ABSTRACT

Introduction: Nimesulide is a non-steroidal antiinfflamatory drug associated with hepatotoxicity. Nevertheless, there have few published controlled studies with animals. Objec - tive: Determine whether the administration of therapeutic doses of nimesulide during differents periods alters hepatic function in male and female rats. Materials and me - thods: Forty Wistar rats were classified into 4 groups of 10 rats each. Group I received 0,1 ml of saline for 7 days, whe reas the animals from groups II, III and IV were treated with Ni mesulide (3 mg/kg) during 7, 21 and 35 days, respectively. It has determined serum levels of bilirubin, alkaline phos pha tase and transaminases. Results: Alanino–amino–transferase (ALT) enzyme was increased in males (p<0.01) and females (p<0.02) from groups III and IV in com parison with the control group. Alkalin phosphate increased in males from groups II and IV in comparison with the females from these same groups (p< 0.05). Direct and total bilirubins decreased in group IV females (p< 0.03) in comparison with the control group. Conclusions: The administration of therapeutic doses of nimesulide affects hepatic function on Wistar rats.

Key words: Nimesulide, hepatic function, Wistar rats.

INTRODUCCIÓN

Las reacciones adversas ocasionadas por fármacos son responsables de una gran proporción de las afecciones hepáticas. Alrededor de 25% de casos de falla hepática aguda es inducida por fármacos (1). Se considera que el daño hepático provocado por el uso de medicamentos puede deberse a una hepatotoxina conocida o a una reacción idiosincrásica. La severidad de la enfermedad hepática varía desde una elevación leve de las enzimas hepáticas hasta una lesión hepatocelular severa; así como alteraciones colestásicas (2). Los analgésicos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) se encuentran entre los fármacos asociados con mayor frecuencia a hepatotoxicidad inducida por fármacos, con una incidencia estimada entre 3 y 23 casos por 100.000 pacientes al año (3). El nimesulide es una sulfonanilida (4 nitro-2 fenoximetanosulfonanilida) perteneciente al grupo de los AINEs indicado en el tratamiento del dolor, la inflamación y la hipertermia. Como inhibidor selectivo de la ciclo oxigenasa tipo 2, posee bajo perfil de reacciones adversas (1). Sin embargo, desde el año 1998 se han publicado aproximadamente 70 casos de hepatotoxicidad atribuidos a este fármaco. La mayoría de los pacientes son adultos del sexo femenino, el diagnóstico más frecuente fue la colestasis, en segundo lugar la lesión hepatocelular, en algunos casos con característica fulminante y con menor frecuencia se reportaron lesiones mixtas (4-26). A partir de los datos clínicos e histológicos se ha propuesto que tanto las reacciones idiosincráticas metabólicas como las inmunológicas pueden estar involucradas en la patogénesis de la enfermedad hepática inducida por el nimesulide (27). Debido a los casos graves de hepatotoxicidad atribuidos a este fármaco, diversos países han decidido sus pender su uso (28). En Venezuela fue suspendida la comercialización, a partir del año 2005, sólo para las presentaciones pediátricas del nimesulide; mientras que en adultos aún se permite su prescripción con restricciones (29). A pesar de los casos clínicos reportados en la literatura que relacionan al nimesulide con la producción de lesiones hepáticas; no se hallaron publicaciones de estudios controlados en humanos y en animales de experimentación que demuestren que el nimesulide provoca alteración del funcionalismo hepático a dosis terapéuticas, por tal motivo nos propusimos determinar si la administración de nimesulide a dosis terapéuticas en ratas, durante diferentes períodos de tiempo, altera los niveles séricos de las bilirrubinas directa, indirecta y total, así como de la fosfatasa alcalina y las transaminasas aspartato aminotransferasa (AST) y alanino aminotransferasa (ALT).

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales

Cuarenta ratas de la cepa Wistar (20 hembras y 20 machos) con un peso que osciló entre 250-300 g; provenientes del Bioterio de la Universidad de Los Andes (BIOULA), fueron sometidas a un período de adaptación (ambiental y física) a las condiciones del Laboratorio antes de iniciar los tratamientos. Durante el experimento las ratas fueron alimentadas con ratarina (Protinal®) y se les suministró agua a libre demanda.

Fármacos

Se utilizó nimesulide Calox-McK en suspensión de 10 mg/ml a dosis de 3 mg/kg/día o.d y 0,1 ml de solución salina fisiológica, administrados por vía oral mediante una cánula fabricada con una aguja metálica Nº 21. Esta dosis de nimesulide es similar a la dosis máxima terapéutica recomendada en Venezuela para adultos con peso corporal promedio de 70 kg, por la Junta Revisora de Productos Farmacéuticos del Instituto Nacional de Higiene Rafael Rangel (29).

