Barquisimeto, estado Lara. Luego fue llevada al Herbario «Dr.Luis Ruiz Terán », Mérida-Farmacia (MERF) de la Facultad de Farmacia, Universidad de Los Andes, para ser identificada por el profesor Pablo Meléndez, con un voucher depositado bajo el N ° DB 001. Posteriormente,las partes aéreas de la especie se secaron atemperatura ambiente, se molieron hasta pulverización en un mortero de porcelana y se almacenaron en frascos de vidrio a temperatura ambiente, hasta la obtención de los extractos acuosos, etanólicos y cetónicos. 

Obtención de los extractos: Para la preparación de los distintos extractos se pesaron aproximadamente 5 g de las partes aéreas secas y molidas, luego fueron extraídos por separado; con etanol de 95%, acetona de 98% y agua mediante maceración a temperatura ambiente en frascos devidrio de 250 ml durante períodos de 24, 48, 72 y 96 horas; y en agua a temperatura a punto de ebullición durante 2 minutos; luego se filtraron al vacío. En el caso de los solventes orgánicos,los filtrados obtenidos se sometieron a un proceso de concentración hasta su sequedad en un rotavapor modelo Büchi –water bath B-480 a presión reducida por debajo de 45 °C. Para la preparación de los distintos patrones de las muestras extraídas con solventes orgánicos, se pesaron 0,02 g de la muestra concentrada seca y se diluyó con 1 ml agua destilada y con 1 ml etanol por separado. Esta concentración es equivalente a 0.1 mg de la dosis utilizada de los antibióticos, la cual fue empleada para evaluar la actividad contra los diferentes microorganismos. 

Evaluación de la actividad antimicrobiana: Los microorganismos de ensayo seleccionados (Tabla 1) fueron: Escherichia coli enteroinvasiva, Escherichia coli enterotóxica, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, del laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Farmacia, Universidad de Los Andes; Sthaphylococcus aureus ATCC 25923, del laboratorio de Vacunas del Departamento de Microbiología. Para la actividad antifúngica se utilizó Candida albicans ATCC 90028 y Candida krusie, ATCC 6258, del Laboratorio de Micología del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia, Universidad de Los Andes.

Preparación de inóculo bacteriano: Las bacterias de ensayo se mantuvieron en agar soya tripticasa, en cuña a 4 ºC. Para la prueba fueron activadas, sembrándolas en 1 ml de caldo soya tripticasa estéril e incubándolos a 30 ºC durante 24 horas. Luego se procedió a mezclar el caldo con 2 ml de agar soya tripticasa temperado a 45 º C y vertido en una cápsula de petri que contenía una capa de agar soya tripticasa solidificado. Se dejó secar por 20 minutos. Para las levaduras de ensayo, se mantuvieron en agar papa dextrosa en cuña a 4 ºC. Para la prueba fueron activadas, sembrándolas en 1 ml de caldo dextrosa saboraud estéril e incubándolos a 30 ºC durante 48 horas. Luego se procedió a mezclar el caldo con 2 ml de agar papa dextrosa temperado a 45 ºC y vertido en una cápsula de petri que contenía una capa de agar papa dextrosa solidificado. Luego se dejó secar por 20 minutos.

Ensayo microbiológico: Para esta técnica se utilizaron placas de petri de 10 cm de diámetro, con 10 ml de agar soya tripticasa en el caso de la bacteria, o de agar papa dextrosa en el caso de la levadura. Una vez solidificado, se inoculó en la superficie del agar 3 ml del inóculo ajustado a emplear, luego se colocó en la superficie del agar inoculado, con una micropipeta automática 5 ml de cada uno de los extractos y los distintos controles negativos (agua destilada, etanol al 95% y acetona al 98%), según el caso, utilizando una cuadrícula que sirvió de guía para ubicar por números las muestras en estudio. Posteriormente,los medios de cultivos inoculados se dejaron en incubación durante 24 horas a 30 ºC, realizándose las lecturas de los halos de inhibición a las 24 horas. Todos los ensayos se realizaron por duplicado.

Tabla 1
Controles positivos de susceptibilidad antimicrobiana
de los microorganismos

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos, etanólicos y cetónicos, muestran que Azadirachta indica A. Juss (Neem) presenta actividad antimicrobiana y antifúngica selectivamente sobre los microorganismos ensayados. 

En la Tabla 2 se expresan los resultados obtenidos en la valoración de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos, etanólico y cetónico. Las diluciones 0.02g/ml del extracto puro etanólico y el cetónico mostraron actividad antimicrobiana contra las bacterias (Escherichia coli enteroinvasiva, Escherichia coli enterotoxica, Pseudomonas aureoginosa, Staphylococcus aureus,). Así mismo, se observó actividad antifúngica contra la levadura Candida krusei. Ninguno de los extractos mostró actividad contra la Candida albicans debido a la baja concentración de principio activo presente en los distintos extractos. Los extractos acuosos puros (0.02g/ml)a temperatura ambiente y a temperatura de punto de ebullición (96 ºC) no mostraron actividad antibacteriana y antifúngica. Presumimos que corresponda a que los principios activos de la planta se encuentran muy diluidos y por ello no ejercen ningún tipo de acción sobre los distintos microorganismos estudiados, o puede ser que a 96 ºC los principios activos de la hojas se hayan degradado.

