Caracterización fenotípica de especies de Malassezia en piel sana de población estudiantil universitaria. 

Sofía Rodríguez-Valero, Luz Mila Mesa, Evelyn Gonzalez-Morán, María Lucía Delmonte, Sandra Robertiz, Alejandro Valero. 

Cátedra de Micología, Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela. Correo electrónico: sofiavalero@hotmail.com 

Resumen. Las levaduras del género Malassezia forman parte de la piel normal del hombre y otros vertebrados. La reciente descripción de nuevas especies para el género ha incentivado interés en el estudio de las mismas en diversos países, por lo tanto, es importante realizar investigaciones tendentes a obtener datos epidemiológicos de las especies de Malassezia en países tropicales como Venezuela, en el cual este tipo de trabajo no se ha reportado. El estudio se realizó en piel sana de población estudiantil universitaria. Las muestras fueron tomadas de diferentes áreas del cuerpo e inoculadas en el medio modificado de Dixon y Sabouraud Dextrosa Agar a 32°C. La identificación se realizó siguiendo las claves para la identificación de especies descrita por Gueho y colaboradores y el test de difusión en tween propuesto por Guillot y colaboradores. En esta investigación la especie aislada fue M. furfur, correspondiendo el mayor porcentaje de positividad al grupo etáreo de 16 a 20 años (66,7%). Las localizaciones anatómicas predominantes fueron espalda y pecho. (33,3 y 26,6%) Según las pruebas estadísticas aplicadas, Test exacto de Fisher’s y Chi cuadrado, no se encontró diferencias significativas entre los grupos evaluados. Cabe destacar la importancia de continuar las investigaciones en otros grupos etarios, para establecer cuales son las especies prevalentes en nuestra región y evaluar su potencial patógeno. 

Palabras clave:  Levaduras lipofílicas, Malassezia, identificación, caracterización fenotípica. 

Phenotypic characterization of species of Malassezia in healthy skin of an university student population.

Abstract. The yeasts of the Malassezia genus are part of the normal skin of man and other vertebrates. The description of new species for this genus has induced on their study in several countries. For this reason, is important to do research in order to get epidemiologic data about Malassezia species in tropical countries like Venezuela, where the new Malassezia species have not been reported This study was made on healthy skin of a university student population. The samples were taken from different body areas and inoculated in Dixon modified medium and Sabouraud dextrose agar medium e incubated at 32°C. The identification was achieved following the key of species described by Gueho et al. and the tween diffusion test proposed by Guillot et al. In this investigation the isolated specie was M. furfur, corresponding the major positive percentage to the age group from 16 to 20 years old (66.7%). The presence of Malassezia was predominant on shoulder and chest (33.3% and 26.6%). There were not found significant differences between the evaluated groups, as was demonstrated by the applied statistical tests, exact Fisher’s test and Chi square test. It is important to continue the investigations on other age groups, in order to establish the prevalent species in our region and evaluate their pathogenic potential. 

Key words:  Lipophylic yeast, Malassezia, identification, characterization, phenotypic. 

Recibido: 08-03-04. Aceptado: 07-07-05. 

INTRODUCCIÓN 

El género Malassezia representado por levaduras lipofílicas, es considerado como miembro de la microbiota de la piel del humano y otros vertebrados de sangre caliente (1-3). Sin embargo se ha relacionado con una variedad de patologías en el hombre que incluyen: pitiriasis versicolor, dermatitis seborreica, dermatitis atópica, foliculitis e infecciones sistémicas (4, 5). 

La taxonomía del género Malassezia ha sido muy controvertida desde su creación por Baillon en 1889. Hasta 1990, sólo 3 especies eran reconocidas: M. furfur (Robin) Baillon 1889, M. pachydermatis (Weidman) Dodge 1935 y M. sympodialis (Simmons) y Gueho 1990. Con el desarrollo de técnicas moleculares y la revisión de las características morfológicas ultraestructurales y fisiológicas, se han descrito nuevas especies: M. restricta Guého, Guillot y Midgley 1996; M. slooffiae, Guillot, Midgley y Guého 1996; M. globosa, Midgley, Guého y Guillot 1996; M. obtusa, Midgley, Guillot y Guého 1996 (6-10) Malassezia dermitis Sugita, Takashima, Nishikama, y Shinoda 2002 (11) y Malassezia japonica Sugita,Takashima, Kodama, Tsuboi y Nishikama, 2003 (12). 

Las especies de Malassezia a excepción de M. pachydermatis son lípido dependientes por lo cual requieren de ácidos grasos de cadenas largas para el crecimiento in vitro. 

