Flavonoides, actividades antibacteriana y antioxidante de propóleos de abejas sin aguijón, Melipona quadrifasciata, Melipona compressipes, Tetragonisca angustula y Nannotrigona sp. de Brasil y Venezuela

Antonio J. Manrique¹ y Weyder C. Santana²

¹ Universidad Nacional Experimental Rómulo Gallegos. Área de Agronomía. San Juan de los Morros, Guárico. Venezuela. Correo electrónico: tonyman77@terra.com.

² Universidade de São Paulo, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, SP, Brasil

RESUMEN

En el presente trabajo se evaluaron el contenido de flavonoides, las actividades antimicrobianas y antioxidante de los propóleos de abejas sin aguijón, Melipona quadrifasciata, Melipona compressipes, Tetragonisca angustula y Nannotrigona sp., mediante el uso del extracto etanólico de propóleos (EEP) contra las bacterias Gram positivas, Staphylococcus aureus y Micrococcus luteus. El propóleos fue colectado en los estados Miranda y Guárico, Venezuela, y São Paulo, Brasil, durante el período de noviembre de 2003 a abril de 2004. Los contenidos de flavonoides fueron muy bajos, variando de 0,19 a 0,32%. La actividad antioxidante en todas las muestras fue menor a 22 seg, con media de 3 a 5 seg. Los EEP de M. quadrifasciata mostró la mayor actividad antioxidante. Los EEP de todas las muestras tuvieron una elevada actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus y Micrococcus luteus, con halos de inhibición de 11 a 30 mm, tanto en las muestras de Brasil como en las de Venezuela. El EEP de la Nannotrigona sp. mostraron mayor actividad antimicrobiana que los de otras abejas. Se concluye que los propóleos de las abejas sin aguijón estudiadas poseen elevadas actividades antioxidante y antimicrobianas, aunque los contenidos de flavonoides sean bajos.

Palabras clave: Propóleos, abejas sin aguijón, actividad antimicrobiana, flavonoides, actividad antioxidante.

Flavonoids, antibacterial and antioxidant activities of propolis of stingless bees, Melipona quadrifasciata, Melipona compressipes, Tetragonisca angustula, and Nannotrigona sp. from Brazil and Venezuela

ABSTRACT

Flavonoids content, antibacterial and antioxidant activities of Brazilian and Venezuelan propolis from stingless bees, Melipona quadrifasciata, Melipona compresssipes, Tetragonisca angustula, and Nannotrigona sp. were evaluated using ethanolic extracts of propolis (EEP) against Gram positives bacteria, Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. The propolis samples were collected in three locations, São Paulo state, Brazil, and Miranda and Guárico states, Venezuela, from November 2003 to April 2004. The results showed that the flavonoid content was very low for all samples, between 0.19 and 0.32%. The antioxidant activity was lower than 22 sec for all samples (3-5 sec of average). The EEP from Melipona quadrifasciata bees showed higher antioxidant activity than the other stingless bees. All EEP showed high antibacterial activity, with an inhibition halo between 11 to 30 mm, against Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus, for all Brazilian and Venezuelan samples. EEP from Nannotrigona sp. showed higher antibacterial activity than other bees. The propolis studied showed high antibacterial and antioxidant activity, despite lower flavonoids percentages

Keywords: Propolis, stingless bees, antimicrobial activity, flavonoids, antioxidant activity.

Recibido: 04/12/2007 Aceptado: 27/05/2008

INTRODUCCIÓN

Los Meliponinos comprenden especies de abejas eusociales sin aguijón, nativas de las regiones tropicales y subtropicales del mundo, principalmente, de América (Michener, 2000) Se estima que el número de estas especies de abejas sea alrededor de 300 distribuidas desde México hasta el norte de Argentina, con mayor abundancia en la región amazónica (Roubik, 1989; Velthuis, 1997; Silveira et al., 2002).

