Composición del aceite esencial de Origanum majorana L. extraído por diferentes técnicas y su actividad biológica

Chemical composition of essential oil from Origanum majorana L. extracted by different techniques and its biological activity

M. Meza¹, N. González de C² y A. Usubillaga³

1Universidad Nacional Experimental del Táchira, Decanato de Investigación, Venezuela.

²Laboratorio de Fitoquímica, UNET. Venezuela.

³Universidad de los Andes, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Venezuela.

Autor de correspondencia e-mail: mariameza74@hotmail.com; nelida@reaccium.ve; usubillaga@intercable.net.ve

Resumen

Origanum majorana es una Labiada muy utilizada en gastronomía y medicina natural. Es una herbácea de hojas pequeñas y flores de color blanco o rosado. Las plantas de Mejorana fueron colectadas de los estados Táchira y Mérida. Para la obtención del aceite esencial se empleó el método de hidrodestilación y el de arrastre con vapor. El análisis de los aceites esenciales se realizó por cromatografía de gases con detector de masas. La identificación de los componentes se hizo mediante la comparación de los espectros de masas con los de la base de datos Wiley. Se determinó que la fracción oxigenada del aceite esencial de Mejorana está constituida principalmente por alcoholes, independientemente del origen. La hidrodestilación permite obtener aceites con mayor proporción de compuestos oxigenados (60,82 y 43,77%) que el arrastre con vapor (27%); además, es un procedimiento sencillo, reproducible, económico y rápido. Aceites con gran proporción de ésteres como el proveniente del estado Táchira son de potencial uso en perfumería. La inhibición del crecimiento que produce el aceite esencial sobre los microorganismos Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas sp. le confiere acción bactericida.

Palabras clave: Aceite esencial, Origanum majorana, actividad biológica.

Abstract

Origanum Majorana (Labiateaea) is used in gastronomy and natural medicine. It is a herb with small leaves and white or pink flowers. Mejorana plants were collected from Tachira and Merida states. Hydro distillation and steam distillation methods were used to obtain the essential oil. The analysis was done by CG-MS and oil components were identified by computer comparison of their mass spectra with those of Wiley data base. The oxygenated fraction of Mejorana's essential oil contains alcohols no matter its geographical origin. To obtain oils with a greater proportion of oxygenated compounds (60.82% and 43.77%) it is better to use the hydro distillation method than steam distillation method (27%), because it is cheaper, simpler and faster. Oils containing lots of esters like those obtained from Tachira's Mejorana plants have a potential use in cosmetics. Besides, this type of oil has bactericidal activity; it inhibits the growth of micro organisms such as Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and Pseudomonas sp.

Key words: Origanum majorana, essential oil, biological activity.

Recibido el 5-3-2007 Aceptado el 18-6-2007

Introducción

Origanum majorana L. (Labiada) comúnmente conocida en Venezuela como Mejorana, es una herbácea de 15 a 50 cm de alto con olor característico, con hojas pequeñas, redondas y blanquecinas las flores son pequeñas de color blanco o rosado, las semillas son pequeñas oblongas y de color pardo oscuro (1). Los tallos y hojas contienen taninos, pentosas y minerales, pero el producto mas importante y fragante es la esencia de color amarillento o verdoso cuyo rendimiento oscila entre 0,30 y 0.40% de la planta fresca. Esta esencia no es tóxica (2), contiene cantidades variables de terpenos principalmente terpineno, origanol (d-a-terpineol), sabineno y pequeñas cantidades de sesquiterpenos (1). Se utiliza en aromaterapia; como antiviral, bactericida, para combatir enfermedades de la piel, rubefaciente (3); en perfumería es base para la elaboración de fragancias, jabones y detergentes; para uso gourmet en la industria alimenticia y como base en la elaboración de Vermut (4).

Estudios previos realizados con el aceite esencial de O. majorana de Turquía (5) permitieron determinar el sabineno como principal componente, mientras que el originario de Irán (6) presentó carvacrol como el constituyente más abundante.