Diseño experimental

Las ratas se distribuyeron en cuatro grupos de forma aleatoria, a su vez cada grupo fue dividido según el sexo, de la siguiente forma: Grupo I [n = 10: (5 ♂, 5 ♀) ]: se le administró diariamente 0,1 ml de solución salina fisiológica durante 7 días y se mantuvo como control del experimento. Grupos II, III y IV [n = 10: (5 ♂, 5 ♀), para cada uno de los grupos]: se les administró diariamente una dosis terapéutica de nimesulide de 3 mg/kg de peso durante un período de 7, 21 y 35 días respectivamente. Durante la ejecución de la investigación se siguieron las normas éticas nacionales (30) e internacionales para rea lizar experimentos en animales de laboratorio, establecidas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas, conjuntamente con la OMS y la UNESCO – CIOMS – (31). En este sentido, en concordancia con el enunciado de “las tres erres” de William Russell y Rex Birch, se usó el mínimo número de animales de la especie y calidad apropiada para obtener resultados científicamente válidos. Asimismo, con el propósito de minimizar el sufrimiento de los animales, al finalizar el tratamiento las ratas fueron anestesiadas por el método de inhalación. Los animales fueron colocados en una campana de vidrio con plataforma perforada, que separó al ejemplar biológico de un algodón embebido en el agente volátil (cloroformo), para evitar quemaduras por el contacto con la piel y las mucosas.

El criterio empleado para evaluar el efecto anestésico fue la respuesta al pinchazo aplicado en la cola. A todos los grupos se le realizó extracción de sangre mediante punción cardíaca con la finalidad de obtener un volumen de 3 ml. La muestra fue recolectada en tubos de centrífuga de 10 ml de capacidad, sin anticoagulante, protegiéndolos de la luz. Posteriormente se centrífugó a 3.000 rpm durante 15 minutos a fin de obtener el suero que se utilizó para realizar las determinaciones de bioquímica sanguínea: bilirrubina directa, bilirrubina total, fosfatasa alcalina y las transaminasas AST y ALT.

Metodología analítica

Valoración de la bilirrubina directa, indirecta y total Las bilirrubinas directa y total fueron valoradas utilizando el método colorimétrico. La lectura de las bilirrubinas se realizó utilizando una longitud de onda de 555nm, se utilizó kit comercial (Biosigma C.A). Los resultados se expresan en mg/dL. valoración de las fosfatasas alcalinas La actividad de la fosfatasa alcalina del suero se determinó mediante el método BANSON (modificado) basado en la velocidad de hidrólisis de varios ésteres del ácido fosfórico. La lectura se realizó a una longitud de on da de 550 nm. Los resultados se expresan en unidades/ Litro. valoración de las transaminasas Las enzimas AST y ALT fueron valoradas utilizando un equipo de espectrofotometría automatizado, modelo Konelab 20 para bioquímica sanguínea, se utilizó kit comercial (Biosigma C.A). Se realizó un ensayo cinético basado en las recomendaciones dictadas por la “International Federation for Clinical Chemistry” (IFCC) para la determinación de cada enzima. Los resultados se expresan en unidades/Litro.

Análisis estadístico

Se analizaron los resultados de acuerdo con el tiempo de exposición al fármaco y según el sexo, a través de la comparación entre las medias de las variables estudiadas, utilizando las pruebas estadísticas no paramétricas H de Kruskal–Wallis y la U Mann–Whitney. Los datos son expresados como x ± E.E. Se estableció un nivel de significación estadística de p< 0.05. Se utilizó el paquete estadístico Origin Graph versión 2.0.

RESULTADOS

La tabla 1 muestra las variables estudiadas de acuerdo con el tiempo de exposición de los grupos de animales al nimesulide, independientemente del sexo. Al comparar los valores promedios se observó un aumento es tadísticamente significativo de la enzima ALT para los grupos III y IV respecto al grupo I o control (p<0.0001). Asi mismo, los valores de esta enzima fueron significativamente más altos en estos mismos grupos con respecto al grupo II (p<0.001), mientras que la enzima AST presentó disminución significativa en el grupo III respecto al grupo II (p< 0.029). En la tabla 2 se presentan los datos relacionados con las variables analizadas según el sexo y los grupos que intervinieron en el estudio de acuerdo con el tiempo de exposición al fármaco. Se observa disminución significativa de la bilirrubina directa y la bilirrubina total en las hembras del grupo IV con respecto al grupo I (p<0.03). Con relación a la fosfatasa alcalina hubo aumento estadísticamente significativo en los machos respecto a las hembras tanto en el grupo II como en el IV (p< 0.05). La enzima ALT experimentó una elevación significativa en los machos del grupo III y IV, respecto a los machos del grupo control (p < 0.01), de la misma manera se observó aumentó significativo de esta enzima en las hembras del grupo III y IV, en comparación a las hembras del grupo control (p < 0.02).