Oliveira y Cunha (2005) afirman que las abejas Apis mellifera Linnaeus, 1758, no incursionan en bosques continuos y los Meliponinos actúan como los principales polinizadores. Biesmeijer (1997) refiere que polinizan entre 30 y 50% de las plantas de las tierras bajas en el trópico, siendo responsable por hasta 70 a 90% de la polinización de los árboles tropicales (Kerr et al., 1994; Ramalho, 2004). Alrededor de 250 especies botánicas están adaptadas para ser polinizadas por Meliponinos (Heard, 1999).

El propóleos es un término genérico usado para denominar el material resinoso y balsámico colectado y procesado por las abejas melíferas a partir de fuentes vegetales, a las cuales se les agrega algunas enzimas (Bankova, 2005), mientras que los Meliponinos producen propóleos a los cuales le adicionan cera y tierra, razón por la cual se denomina en muchos casos geopropóleos (Nogueira-Neto, 1962; 1997). La actividad biológica de los propóleos de los Meliponinos ha sido medianamente estudiada, existiendo algunos estudios de los propóleos de meliponinos brasileiros, mientras que en Venezuela los estudios limitados.

Bankova et al. (1998b) identificaron más de 50 compuestos en geopropóleos de abejas sin aguijón brasileiras, principalmente terpenoides y fenólicos, sugiriendo, que variaciones en la composición química pudieran deberse a la especie de abeja. En un trabajo realizado por Dos Santos Pereira et al. (2003), el propóleos de Tetragonisca angustula Latreille, 1836, mostró un potencial antimicrobiano similar al de abeja Apis, siendo el Staphylococcus aureus el microorganismo más sensible de los ensayados.

Las propiedades antimicrobianas del propóleos pueden ser atribuidas, principalmente, a los flavonoides, como la pinocembrina, galangina, pinobanskina y al éter bencil del éster fenetil de ácido caféico (CAPE), el cual es un componente activo del propóleos que ejerce gran variedad de cambios biológicos en diversos sistemas, como las respuestas inmunomoduladoras, antiinflamatórias, y antimitogénicas (Lefkovits et al., 1997). El uso de los flavonoides contra infecciones bacterianas o fúngicas tiene como objetivos matar las células de los microorganismos o dificultar los efectos de difusión de las toxinas bacterianas (Lopes, 1998)

Fernandes et al. (2001) basados en los resultados obtenidos concluyen que, en general, las bacterias Gram positivas son más susceptibles a los EEP que las Gram negativas. Farnesi (2007) refiere que el propóleos de Melipona quadrifasciata Lepeletier presentó mayor actividad antimicrobiana contra el Micrococcus luteus que contra S. aureus. Sin embargo, la inhibición fue menor que la de A. mellifera. Chaillou et al. (2004) estudiaron propóleos argentinos y encontraron que el 50% de las muestras inhibieron en más de 12 mm cepas de S. aureus, concluyendo que el diámetro del halo de inhibición depende del contenido de flavonoides de los EEP utilizados.

El objetivo del presente trabajo fue estudiar el contenido de flavonoides y evaluar la actividad antimicrobiana y actividad antioxidante del propóleos de abejas sin aguijón Melipona quadrifasciata, M. compressipes, T. angustula y Nannotrigona sp. provenientes de Brasil y Venezuela contra cepas estandarizadas de M. luteus y S. aureus.

MATERIALES Y MÉTODOS

El experimento fue realizado desde noviembre de 2003 hasta abril de 2004, durante el cual se colectaron muestras de propóleos en 10 colonias de T. angustula y Nannotrigona sp., cada una, provenientes de la Estación Experimental "Jaime Henao Jaramillo" de la Universidad Central de Venezuela, Cortada del Guayabo (10°01’ N y 62°15’ O), municipio Guaicaipuro, estado Miranda, y las muestras de geopropóleos de tres colonias de M. compressipes provenientes de Calabozo (8o55’ N y 67o26’ O), municipio Miranda, estado Guárico, Venezuela. Las muestras de M. compressipes provenían de pocas colonias debido a la dificultad de poder conseguir esta especie de abeja. Las muestras de geopropóleos de M. quadrifasciata provenían de 10 colonias del apiario (21011’ S y 470 13’ I) del Departamento de Genética de la Facultad de Medicina de Ribeirão Preto, Universidad de São Paulo, estado São Paulo, Brasil.