Los aceites esenciales extraídos de las plantas aromáticas son una fuente de ingresos importantes para el desarrollo de los pueblos alejados de las grandes ciudades. Venezuela cuenta con abundancia de plantas aromáticas y medicinales nativas, que representan el 90%, de las plantas aromáticas, en tanto que un 10% son plantas introducidas por los españoles en la época de la conquista; razón por la cual a nivel mundial Venezuela se considera como el cuarto país mas rico en especies aromáticas, después de Brasil, Colombia y Perú; menos del 5% de la totalidad de éstas han sido estudiadas. La gran extensión territorial y las bondades del clima permiten el cultivo de plantas exóticas, un ejemplo lo tenemos en la Mejorana oriunda del Oriente Medio y Arabia. Extendida por países mediterráneos y cultivada en Europa, norte de África y en América, la Mejorana crece en los climas fríos de los Estados Andinos: Táchira, Mérida y Trujillo (7).

En San Vicente de La Revancha del estado Táchira y en Bailadores del estado Mérida, se encuentran cultivos importantes de esta planta que son vendidas en mercados populares para uso culinario y medicinal como: antiespasmódico, hipotensor, para los dolores de cabeza, insomnio, reumatismo, tos, vómito y nerviosismo entre otros.

La composición de los aceites esenciales de una especie varía según el lugar y tiempo de recolección, ya que pequeños cambios genéticos y de habitat modifican cualitativa y cuantitativamente su composición (8).

Estudios realizados con otras especies tales como Cymbopogon citratus (9); Tagetes minuta (10) Melaleuca leucadendron (11), Citrus lemon (12) e Hyptis umbrosa (13) confirman que la composición de los aceites esenciales de una misma especie cambian según su hábitat, manejo agronómico y los procedimientos empleados para la extracción y análisis.

Los aceites esenciales de O. majorana mostraron composición diferente cuando se extrajeron por distintos métodos de extracción y cuando las especies se colectaron en diferentes localidades (14, 15,16)

Este objetivo de este trabajo fue comparar la composición del aceite esencial del Oríganum majorana (Mejorana) de los estados Mérida y Táchira, y determinar la actividad biológica que ejercen los aceites esenciales sobre algunas bacterias como: Staphylococus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas sp.

Materiales y métodos

Muestreo

Se emplearon plantas completas de O. majorana colectadas en el Jardín de Plantas Medicinales de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de los Andes, Mérida y en San Vicente de La Revancha, pueblo ubicado al sur del estado Táchira.

Muestras testigo 1JM-1 y 1JM-2 de las especies fueron almacenadas en el herbario de la Universidad Nacional Experimental del Táchira.

Extracción de aceite

El aceite esencial obtenido de las plantas con flores y colectados en el estado Mérida se extrajo por hidrodestilación durante 2 horas y 30 minutos utilizando una trampa de Clevenger. La extracción del aceite esencial de las plantas provenientes del estado Táchira se realizó mediante 2 métodos: por arrastre con vapor de agua durante 2 horas y 45 min y por hidrodestilación durante el mismo tiempo.

Separación cromatográfica

Para la separación cromatográfica del aceite esencial se mezclaron 20 µL del aceite esencial de O. majorana con 1 mL de nheptano y luego se inyectó 1 µL de la solución en un cromatógrafo de gases con detector selectivo de masas GC-MS 5973, marca Hewlett PACKARD 6890 GC System versión A.03.02, equipado con una columna HP5 (30 m x 0.25 cm x 0.25 µm de espesor de película de 5% fenil metil silicona), y se utilizó helio ultra puro como gas portador. Se utilizó un reparto de 100:1.

El programa de temperatura se inició a 60°C, se incrementó a 200°C a razón de 4°C/min, manteniéndose por 1 min a esta temperatura, luego se aumentó la temperatura hasta 280°C a razón de 10°C/min y se dejó por 20.

Los componentes del aceite esencial fueron identificados por comparación computarizada de los espectros de masas de cada uno de los compuestos con los de la librería Wiley MS Data y también determinadas según sus índices de retención (IR).

Actividad biológica

La actividad biológica se determinó usando las técnicas de difusión y dilución en agar de Kirby-Bauer (17) y fue evaluada mediante la medición de los halos de inhibición e inhibición total del crecimiento bacterial, contra bacterias gram-positivas como Staphylococcus aureus y gram-negativas como Escherichia coli y Pseudomonas sp. (18)

Se utilizaron concentraciones del aceite esencial de 100, 50 y 25% (v/v), sobre cultivos de bacterias durante 24 horas en agar de soya Triptona (TSA) (17) para todas las pruebas. Los medios utilizados fueron agar Mueller-Hinton y Mueller Hinton Médium y se usó solución isotónica de NaCl al 0,85 % para lavar las bacterias.