Los métodos convencionales empleados para la identificación de las especies del género Malassezia se basan en el estudio macro- y micro morfológico, en la habilidad para utilizar diferentes Tweens (20, 40, 60 y 80) como fuente de lípidos en un medio simple y en las propiedades fisiológicas, tales como: presencia de catalasa y tolerancia de crecimiento a 37°C (6, 13). Otras pruebas de identificación incluyen técnicas moleculares. 

El objetivo de esta investigación es caracterizar fenotípicamente las especies de Malassezia y determinar su prevalencia en piel sana de una población estudiantil universitaria. La estandarización de técnicas de rutina, en los laboratorios de referencia de Micología, para la identificación de especies de Malassezia permitirá realizar un diagnóstico integral de las infecciones producidas por éstas. Cabe destacar la importancia de efectuar investigaciones epidemiológicas que permitan establecer el predominio de las especies de Malassezia en piel sana de la población venezolana. 

MATERIALES Y MÉTODOS 

Población 

De una población de 550 estudiantes de la Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia, Venezuela, se seleccionaron al azar el 10% de la población total formada por 56 estudiantes, femeninos y masculinos, sin lesiones en piel, en edades comprendidas entre 17 y 30 años. 

Recolección y procesamiento de las muestras 

Las muestras de piel de los individuos en estudio, se tomaron de cuero cabelludo, pabellón auricular, surco nasogeniano, pecho y espalda (1 de cada sitio), empleando el método de la impronta con cinta plástica transparente. Se examinaron microscópicamente con hidróxido de potasio y tinta parker azul, para visualizar las estructuras características de Malassezia. Los cultivos se realizaron en placas de Petri con el medio de Dixon agar y Sabouraud dextrosa agar (SDA), e incubaron a 32°C por 7 días. Las placas que no presentaron crecimiento característico de Malassezia se reportaron como negativas a los 14 días de incubación. 

Las colonias compatibles con Malassezia spp. se subcultivaron en Dixon agar y SDA, éste último para confirmar el carácter no lipofílico e identificar Malassezia pachydermatis. 

Identificación de los aislados 

Se realizó siguiendo las claves para la identificación de especies descrita por Gueho y col. (6), el test de difusión en tween propuesto por Guillot y col. (13), prueba de la catalasa y crecimiento a diferentes temperaturas (32, 37 y 40°C). El estudio macro- y micromorfológico se realizó en base a la consistencia, aspecto, color de las colonias y la forma y tamaño de las blastoconidias. Se efectuó tinción de Giemsa para la observación microscópica. 

Adicionalmente los aislados identificados como M. furfur se inocularon en el medio de Dixon modificado con glicina (14) para diferenciarlos de M. sympodialis. 

Análisis estadístico 

Se aplicó el Test exacto de Fisher y Chi cuadrado según correspondió (p < 0,05). 

RESULTADOS 

De las 280 muestras de piel sana que se analizaron por examen directo y cultivo, Malassezia spp. se evidenció en 90 muestras (32,1%) por análisis microscópico directo y se recuperó por cultivo en 30 (10,7%). 

Todos los aislados se identificaron como M. furfur con base en la asimilación de Tween (20, 40, 60 y 80) (Fig. 1), la prueba de catalasa positiva, el crecimiento a diferentes temperaturas (32, 37 y 40°C), la presencia de colonias mate, de color crema a amarillo, textura friable, topografía irregular con elevación central (Fig. 2) y la formación de blastoconidias de tamaño y forma variable (esféricas, cilíndricas u ovoides) (Fig. 3).

M. furfur se presentó en forma predominante en el grupo etareo de 16 a 20 años con un 66,7% (Tabla I). La distribución de M. furfur en diferentes sitios anatómicos, presentó un predominio en espalda (33,3%) y pecho (26,6%) (Tabla II).

TABLA I

Malassezia furfur EN PIEL SANA SEGÚN GRUPO ETAREO 

TABLA II

Malassezia furfur EN PIEL SANA SEGÚN LOCALIZACIÓN ANATÓMICA Y GRUPO ETÁREO 

            P> 0,05.    CC: Cuero cabelludo.    SN: Surco nasogeniano.    PA: Pabellón auricular.    PE: Pecho.    ESP: Espalda. 

            * Algunos pacientes presentaron la levadura en más de una localización anatómica. 

DISCUSIÓN 

Las levaduras lipofílicas del género Malassezia forman parte de la microbiota normal de la piel del hombre y otros vertebrados. La reciente descripción de nuevas especies para el género ha originado gran interés sobre aspectos epidemiológicos y de patogenicidad. En la presente investigación se analizaron 280 muestras de piel sana de 56 individuos, por examen directo y cultivo. Malassezia se evidenció en 90 muestras (32,1%) por análisis microscópico directo y se recuperó por cultivo en 30 (10,7%). 