La recolección del propóleos fue realizada una vez al mes mediante el raspado del propóleos acumulado, principalmente en la tapa, dado que la producción de estas abejas es baja, como lo indica Fabichak (2000), quien señala que para estimar la productividad de propóleos se debe realizar un paralelismo con la producción de miel (kg/año), que ha sido reportada hasta en 10 veces mayor que la de T. angustula, Sin embargo, algunas líneas mejoradas producen hasta un kg/año. Previo a todos los análisis se realizó un pool de las muestras por especie y por cada mes evaluado.

Las evaluaciones de calidad del propóleos de meliponinos se realizaron bajo los mismos parámetros que se evalúan los propóleos de abejas Apis, dado que no existen otros indicadores establecidos para estas abejas.

La preparación de los extractos etanólicos de propóleos (EEP) se realizó según la metodología descrita por Park et al. (1998). Se prepararon dos EEP por cada muestra mensual recolectada, los cuales tenían una concentración de 15 mg/mL. Cada muestra tenía su respectiva réplica.

El contenido de flavonoides se evaluó al colocar en dos balones volumétricos de 25 mL 0,3 y 0,4 mL del EEP a cada uno, con sus respectivas réplicas, a los cuales se les adiciono 15 mL de metanol PA, 0,5 mL de AlCl3 5% p/v y se completo el volumen con metanol. Posteriormente, se agitó y se resguardó de la luz durante 30 min. Después se transfirieron 4 mL de las muestras en una cubeta de cuarzo para la lectura de la absorbancia hecha en un espectrofotómetro a 425 nm. Una muestra de metanol PA fue usada como blanco (control). En esta prueba los flavonoides reaccionan con el cloruro de aluminio en etanol produciendo un complejo de color amarillo que posee un pico de absorción de luz a 425 nm. El límite mínimo de tolerancia en propóleos de abejas Apis es de 0,75% m/m.

Para la prueba de actividad antioxidante, se colocaron 2 mL del EEP en un beaker de 100 mL, se adicionaron 48 mL de agua destilada y se agitó con un bastón de vidrio. Inmediatamente, se colocaron 0,5 mL do extracto diluido + 1,5 mL de agua destilada + 1 mL. H2SO4 20% en un tubo de ensayo de 15 mL y posteriormente se enfrió a una temperatura de 18 a 200C durante 2 min. Después se agregaron 50 μL de KMnO4 0,1N. El tiempo que tardaron las muestras en cambiar de color rosado a transparente fue medido con un cronómetro. El límite de tolerancia máximo permitido es de 22 seg, lo cual indica que el propóleos evaluado es de calidad. Esta prueba se realizó con su respectiva réplica.

Se realizaron antibiogramas con líneas estandarizadas American Type Culture Collection (ATCC) de M. aureus ATCC 25.923 y M. luteus ATCC 9.341 como bacterias de prueba. Se prepararon dos placas de petri, con sus respectivas réplicas, con agar Mueller-Hinton con suspensión de 108 a 109 de M. luteus ATCC 9.341 y S. aureus ATCC 25.923, sometidas a la acción de los diferentes EEP, a través de discos de papel (uno por cada muestra de propóleos) de 5 mm de diámetro. Como control fue usado un disco impregnado de alcohol etílico al 70%. Después las placas fueron incubadas a 37°C durante 24 h. Posteriormente, fueron leídos los halos de inhibición de crecimiento en mm, usando una regla milimetrada. La presencia de halo de inhibición indicaba que las bacterias evaluadas eran sensibles y la ausencia de halo indicaba que rea resistente al EEP evaluado.

