Con la finalidad de evaluar la variabilidad generada en plantas de caña de azúcar, Saccharum spp. Híbrido, provenientes del cultivo in vitro de callos irradiados con rayos gamma, y confirmar la característica de resistencia al virus del mosaico observada en ensayos previos, se evaluaron características agronómicas y morfológicas en ensayos de campo en sucesivas generaciones de propagación vegetativa. Una muestra de las plantas o subclones fueron inoculados con la raza B del virus del mosaico para evaluar la estabilidad de la resistencia a esta enfermedad. Las plantas seleccionadas en los ensayos comparativos fueron caracterizadas molecularmente utilizando la técnica de RAPD’s. Los resultados obtenidos mostraron un alto porcentaje de plantas sin síntomas de la enfermedad en condiciones de campo (84%) y en los subclones reinoculados con la raza B del virus (95%). Un bajo porcentaje de plantas mostraron variaciones morfológicas, en las yemas, desarrollo de yemas en nudos superiores y pubescencia en la lámina de la hoja. De 264 subclones incorporados en los ensayos comparativos, 16 de ellos han mantenido buenas características de rendimiento (t ha-1 de caña y Pol% en caña) y de resistencia a las principales enfermedades del cultivo. La caracterización de estas plantas utilizando la técnica de RAPD’s permite señalar que se trata de materiales genéticamente diferentes a la planta madre (clon B67-49). La radiación indujo cambios en la estructura del ADN que pudieron ser detectados con esta metodología y que resultaron favorables en un alto porcentaje de las plantas evaluadas.

Palabras Clave: Saccharum spp.; variabilidad; resistencia; virus del mosaico de la caña de azúcar (SCMV); RAPD´s.

To evaluate the variability induced by gamma rays in vitro cultivated sugarcane callus, as well as to determine the stability to mosaic virus resistance (SCMV), agronomic and morphologic characters were evaluated in field trials through successive vegetative generations. A sample of sugarcane plants was inoculated using the strain B of the SCMV in order to evaluate disease resistance stability. Sugarcane plants selected through the standard selection program were molecularly characterized by using the RAPD´s technique. The results showed a high percentage of plants, 84% under field conditions and 95% of SCMV-B inoculated plants, free of mosaic symptoms. A low percentage of plants showed morphological variations such as buds, knot buds and leaf pubescence. Sixteen (16) out of 264 sugarcane plants evaluated in field trials had both, a good yield performance (Tons of sugar and cane) and disease resistance. RAPD´s technique allowed to genetically differentiate sugarcane plants from the source parent B67-49. Callus irradiation with gamma rays promoted DNA structural changes that were favorable in a high percentage of evaluated sugarcane plants.

Keys Words: Saccharum sp.; mutation; resistance; sugarcane mosaic virus (SCMV), RAPD.

La caña de azúcar, Saccharum spp., es la principal fuente de edulcorantes naturales del país, considerado como un cultivo prioritario desde el punto de vista económico y social, siendo fuente de empleo directo en el campo e industria, en la producción de azúcar, y en la elaboración de subproductos como el alcohol, conglomerados, alimentos para animales, entre otros.

Por ser un cultivo semiperenne, la caña de azúcar está expuesta a la acción de factores bióticos y abióticos durante gran parte del año los cuales inciden en los rendimientos. Entre estos las enfermedades, bien sea producidas por hongos, virus y bacterias, constituyen un factor de relativa importancia, entre estas, el mosaico de la caña de azúcar, enfermedad que ha ocasionado la desincorporación de cultivares híbridos como PR62258, Co740, Cl41223, V63-2 y H382915 (Rea et al., 1994).

En el país han sido identificadas las razas A, B, D y H del virus del mosaico de la caña de azúcar (sugarcane mosaic virus, SCMV). SCMV-B es la raza predominante y la de mayor severidad en este cultivo (Ordosgoitti et al., 1986). El virus produce en las hojas de las plantas infestadas un moteado severo con rayas finas, alargadas, cloróticas o blancas, las cuales varían en el grado de necrosis (Rea et al., 1994).

El mejoramiento tradicional del cultivo se ha realizado mediante la producción de híbridos, no obstante este procedimiento requiere de 10 a 15 años y variedades de comprobada adaptabilidad y rendimiento obtenidas a través de éste proceso han mostrado con el tiempo susceptibilidad a enfermedades introducidas al país (González, 1983). Es así, que con el uso de técnicas de cultivo in vitro e inducción de mutaciones se puede en corto tiempo inducir en estas plantas características de interés como la resistencia a enfermedades, sin alterar las de comprobada adaptabilidad y rendimiento.