Todos los aislados se identificaron como M. furfur, correspondiendo el mayor porcentaje de positividad al grupo etareo de 16 a 20 años (66,7%). El predominio de M. furfur en la población estudiada, difiere de trabajos realizados en otros países. Crespo y col. (15) en España reportaron a M. sympodialis como la especie más frecuente en piel sana (91,7%), seguida de M. restricta (63,9%) asociada con M. globosa. Datos obtenidos de un análisis molecular de Malassezia en sujetos sanos y enfermos realizados en Japón (16) sugieren que M. restricta (61%), M. globosa (44,4%), M. sympodialis (50%) y M. furfur (11,1%) son habitantes comunes de la piel sana; Gemmer y col. (17) empleando un método no invasivo para la detección molecular y diferenciación de especies de Malassezia, en la piel de humanos, reportaron a M. globosa y M. restricta como predominantes, no encontrando M. furfur. Nakabayashi y col. (18) identificaron especies de Malassezia de pacientes con pitiriasis versicolor, dermatitis seborreica, dermatitis atópica y sujetos sanos; en los pacientes con dermatitis seborreica que aislada M. furfur (21%), M. globosa (14%), M. sympodialis (7%) y M. slooffiae (4%) y en individuos sanos sólo M. restricta. 

Cabe destacar que en países tropicales como Venezuela, las condiciones climáticas (alta humedad relativa, elevadas temperaturas) favorecen el parasitismo por Malassezia (19) e inclusive, la herencia y el aseo personal varían con respecto a los países Europeos y Asiáticos, donde se ha observado una baja frecuencia en el aislamiento de M. furfur, en piel sana y enferma, hecho que podría estar influenciado por los factores arriba mencionados. Es de resaltar que existen reportes, en América sobre la prevalencia de M. furfur en piel sana; en general esta levadura puede ser recuperada de diferentes áreas del cuerpo, indicando que es flora normal de la piel (20-23). En Colombia Rincón y col. (24) reportan una prevalencia de M. furfur (27,5%) menor a la observada en la presente investigación (32,1%); sin embargo, es de destacar que en ambos estudios Malassezia furfur fue aislada en un importante porcentaje. 

La distribución de M. furfur en los diferentes sitios anatómicos de los individuos estudiados, mostró un predominio en espalda y pecho (33,3% y 26,6% respectivamente). Leeming y col. (25) reportaron una alta prevalencia de M. furfur en tronco, coincidiendo con los datos obtenidos en esta investigación. 

Estudios efectuados por Aspiroz y col. (26) reportaron el aislamiento de 120 cepas de Malassezia a partir de espalda, cuero cabelludo y pecho de 39 sujetos sanos, estos aislamientos fueron clasificados como: M. globosa, M. restricta y M. sympodialis; no reportándose M. furfur. Según estos autores el estudio de sitios anatómicos podría facilitar el descubrimiento de nuevos fenotipos. 

Los resultados obtenidos indican una estrecha relación entre la excreción de grasa y colonización de M. furfur en las diferentes zonas del cuerpo, en la población estudiantil universitaria evaluada. 

Es importante continuar las investigaciones en piel sana y enferma de otros grupos etáreos, en diferentes regiones del país ya que esto permitirá determinar cuales son las especies de Malassezia predominantes y evaluar el potencial patógeno de las mismas en pitiriasis versicolor, dermatitis seborreica, blefaritis seborreica, dermatitis atópica, psoriasis y foliculitis. 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 

1. Crespo M, Abarca M, Cabañes F. Atypical lipid-dependent Malassezia species isolated from dogs with otitis externa. J Clin Microbiol 2000:2383-2385.         [ Links ]

2. Duarte E, Melo M, Hahn R, Hamdan J. Prevalence of Malassezia spp. in the ears of asymptomatic cattle and cattle with otitis in Brazil. Med Mycol 1999; 37: 159-162.          [ Links ]

3. Faergeman J. Quantitave variations in distribution of Pityrosporum orbiculare on clinically normal skin. Act a Derm Venereal 1983; 63:346-348.          [ Links ]

4. Archer-Dubon C, Icaza-Chivez M, Orozco-Topete R, Reyes E, Báez-Martínez R, Ponce de León S. An epidemic outbreak of Malassezia folliculitis in three adult patients in an intensive care unit: a previously unrecognized nosocomial infection. In J Dermatol 1999; 38: 453 - 456.          [ Links ]

5. Crespo V, Ojeda A, Vera A, Crespo A, Sánchez F. Isolation and identification of Malassezia spp in Pytiriasis versicolor, Seborreheic Dermatitis and healthy skin. Rev Iberoam Micol 1999; 16: S16-S24.          [ Links ]

6. Guého E, Midgley G, Guillot J. The genus Malassezia with description of four new species. Antonie van Leeuwenhoek 1996; 69:337-355.          [ Links ]