Para el análisis de los datos se empleó un modelo lineal aditivo con efectos fijos, el cual cumplió con los supuestos de normalidad del ANAVAR Posteriormente, se aplicó la prueba de media de la mínima diferencia significativa honesta de Tukey a un nivel de P<0,05 por medio del programa Infostat (2002). El modelo usado fue:

Yijk = μ + Mesi + Abejasj + Mes ×Abejasij + Eijk

donde:

Yijk = Valor estimado de la característica estudiada

μ = Media de las muestras

Mesi = Efecto fijo del i-ésimo mes

Abejasj = Efecto fijo del j-ésimas especies de abejas

Mes ×Abejasij = Efecto del i-ésimo mes en la j-ésima especie de abejas

Eijk = Efecto aleatorio del error.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados de los contenidos de flavonoides de los propóleos evaluados evidenciaron diferencias significativas (P=0,0002) en cuanto a la influencia estacional de los EEP. Por otro lado, se comprobó una variación altamente significativa (P<0,0001) entre los EEP de las diferentes especies de abejas ensayados, lo

que demuestra la influencia del factor especie de abeja en el tenor de flavonoides. Los resultados previos se conjugaron en una interacción mes*abeja que resultó también altamente significativa (P=0,0143).

En la Figura 1 se presentan los contenidos de flavonoides de los propóleos evaluados, donde se observa que los valores variaron de 0,20 a 0,32%, con promedios de 0,25 y 0,28% para los meses de marzo y abril, respectivamente, y 0,26% para el resto de los meses. Aunque la diferencia entre los meses fue baja, la diferencia fue notoria y pudiera deberse a la oferta de resina en el momento de ser colectada y transformada en propóleos.

En cuanto a los contenidos de flavonoides por especie, también se observaron diferencias significativas en este parámetro entre especie de abeja evaluada, siendo la abeja españolita (T. angustula) la que mostró el mayor contenido promedio de 0,30% de flavonoides y la abeja guanota (M. compressipes) la que presentó el menor promedio con 0,23%, junto con la mandaçaia (M. quadrifasciata) con 0,24% de promedio de flavonoides. Parte de la diferencia de los tenores de flavonoides entre ambas especies pudiera deberse a la vegetación presente en las adyacencias de las colonias que aportaron las muestras, dado que existen evidencias de que la composición química del propóleos varía en función de la flora disponible por la colmena (Ghisalberti, 1979; Marcucci, 1995). Estos valores promedios de flavonoides obtenidos son bajos, cuando se comparan con los producidos por abejas Apis, propóleos que ha sido ampliamente estudiado, con valores reportados desde 0,55 hasta 2,89% en condiciones tropicales (Manrique, 2001). En un estudio realizado por Manrique (2006) con propóleos de Apis, colectado en la misma zona donde se colecto el propóleos de las abejas españolita y conguita (Nannotrigona sp.), se obtuvieron contenidos de flavonoides que variaron entre 0,55 y 0,97%.

Similarmente, Woisky (1996) y Manrique (2001) reportaron contenidos de flavonoides de 0,83 y 0,73% de muestras de propóleos de Apis, provenientes de Ribeirão Preto, Brasil, región de donde se obtuvo el propóleos de la abeja mandaçaia usada en el presente trabajo. Sin embargo, los bajos valores de flavonoides del propóleos obtenidos por los Meliponinos del presente trabajo concuerdan con los datos de Tomás-Barberán et al. (1993) quienes verificaron bajos tenores de flavonoides y valores trazas en otras muestras de propóleos de Venezuela, colectadas por A. mellifera y por M. favosa, respectivamente, y con lo sugerido por González y Bernal (1997) y Bracho et al. (1996) quienes afirman que los propóleos tropicales son bajos en flavonoides.