La aplicación de mutágenos puede incrementar la frecuencia de mutaciones y permite al mejorador usarlas dentro de ciertos límites. La primera limitación es impuesta por el genoma pre-existente, es decir los genes que no existen no pueden ser mutados ni eliminados. Una limitación adicional de ésta técnica es que los mutágenos que se utilizan actualmente no pueden ser dirigidos a un gen específico. Los mutágenos afectan la estructura molecular del ADN, pero muchos de estos cambios inducidos, pueden ser reparados antes de que se manifiesten como mutaciones (mutaciones génicas, translocaciones y otras aberraciones cromosomales).

No obstante, el uso de las técnicas de cultivo de tejidos, ha permitido la recuperación de mutaciones ocurridas en células somáticas, cuando estas son sometidas a la acción de agentes mutagénicos, tales como radiación y sustancias químicas. Esto se debe a que el cambio ocurrido en una célula puede ser expresado en todas las células del organismo, cuando ésta es capaz de regenerar una planta vía embriogénesis somática. En caña de azúcar se han evaluado los cambios ocurridos en plantas regeneradas a partir de callos por variación somaclonal (Taylor et al., 1995; Irvine et al., 1991; Heinz, 1971).

Dentro de la gran variedad de marcadores moleculares existentes, los más utilizados son los RAPD´s. En la caña de azúcar, los mismos han sido empleados para una gran diversidad de estudios, entre ellos la identificación de híbridos inter- genéricos, el estudio de estabilidad genética de plantas generadas por cultivo in vitro (Taylor et al., 1995), la identificación de variantes somaclonales resistentes al virus del mosaico de la caña de azúcar SCMV (Oropeza y García, 1996), la identificación de materiales seleccionados in vitro tolerantes a glifosato (Zambrano, 1999).

En el año 1990, se obtuvieron plantas de caña de azúcar a partir de variedades comerciales utilizando la combinación del cultivo de callos y la inducción de mutaciones mediante radiación con rayos gamma (Fuchs et al., 2002), con el objetivo de inducir variabilidad genética y generar resistencia al SCMV, enfermedad de alta incidencia en el país y con varias razas señaladas (Ordosgoitti et al., 1986).

En las plantas regeneradas a partir de los callos irradiados y no irradiados, fue evaluada la resistencia a la enfermedad causada por SCMV, tanto en umbráculo, como en condiciones de campo durante dos generaciones de propagación vegetativa (Fuchs et al., 2002). Para confirmar las características de resistencia al virus del mosaico observada en un alto porcentaje de las plantas y además establecer si esta variación es consecuencia de cambios genéticos inducidos por la radiación, se plantearon los siguientes objetivos: evaluar la resistencia al SCMV en subclones de caña de azúcar al ser inoculados con la raza B del virus, evaluar sus características agronómicas y fisiológicas en ensayos de campo durante varias generaciones de propagación vegetativa y caracterizar la variabilidad genética generada en los subclones a través de marcadores moleculares (RAPD’s).

Las plantas evaluadas provienen de la regeneración de callos de las variedades B67-49 y PR62-258, ambas con buenas características de adaptabilidad y rendimiento, pero susceptibles al SCMV. Estos callos fueron irradiados con diferentes dosis de rayos gamma utilizando una fuente de Co 60 (Fuchs et al., 2002).

A los 60 días las plantas regeneradas fueron inoculadas con la raza B de este virus y aquellas que no mostraron síntomas de la enfermedad fueron sembradas en el Campo Experimental del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP), para posteriores evaluaciones. Una muestra de estas plantas, 260 subclones, fueron incorporados al Programa de Mejoramiento de la caña de azúcar en la Estación Local Yaritagua (ELY), estado Yaracuy, con la finalidad de continuar su evaluación en campo. En la Figura 1 se detalla el proceso de evaluación y selección de éstas plantas.

Los subclones seleccionados, fueron evaluados morfológicamente considerando ocho (8) caracteres: color del entrenudo, número de yemas /nudo, forma de la yema, posición de la yema, lígula, color de la aurícula, color de la lámina, color de la vaina, porte de la planta y pubescencia en hojas. Esta evaluación se realizó tanto en las plantas sembradas en el Campo Experimental del CENIAP como en las plantas seleccionadas en un primer ensayo comparativo en la ELY, en Yaracuy, de acuerdo a los descriptores morfológicos para el cultivo.

La evaluación agronómica de los subclones incorporados al Programa de Mejoramiento del cultivo, se realizó en ensayos comparativos situados en el campo experimental de la ELY, ubicado en el municipio Peña del estado Yaracuy.

La siembra de las plantas para el primer ensayo comparativo se realizó en parcelas experimentales constituidas de 1 hilo de 10 m de longitud por subclón, con una separación de 1,5 m entre hileras, y utilizando esquejes de tres yemas. Para el segundo comparativo la siembra se realizó en parcelas experimentales compuestas de 2 hilos 10 m de longitud por subclón; con una distancia entre hileras de 1,5 m y empleando esquejes de tres yemas. El diseño experimental aplicado fue el de bloques aumentados de Federer.