La siembra de las bacterias se hizo con un hisopo esterilizado para colocarlas en las cápsulas de Petri en una concentración de 10⁷ ufc/ml.

El método de dilución se aplicó para el aceite esencial en concentraciones del 50 y 100%, Para la concentración del 50% se utilizó 0,50 mLl Tween 80 y 0,50 mL de aceite esencial de Mejorana, por último se le agregaron 16 mL de agar, con esta solución se prepararon las cápsulas de Petri y se colocaron durante 5 minutos en la nevera a 7°C y finalmente se llevaron a la incubadora por 24 horas a una temperatura de 37,5°C para observar su crecimiento y evaluar los halos de inhibición. Este procedimiento se hizo por triplicado para cada una de las bacterias utilizadas. Se prepararon 3 placas más, sin el aceite esencial y con cada una de las bacterias involucradas que permitió verificar la efectividad del medio utilizado en este caso el Caldo y el Agar Mueller Hinton.

El método por difusión fue usado para el aceite esencial en concentración 25% (v/v) con agar Mueller Hinton, inoculado con cultivos jóvenes de bacterias de 10⁷ ufc/ml.

Se prepararon nueve cápsulas de Petri con agar solidificado y a cada una de ellas se le hicieron perforaciones de 3 mm de diámetro por placa, y se le añadieron 0,05 mL de aceite esencial diluido al 25% (0,75 mL de tween 80 y 0,25 mL de aceite esencial de Mejorana), luego las placas se incubaron a 37,5°C por 24 horas para medir con un vernier el halo de inhibición del crecimiento bacterial.

El Tween 80 es un medio inerte y fue usado para diluir el aceite esencial en concentraciones de 50 y 25% (v/v).

Resultados y discusión

La cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (CG/MS), permitió la separación, identificación y comparación de la calidad de los aceites estudiados según su origen y método de extracción (cuadro 1). Los constituyentes están ordenados según su índice de retención (IR), indicando además su porcentaje de área (%A).

Cuadro 1. Comparación de los aceites esenciales de O. majorana de los estados Mérida y Táchira.

IR: Índice de Retención, AEPH EM: Aceite esencial del Estado Mérida extraído por hidrodestilación.

AEPH ET: Aceite esencial del Estado Táchira extraído por hidrodestilación. AEPACV ET: Aceite esencial del Estado Táchira extraído por arrastre con vapor.

CG-MS: Cromatografía de gases masas

En el cuadro 1 se muestra que el mayor número de compuestos identificados (26) se logró por hidrodestilación AEPHEM, seguido por AEPHET (25) y AEPACV ET (14); los componentes en mayor proporción en los aceites esenciales obtenidos por AEPHEM, AEPHET y AEPACVET fueron: 3 ciclo hexen-1-ol (42%, 29% y 0% respectivamente); g-terpineno: 11; 14 y 3% respectivamente.

El sesquiterpeno trans sabineno hidrato (50%) y el alcohol terpineol4 (20%) solo se detectaron en AEPACVET. Estos resultados concuerdan con investigaciones previas (6, 7, 19,20) sobre la aplicación y resultados de técnicas de extracción de aceites esenciales de especies de orégano de diferente origen.

Con el procedimiento de AEPHET se obtuvo el mayor porcentaje de área identificada (98,44%) seguida de AEPACVET (96,46%) y AEPHEM (91.99%). Así mismo, la técnica en AEPACVET permitió detectar selectivamente el terpeno â felandreno (1,34%) y el alcohol terpineol -4 (20,49%).

A diferencia de los aceites esenciales de O. majorana estudiados en Turquía (5) estos aceites no contienen carvacrol compuesto no deseado en los aceites esenciales.

En el cuadro 2 se reseñan los compuestos de la familia de hidrocarburos terpénicos presentes en los aceites esenciales investigados.

Cuadro 2. Hidrocarburos terpénicos del aceite esencial de O. majorana de los Estados Mérida y Táchira.