En la Figura 2 se muestra la actividad antioxidante de los EEP de los meliponinos en estudio. Los resultados obtenidos no muestran diferencias estadísticas entre los diferentes meses, con lo cual no hubo influencia estacional. Por otro lado, hubo diferencias estadísticas entre especies, resaltando los EEP de M. quadrifasciata, con valores sumamente bajos (2,50 seg) para los meses de enero y marzo. Similarmente, se ilustra la elevada capacidad antioxidante de los EEP analizados, dado que todas las muestras analizadas están muy por debajo del límite máximo de 22 seg, con 6,50 seg como el valor más elevado en los EEP de noviembre y marzo de las abejas M. compressipes, con buena actividad biológica, a pesar de tener bajo contenido de flavonoides. Esta tendencia es corroborada con el análisis de correlación de Pearson realizado en todas las muestras de EEP, donde se mostró que no existe correlación entre el contenido de flavonoides y la actividad antioxidante. Resultados contrarios a los obtenidos por Manrique (2001) quien encontró que la actividad antioxidante de los EEP de abejas Apis estaban influenciados por los valores de flavonoides, con reacciones de hasta 5 seg cuando el valor de los flavonoides alcanzaba 2,32%. Esta tendencia concuerda con lo apuntado por Park y Alencar (2000), quienes encontraron que la actividad antioxidante era más rápida cuando los valores de flavonoides eran más elevados. Sin embargo, Salamanca et al. (2007) refieren que estas variaciones pudieran asociarse con el tipo de compuestos presentes en los extractos analizados, que no necesariamente contienen flavonoides. Por otro lado, Manrique y Santana (2004) destacan que la propiedad antioxidante del propóleos varía según la concentración y la naturaleza del producto a ser conservado. La diferencia significativa observada en la actividad antioxidante, pudiera deberse al tipo de resina que colecta cada especie, dado que se muestreó en tres zonas geográficas diferentes, diferentes hábitats, encontrándose que la actividad antioxidante de los EEP de las Nannotrigona sp. T. angustula, que provenían del mismo meliponario, mostraron el mismo comportamiento.

En el Cuadro 1 son presentados los datos sobre la actividad antimicrobiana de los EEP de las muestras de propóleos de las abejas sin aguijón, donde hubo influencia estacional al mostrar diferencias significativas, según la Prueba de Tukey. Casi todos los EEP propóleos inhibieron fuertemente el crecimiento microbiano, tanto del M. luteus como del S. aureus, a excepción de los EEP de noviembre que aun cuando inhibieron el crecimiento bacterial, sin embargo, éste no fue tan fuerte. Los EEP obtenidos de muestras colectadas en el mes de enero presentaron mayor actividad contra el M. luteus, con halos de inhibición de 26,5 mm. Similarmente, el S. aureus, fue más sensible a los EEP de enero. Estos valores son superiores a los reportados por Konishi et al. (2004) con S. aureus y Streptococcus mutans Clarke, 1924, con halos de inhibición entre 7,9 y 12,0 mm. Por otro lado, los mayores diámetros de inhibición fueron obtenidos contra M. luteus, contrario con los resultados reportados por Moura et al. (1999) y Manrique (2006).

Los resultados de todos los EEP evaluados muestran que a actividad antimicrobiana del propóleos es variable dependiendo del microorganismo en estudio y de la región de colecta del mismo, tal como lo sugieren Koo et al. (1999) y Manrique (2006) quien evaluó propóleos de la misma región colectados por abejas Apis, concordando con los resultados de Sforcin et al. (1998) quienes no encontraron efecto estacional al evaluar propóleos colectado en cuatro estaciones, los cuales inhibieron el crecimiento de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. La diferencias significativas en la actividad antimicrobiana del propóleos colectado en diferentes meses pudiera deberse a la composición misma de las resinas que lo forman, dado que las abejas extraen resinas, principalmente, de los puntos de crecimiento de las plantas, visto que en regiones tropicales el crecimiento de las plantas se manifiesta durante todo el año, bien como en heridas en las plantas y estructuras resiníferas vegetales (Roubik, 1989).

Concordando con lo antes señalado, Bankova et al. (1998a) observaron, que dependiendo de la estación del año, existe variación en los componentes químicos del propóleos, como los diterpenos, que son biológicamente muy activos y son detectados en el propóleos producido en el verano y otoño, pero que no se producen en las otras épocas del año. El origen vegétal de los propóleos en las abejas sin aguijón es distinto al de las A mellifera en un mismo hábitat, siendo que ha variación en la composición química del propóleos entre las diferentes especies de los meliponinos (Bankova y Popova, 2007).