7. Guillot J, Guého E. The diversity of Malassezia yeast confirmed by RNA sequence and nuclear DNA comparisons. Antonie Van Leeuwenhoek 1995; 67: 297-314.          [ Links ]

8. Guillot J, Deville M, Berthelemy M, Provost F, Guého E. A single PCR - restriction endonuclease analysis for rapid identification of Malassezia species. Lett appl Microbiol 2000; 31(5): 400-403.          [ Links ]

9. Guillot J, Guého E, Chermette R. Confirmation of the nomenclatural status of Malassezia pachydermatis. Antonie Van Leeuwenhoeck 1995; 67:173-176.          [ Links ]

10. Gupta A, Kohli Y, Summerbell R. Molecular Differentiation of seven Malassezia species. J of Clin Microb. 2000; 38:1869-1875.          [ Links ]

11. Sugita T, Takashima M, Shinoda T, Suto H, Unno T, Tsuboi R, Ogawa H, Tsuboi R, New yeast species, Malassezia dermatis Isolated from patients with atopic dermatitis. J. Clin Microbiol 2002; 40:1363-1367.          [ Links ]

12. Sugita T, Takashima M, Kodama M, Tsuboi R, Tsuboi R, Nishikawa A. Desscription of a new yeast species, Malassezia japonica, and detection in patients with atopic dermatitis and healthy subjects. J Clin Microbiol 2003; 41(10): 4695-4699.          [ Links ]

13. Guillot J, Guého E, Lesourd G, Midgley G, Chévrier G, Dupont B. Identification of Malassezia species. A practical approach. J Mycol Med 1996; 6: 103-110.          [ Links ]

14. Murai N, Kano R, Watanabe S, Hasegawa A. Differentiation of Malassezia furfur and Malassezia sympodialis by glycine utilization. Mycoses 2002; 45: 180-183.          [ Links ]

15. Crespo A, Sánchez F. Isolation and identification of Malassezia spp in Pytiriasis versicolor, Seborrhea Dermatitis and healthy skin. Rev Iberoam Micol 1999; 16: S16-S24.          [ Links ]

16. Sugita T, Suto H, Unno T, Tsuboi R, Ogawa H, Shinoda T, NIshikawa A. Molecular Analysis of Malassezia Microflora on the skin of atopic dermatitis patients and healthy subjects. J Clin Microbiol 2001; 39:386-390.          [ Links ]

17. Gemmer C, Deangelis Y, Theelen B, Boekhout T, Dawson T. Fast, Noninvasive meted for molecular detection and differentiation of Malassezia yeast species on human skin and application of the method to dandruff. Microbiology. J Clin Microbiol 2002; 40: 3350-3357.          [ Links ]

18. Nakabayashi A, Sei Y, Guillot J. Identification of Malassezia species isolated from patients with Seborrhoeic Dermatitis, Atopic Dermatitis, pityriasis versicolor and normal subjects. Med Mycol 2000; 38: 337-34.          [ Links ]

19. Pérez- Blanco M, Urbina- Guanipa O, Fernández-Zeppenfeldt G, Richard-Yegres N. Influencia de la temperatura y la humedad en la frecuencia de pitiriasis versicolor, estudio epidemiológico en el Estado Falcón, Venezuela. Invest Clin 1990; 31:121-128.          [ Links ]

20. Borelli D, Marcano C. Datos sobre la ecología de Pityrosporum en Venezuela. Revista de la Fundación José María Vargas 1988: 15-18.          [ Links ]

21. Faergeman J. Pityrosporum yeast - What’s new ? Mycoses 1997; 40: 29-32.          [ Links ]

22. Gupta A, Summerbell R, Faergemann J. Quantitative Culture of Malassezia species from different body sites individuals with or without dermatoses. Med Mycol 2001; 39:243-251.          [ Links ]

23. Rodríguez S. Pityrosporum orbiculare y Pityrosporum ovale Prevalencia en piel sana de niños y ancianos de 4 comunidades educativas y asilo en el estado Zulia. Kasmera 1990; 18: 71-89.          [ Links ]

24. Rincón S, Alis A, Cepero M. Prevalencia de especies del género Malassezia en aislamientos realizados en personas con y sin lesión dermatológica. http:://WWW. Infectio.org.         [ Links ]

25. Leeming J, Notman F, Holland K. The distribution and ecology of Malassezia furfur and cutaneus bacteria on human skin. J Appl Bacteriol 1989; 67: 47-52.          [ Links ]

26. Aspiroz C, Moreno L, Rezusta A, Rubio C. Differentiation of three biotypes of Malassezia species on human normal skin correspondence with M. globosa, M. sympodialis and M. restricta. Mycopathologia 1999; 145: 69-74.          [ Links ]

Autor de correspondencia: Sofía Rodríguez-Valero. Cátedra de Micología, Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela. Correo electrónico: sofiavalero@hotmail.com