IR: índice de retención, AEPHEM: Aceite esencial del Estado Mérida extraído por hidrodestilación,

AEPH ET: Aceite esencial del Estado Táchira extraído por hidrodestilación. AEPACV ET: Aceite esencial del Estado Táchira extraído por arrastre con vapor

CG-MS: Cromatografía de gases masas

A pesar de que la hidrodestilación permite extraer el mayor número de compuestos AEPHET (15) y AEPHEM (14), se obtuvo el mayor porcentaje de área con AEPACVET (69,66%) por arrastre con vapor. Mediante este procedimiento se detectan pocos terpenos de bajo peso molecular, frente a una abundancia de sesquiterpenos en AEPACVET (66,69%). En estudios previos (13) se ha reportado diferente proporción de terpenos livianos con respecto a la fracción pesada de sesquiterpenos en aceites esenciales extraídos por arrastre con vapor.

En el cuadro 3 se presentan los compuestos que forman la fracción oxigenada de los aceites extraídos por AEPHEM, AEPHET y AEPACVET: (60,82%; 43,77% y 27% respectivamente).

Cuadro 3. Componentes oxigenados del aceite esencial de O. majorana.

IR: Índice de retención, AEPH EM: Aceite esencial del Estado Mérida extraído por hidrodestilación,

AEPH ET: Aceite esencial del Estado Táchira extraído por hidrodestilación. AEPACV ET: Aceite esencial del Estado Táchira extraído por arrastre con vapor.

CG-MS: Cromatografía de gases masas

El procedimiento de extracción por arrastre con vapor no favorece el número de compuestos identificados (3) ni el porcentaje de área (27%); sin embargo, extrae selectivamente al alcohol terpineol4 (20,49%). El éster linalil acetato compuesto muy fragante usado en perfumería solo se detectó en AEPHET (2,83%).

La sumatoria de ésteres resultó mayor en el aceite proveniente del estado Táchira (3,15%) que en el del estado Mérida (0,84%). Esa diferencia de contenido de ésteres es empleada como criterio para clasificar la calidad de los aceites esenciales (21) independiente del origen del aceite y del proceso de extracción. La fracción oxigenada es abundante en alcoholes AEPHEM (60,82%), AEPHET (43,77%) y AEPACVET (27,00%). Es importante destacar que por AEPACVET no se detectaron ésteres.

Como se observa en el cuadro 4 la actividad del aceite esencial estudiado es moderada cuando se usó el método de difusión. Escherichia coli presentó el mayor diámetro de inhibición (23mm) seguido por Staphylococcus aureus (16mm) y Pseudomonas sp. (14 mm).

Cuadro 4. Actividad biológica del aceite esencial de O. majorana por el método de difusión.

La actividad biológica del aceite esencial de mejorana frente a E. coli, S. aures y Pseudomona sp. podría atribuirse a la presencia de hidrocarburos terpénicos (22).

En los resultados se observó la ausencia de crecimiento bacteriano al aplicar la dilución en agar, ya que el método de dilución del aceite esencial favorece la entrada del aceite al interior de los microorganismos inhibiendo completamente su crecimiento (23).

Conclusiones

La composición química de los aceites esenciales de O. majorana de diferente origen y extraídos por hidrodestilación y arrastre con vapor difieren en algunos compuestos. La hidrodestilación permite obtener aceites con gran proporción de compuestos oxigenados (60,82 y 43,77%); además, es un procedimiento sencillo, reproducible, económico y rápido. Aceites con gran proporción de ésteres como el proveniente del estado Táchira son de potencial uso en perfumería (21,24).

La actividad biológica demuestra que el aceite de O. majorana tiene acción bactericida sobre microorganismos gram positivos (S. aureus) y gram negativos (E. coli y Pseudomonas sp.)

Literatura citada

1. Font Quer, P. 1973. Plantas medicinales, El Dioscorides Renovado. Barcelona. Editorial Labor. España. p. 167         [ Links ]

2. Buchbauer, G. 1993. Biological Effects of Fragrances and Essential Oils. Perfum Flav 21 ( 3): 31-36.         [ Links ]

3. Bandoni, A. 2000. Los recursos aromáticos en Latinoamérica. Edit. de la Universidad Nacional de la Plata. (U.N.L.P.) Argentina. p. 156, 285-290.         [ Links ]

4. Lawless, J. 1992. The Encyclopedia of essential oils. Published in USA, by Elements books. Inc. Great Britain. 126-27 p.         [ Links ]

5. Baser, K.H.C., Kirimer, J. 1993. Composition of the Essential Oil of Origanum majorana L from Turkey. J Essential Oil Res 5: 577-579.        [ Links ]

6. Barazandeh, M.M. 2001. Essential Oil Composition of Origanum majorana L from Iran. J Essent Oil Res 13: 76-77.         [ Links ]