En general, la actividad antimicrobiana de los propóleos es atribuida al contenido de flavonoides (flavonas y flavononas), tal como lo refieren diversos autores, como Lefkovits et al. (1997), Chaillou et al. (2004) y Principal (2005). Sin embargo, los propóleos estudiados en el presente ensayo mostraron valores muy bajos, variando de 0,20% a 0,32%, lo cual pudiera indicar que existen otras variables que influyan sobre la actividad antibacteriana.

Las actividades antimicrobianas de los EEP de las diferentes especies de meliponinos son mostrados en el Cuadro 2, donde se observó que hubo diferencia significativa. Todos los EEP inhibieron la actividad de las bacterias estudiadas; sin embargo, de acuerdo al análisis estadístico, los EEP de T. angustula y Nannotrigona sp. mostraron mayor efectividad inhibitoria contra las bacterias evaluadas que los de M. quadrifasciata y M. compressipes. Estos resultados concuerdan con los de Velikova et al. (2000a) quienes obtuvieron resultados en los cuales los EEP de propóleos de M. quadrifasciata mostraron moderada (16 mm) actividad antimicrobiana contra S. aureus y difieren levemente de los obtenidos por Fernandes et al. (2001), quienes obtuvieron una actividad antimicrobiana de los EEP en el siguiente orden: M. quadrifasciata, Nannotrigona testaceicornis Lepeletier, 1836 y T. angustula contra el S. aureus. Mientras que cuando evaluaron los EEP contra Escherichia coli, T. Escherich, 1885 obtuvieron que los de T. angustula fueron superiores que los de N. testaceicornis. En otro trabajo realizado por Velikova et al. (2000b) encontraron que el extracto de propóleos de T. angustula mostró elevada actividad contra S. aureus, E. coli y Candida albicans Berkhout, 1923. Similarmente, Miorin et al. (2003) reportan que los propóleos de T. angustula poseen gran actividad antibacteriana contra el S. aureus. No obstante, estos resultados son contrarios a los reportados por Farnesi (2007) quien indica que los EEP de T. angustula, N. testaceicornis, Plebeia droryana Friese, 1900, Scaptotrigona bipunctata Lepeletier, 1836 y Friesiomellita varia Lepeletier, 1836, no mostraron actividad antifúngica ni antibacteriana, al ser evaluados contra M. luteus, S. aureus, E. coli, Aspergillus nidulans Winter, 1884, Pseudomonas aeruginosa Schröter, 1872 y Trichophyton rubrum Malmsten, 1845.

Esta actividad antimicrobiana pudiera deberse a la concentración de ácidos aromáticos (caféico y p-coumarico) presentes en los propóleos, los cuales son conocidos por sus actividades antimicrobianas y anti-inflamantória, tal como lo reseñan Krol et al. (1996). Aunque no se analizaron químicamente los EEP, la composición del propóleos puede variar entre muestras y pudiera influir sobre la actividad antibacteriana, tal como es sugerido por Bankova et al. (1998a), concordando con Bankova et al. (1998b), quienes reportaron diferencias en la composición química de propóleos de tres especies de abejas sin aguijón en Brasil.

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos muestran que los EEP provenientes de muestras de meliponinos, poseen fuerte actividad antimicrobiana contra las líneas estandarizadas de Staphylococcus aureus y Micrococcus luteus. Estos resultados refuerzan el potencial del extracto de propóleos como tratamientos de algunas patologías.

No existe correlación entre la actividad antioxidante y la concentración de flavonoides en los EEP de los meliponinos estudiados.

La actividad antimicrobiana de los propóleos evaluados mostró influencia estacional, posiblemente ligado la diferentes plantas/año o debido la diferentes condiciones fisiológicas de las mismas.

La actividad biológica (antimicrobiana y antioxidante) de los EEP de las abejas sin aguijón estudiados, indica que esta es parte de la defensa de las abejas contra algunos microorganismos patógenos, que naturalmente infestan las colonias en los climas tropicales.

Los propóleos de los meliponinos evaluados son muy bajos en flavonoides, sin embargo, presentan elevada actividad biológica, tan igual y hasta superior a los propóleos de abejas Apis con mayor contenido de flavonoides, non a presentando correlacionados con los estés, indicándose fuerte acciones biológicas de otros componentes de los propóleos de estas abejas.

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