DISCUSIÓN

    En los últimos años, reportes clínicos han vinculado al nimesulide con un mayor riesgo de inducir lesiones hepáticas, en comparación con otros AINEs (3). El funcionalismo hepático se evalúa a través de perfiles bioquímicos que orientan a la determinación sérica de metabolitos propios de un órgano. En nuestro estudio se de terminaron: bilirrubina total, bilirrubina directa, fosfatasa alcalina y transaminasas (ALT y AST). La elevación en sangre de las enzimas intracelulares, como las transaminasas y la fosfatasa alcalina, indica que existe una alteración funcional y orgánica de las células que las albergan que permite la salida de éstas y su pasaje al medio circulante. Estas enzimas son consideradas marcadores de daño hepático. A medida que se elevan los ni veles en zimáticos séricos, mayor es la lesión celular, aunque de esto no se pueda inferir la extensión del daño y si éste es o no irreversible. Asimismo las bilirrubinas se consideran marcadores de la función hepática por ser productos de rutas metabólicas propias del hígado (32, 33). Los resultados del presente estudio muestran una elevación de la enzima ALT en los grupos expuestos durante mayor período de tiempo al nimesulide (21 y 35 días) respecto al control, esto también se observó al hacer la comparación según el sexo, lo cual sugiere que el nimesulide provocó un daño celular a nivel de los hepatocitos de las ratas y que el tiempo de exposición al fármaco puede intervenir en la aparición de la hepatotóxicidad. En algunos de los casos clínicos publicados también se ha observado la influencia del tiempo de exposición sobre el inicio del daño hepático inducido por el nimesulide (4,14).

    A pesar de que a la enzima AST también se le considera indicador de daño hepatocelular, en el presente estudio no hubo variaciones significativas de esta enzima según el tiempo de exposición y el sexo, al comparar los grupos tratados con nimesulide y el grupo control. Sin embargo, se observa un descenso significativo en el grupo III respecto al grupo II al hacer el análisis según el tiempo de exposición al fármaco e independientemente del sexo de los animales. Este resultado contrasta con los casos clínicos de hepatotoxidad causada por nimesulide publicados en la literatura, en los cuales se ha reportado aumento de esta enzima (4, 6, 7, 10-12, 14-17, 19). La elevación en sangre de la bilirrubina total y directa es indicativa de alteración a nivel de las vías biliares, mientras que la elevación de la indirecta puede reflejar la presencia de hemólisis. En esta investigación no se presentó elevación de las bilirrubinas, este hallazgo no coincide con los reportes de casos clínicos publicados por varios autores, en los que se observó hiperbilirrubinemia por nimesulide (12, 16, 17).

No obstante, la hiperbilirrubinemia no ha sido una constante en todos los casos de hepatotoxicidad por nimesulide publicados en la literatura (34). Cuando se hizo la comparación entre sexos, los valores de bilirrubina total y directa disminuyeron en las hembras expuestas durante un mayor período de tiempo al fármaco (35 días) en comparación al control. Sin embargo, puesto que los valores están dentro del rango normal para estos animales, no consideramos que su alteración tenga significación biológica. Para la enzima fosfatasa alcalina no hubo variación según el tiempo de exposición al nimesulide, no obstante sus niveles experimentaron un ascenso significativo en los machos de los grupos II y IV al compararlos con las hembras de esos mismos grupos. Los niveles de esta enzima duplican los valores normales en casos de lesión colestática, mientras los pacientes con daño hepatocelular presentan valores menores.

Cabe destacar que la fosfatasa alcalina puede estar presente en otros órganos por lo que se requiere una prueba suplementaria para evaluar la enzima gammaglutamil transferasa y confirmar así que el aumento de la fosfatasa alcalina proviene del sistema biliar o del hígado (35, 36). Se ha sugerido una toxicidad hepática de tipo idiosincrásica metabólica para el nimesulide. Aún cuando los mecanismos moleculares hepatotóxicos no están bien establecidos, se ha planteado que vías metabólicas aberrantes permiten la formación de metabolitos reactivos del nimesulide que modifican proteínas en forma covalente, producen estrés oxidativo y daño mitocondrial (13, 34, 37). Uno de los metabolitos del nimesulide identificados en orina humana es el 4-amino-2-fenoxi- metanosulfonanilida, a éste se atribuye la formación de especies reactivas en condiciones de oxidación (38).

Con relación al daño mitocondrial, Mingatto et al. (39) en estudio in vitro demostraron que el nimesulide causa daño a la célula hepática de ratas y que este efecto tóxico está mediado por alteración en la producción mitocondrial de ATP. Recientemente, en un estudio también realizado invitro, se evidenció que el nimesulide aumenta el flujo mitocondrial de electrones y la depolarización mitocondrial conduciendo a la muerte celular en células hepáticas de rata (40). En conclusión, los resultados de este estudio sugieren que el nimesulide a dosis terapéuticas altera el funcionalismo hepático en ratas Wistar y que este efecto depende del tiempo de exposición al fármaco. Los ha llazgos evidencian la necesidad de planificar otros es tu dios para evaluar desde el punto de vista his topatológico, metabólico y molecular el efecto hepático del nimesulide.

AGRADECIMIENTO

Al Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico de la Universidad de Los Andes (CDCHTULA) por el financiamiento de esta investigación correspondiente al proyecto M-782-03-03-C.

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