7. Albornoz, A.R. 1995. Medicina tradicional herbaria. Guía de fitoterapia. Editorial Instituto Fármaco Terápico - Latino S.A. Caracas. 45 p.         [ Links ]

8. Dominguez, X. 1973. Métodos de Investigación Fitoquímica. Editorial Limusa, México p. 229-239.         [ Links ]

9. Dhar, R.S., Dhar, H.K. 1997. Ontogenetic Variation in leaf length, oil and herbage yield in five genotypes of Cymbopogon citrates (Jones). Indian Perfumer 41: 85-90.        [ Links ]

10. Chalchat, J., Garry, R., Muhayimana, J. 1995. Essential oil of Tagetes minuta from Ruanda and France: chemical composition acording harvesting, location, growth stage and part extracted. J Essent Oil Res 7: 375-386.        [ Links ]

11. González de, C.N., de Ojeda, R.G., Prieto, A., Crescente, O. 1998. Phytoconstituents and antimicrobial activity of Melaleuca leucadendron leaf essential oil from Venezuela. Ciencia 6 (2): 123-128.        [ Links ]

12. Ojeda de, R., de González, C.N. 1998. Composition of Venezuelan Lemon essential oil Citrus lemon. Rev de la Fac Agron (LUZ) 15: 343-349.        [ Links ]

13. Quintero, A., de González, C.N., Stachenko, E. 2004. Aceite esencial de las hojas de Hyptis umbrosa Salzm: extraído por diferentes técnicas. Acta Científica Venezolana 55: 81-187.         [ Links ]

14. Muñoz, F. 1996. Plantas Medicinales y aromáticas. Edit. Mundi Prensa  Madrid. 224-227 p.         [ Links ]

15. Novak, J., Pank, F., Bluthner, W., Vender, C., Van Niekerk, L., Junghan, W., Chlodwig, F. 2004. Determination of growing location of marjoram (Origanum majorana L) samples by comparison of essential oil profiles. Flav and Fragr 19: 263-267.        [ Links ]

16. Baranauskiené, R., Venskutonis, P.R., Demyttenaere, J.C.R. 2005. Sensory and instrumental evaluation of sweet marjoram (O majorana L) aroma. Flav and Fragr 20: 492-500.         [ Links ]

17. Sánchez, M.P. 1986. Manual de Procedimientos en Bacteriología Clínica. 1ra. Edición. Editorial Presencia. Ltda. Bogotá. 143 p.         [ Links ]

18. Rondón, M., Velasco, J., Morales, A., Rojas, J., Carmona, J., Gualteri, M., Hernández, V. 2005. Composition and antibacterial activity of the essential oil of Salvia leucantha Cav, cultivated in Venezuela Andes. Revista Latinoamericana de Química 33 (1): 40-44.         [ Links ]

19. Novak, J., Langebehn, J., Pank, F., Franz, C. 2002. Essential oil compounds in historical sample of majorana (Origanum majorana L, Lamiaceae). J Flav and Fragr 17: 175-180.         [ Links ]

20. Ravid, U., N. Dudai  y  E. Lewinsohn. 2001. Thujane monoterpenes in Oreganum species. Abstracts of World Conference on Medicinal and Aromatic Plant, Hungary. P. 45         [ Links ]

21. Gaydau, E., Randriamiharizoa, R., Bianchi, J., Llinas, J. 1998. Multidimensional data analysis of Essential Oil. Aplication to Ylang Ylang (Cananga odorata Hook fil. Et Thomsom, form genuina) grades classification. J Agric Food Chem 36: 574-579.        [ Links ]

22. Balchin, M.L., Deans, S.G., Eaglesham, E. 1998. Relactionship between Bioactivity and Chemical Composition of Commercial Essential Oil. J Flav Fragr 13: 98-104.        [ Links ]

23. Chao, S.C., Young, D.G. 2000. Screening for Inhibitory Activity of Essential Oils on Selected Bacteria, Fungi and Viruses. J Essent Oil Res 12: 639-649.        [ Links ]24. Staschenko, E., Quiroz, N., Martinez, J. 1996. HRGC/ FID / NPD and HRGC/MSD Study of Colombian Ylang-Ylang (Cananga odorata) oils obtained by different extraction techniques. J Hihg Resol Chromatogr 19: 353-358.         [ Links ]