La dosis utilizada para los extractos acuosos y orgánicos de la planta fue de 0.1mg, la cual mostró efectividad y se correlaciona con la dosis empleada de los antibióticos (0.1 mg), lo que nos permite inferir que la dosis del extracto es equivalente en actividad antimicrobiana al antibiótico. La variable del tiempo (24, 48, 72 y 96 horas) no presentó ninguna diferencia de actividad en relación a la extracción de los principios activos de las hojas. La mayor actividad antimicrobiana fue presentada por el extracto etanólico y cetónico, debido a que las sustancias biológicamente activas que posee dicha planta, son mejor extraídas con etanol y acetona que con agua. Los resultados obtenidos de esta investigación se correlacionaron con estudios realizados por SaiRam (2000), donde los extractos de la semilla del Neem mostraron actividad antimicrobiana contra E. coli, S. Typhi, S. dysenteroides, P. vulgaris, P. aeruginosa, S. faecalis, S. aureus y C. utilis. Así mismo, podemos señalar que en la bibliografía consultada, hasta los actuales momentos no se había reportado la actividad antifúngica del Neem contra la C. krusei.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

1. El etanol de 95% y la acetona de 98% son los solventes más apropiados para extraer los principios activos
de las partes aéreas de esta planta.

2. Los extractos etanólicos y cetónicos presentaron actividad antimicrobiana contra Escherichia coli enterotóxica
y enteroinvasiva, Pseudomona aeruginosa, Staphyloccus aureus y Candida krusei .

3. Los extractos acuosos y orgánicos no mostraron actividad contra la levadura Candida albicans.

Entre las recomendaciones podemos mencionar: 

1. Realizar extracciones con cantidades mayores (1, 10, 30 gramos) de las hojas y comprobar si muestran actividad antimicrobiana a partir de los extractos acuosos.

2. Extraer los principios activos del fruto y evaluar actividad antimicrobiana.

3. Concentrar los extractos acuosos,y a que se encuentran muy diluidos.

4. Formular supositorios para infecciones vaginales por presentar actividad contra Candida krusei.

5. Formular un gel para el acné, por presentar actividad contra Staphylococcus aureus.

6. Formular un antiséptico y/o desinfectante por presentar actividad contra Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa.

AGRADECIMIENTO

Al profesor Pablo Meléndez por contribuir con la identificación botánica de la especie; al laboratorio de Investigación de Medicamentos Orgánicos; a la profesora Sarelie Carrero, del laboratorio de Micología por donar las levaduras Candida albicans y Candida krusei; al profesor León Hernández, del Laboratorio de Vacunas, por donar las cepas de S. aureus, al Instituto de Investigaciones de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Sección de Biotecnología de la Universidad de Los Andes, especialmente a la farmacéutico Enma Andara por haber colaborado con la realización de esta investigación.

      TA: Temperatura ambiente; ET Etanol al 95%; AC: Acetona, A: Agua.
      AS: Ampicilina, Sulbactam; S: Sultamicilina; C: Cefoperazona; F: Fluconazol; K: Ketoconazol.
   +: Ausencia de crecimiento microbiano (Halo de inhibición).
   -: Presencia de crecimiento (No hay halo de inhibición y existía crecimiento microbiano similar a los controles  negativos).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Keshava P. El árbol de Neem, diversidad de usos. En: Taller Internacional «El árbol Nim en Venezuela ». Coro, Venezuela, 1994, p. 59-62.        [ Links ]

2. Rondón A. Efecto insecticida de los aceites esenciales extraídos de la semilla del árbol nim (Azadirachta indica) sobre gorgojos adultos del género Sitophilus spp. Proyecto de Investigación en Química Aplicada II. Caracas: Universidad Pedagógica Experimental Libertador; 1997.        [ Links ]

3. Biswas K.Chattopadhyay I, Banerjee R, Bandyopadhyay U. Biological activities and medicinal properties of neem (Azadirachta indica). Current Sciencie. 2002; (82): 1336-1345.        [ Links ]

4. Singh K, Singh A, Singh D. Molluscicidad activity of neem (Azadirachta indica A.Juss). J. Ethnopharmaco logy.1996; (52): 35-40.        [ Links ]

5. Garg S, Talwar G, Upadhayay S. Inmunocontraceptive activity guided fractionation and characterization of active constituents of neem (Azadirachta indica), seed extracts. J. Ethnopharmacology.1998; (60): 235-246.        [ Links ]

6.Khosla P. Bhanwra S, Singh J, Srivastava R. Anticonceptive activity of Azadirachta indica (neem) in rats. Indian J. Pharmacology. 2000; (32): 372-374.        [ Links ]

7. Dugarte Y. Efecto de un extracto de Melia azedarach sobre el Trypanosoma cruzi. Tesis de grado para optar al título de Licenciado en Biología. Mérida,Venezuela: Universidad de Los Andes; 1999.         [ Links ]

8. Mukherjee S, Garg S, Talwar G. Early post implantation contraceptive effects of a purified fraction of neem (Azadirachta indica)seed, give orally in rats: possible mechanisms involved. J. Ethnopharmacology.1999; (67): 287-296.        [ Links ]

9. SaiRam M,et al. Anti-microbial of a new vaginal contraceptive NIM-76 from neem oil (Azadirachta indica). J. Ethnopharmacology. 2000; (71): 377-382.        [ Links ]