Las variables evaluadas fueron: rendimiento y productividad en caña de azúcar de t ha-1, Pol%, y grados Brix, pureza y floración. La evaluación fitosanitaria se realizó mediante la detección visual de los síntomas de las principales enfermedades del cultivo: SCMV, roya, escaldadura y carbón.

Para evaluar la estabilidad en la resistencia al virus del mosaico observada en las plantas provenientes de los callos irradiados, fueron seleccionadas y mantenidos 240 subclones en el ensayo ubicado en el Campo Experimental del CENIAP, provenientes de las plantas inicialmente regeneradas de callos de las variedades B67-49 y PR62-258 irradiados con rayos gamma (0, 2, 4, 8 y 12 Kr).

De una primera siembra se seleccionaron 2 tallos/planta, a partir de los cuales se tomaron esquejes de una yema. Estos esquejes se colocaron en papel humedecido para inducir la brotación de yemas y el desarrollo de raíces, posteriormente se sembraron en una mezcla de suelo: turba: arena en proporción 1:1:1. En algunos subclones se presentaron fallas en la formación de raíces, mientras que en otros se observó una lenta brotación de yemas. Las plantas desarrolladas a partir de los esquejes mostraron un desarrollo muy lento y se observó contaminación con hongos y bacterias fitopatógenas que produjeron muerte regresiva de las plantas.

Una segunda siembra se realizó con plantas jóvenes tomadas directamente de la macolla. Se sembraron 2 hijos/subclón en condiciones de umbráculo. En esta ocasión se observó un buen desarrollo de las plantas. En el Cuadro 1, se muestra la identificación de los subclones que fueron inoculados. A los 4 meses de la siembra las plantas fueron inoculadas con un extracto de hojas de la variedad C571, altamente susceptible a la raza B del virus del mosaico.

La inoculación fue realizada según la metodología utilizada por Rea (1993), con algunas modificaciones. El inóculo fue preparado licuando 400 g de hojas/ 2 l de agua destilada fría, el licuado fue filtrado con gasa y almacenado a 4 ºC hasta el momento de su uso. Previamente a la aplicación del inóculo con asperjadora de espalda se aplicó el abrasivo carborundum más inóculo a cada una de las hojas en forma manual. Se realizó una segunda inoculación tres meses después, utilizando esta vez el método del dedo impregnado con carborundum. La observación de los síntomas se realizó semanalmente. Se incluyeron como testigos plantas de B67-49 y PR62-258 y la planta indicadora sorgo variedad Maracay, altamente susceptible a la enfermedad1.

La extracción de ADN se realizó utilizando la metodología de miniextracción descrita en CIAT (1999). La calidad y concentración del ADN genómico fue determinada en geles de agarosa. Una vez extraído y cuantificado el ADN se procedió a su amplificación con iniciadores aleatorios según metodología descrita por Zambrano (1999), utilizando 25 ml de mezcla de reacción constituidos por 2,5 ml de Buffer B 10X, 3 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada uno de los dNTPs (A, C, G y T), 1 mM de primer, 1 unidad de Taq DNA polimerasa (Promega ) y 25 ng de ADN. A la mezcla de reacción se le agregó 20 µl de aceite mineral. Para la amplificación se utilizaron 12 primers de Operon Technologies: OPA01, OPA04, OPA07, OPB04, OPB07, OPK03, OPK05, OPK15, OPM04, OPM 14, OPM18 y OPM 20.

La amplificación fue llevada a cabo en un termociclador marca Techne GeneE. El ciclo de desnaturalización fue iniciado a 94 ºC por 5 min, seguido de 45 ciclos o de amplificación a 94 ºC por 1 min, 36 ºC por 30 seg, y extensión a 72 ºC por 2 min. El paso final fue un ciclo a 72 ºC por 7 min.

Los productos de amplificación fueron analizados en geles de agarosa al 1,4% en buffer Tris borato, los geles se tiñeron con bromuro de etidium y las bandas fueron observadas y fotografiadas en un transiluminador con luz UV. Como marcador de pesos moleculares se utilizó l Phage DNA digerido con Hind III y Eco R I.

1. Evaluación morfológica

Al comparar las variaciones morfológicas de los subclones generados con la variedad de origen, las mismas se observaron con baja frecuencia. Las variaciones se percibieron principalmente en el patrón de las yemas, porte de la planta, el desarrollo de yemas en los nudos superiores, pubescencia en la lámina de la hoja y coloración del entrenudo (Cuadro 2).

De un total de 89 plantas evaluadas en el Campo Experimental del CENIAP, se observaron yemas ovales en los subclones 229-10 y 229-2; yemas aplanadas en el subclón 229-5 yemas triangulares en el subclón 229-15 y emisión de brotes en las yemas de los nudos superiores en los subclones 229-2, 220-8, 220-12 y 225-9.

De un total de 60 plantas evaluadas en el semillero para el 2do ensayo comparativo se observó: quimera en las hojas del subclón 232-78; pronunciada pubescencia en la lámina de hojas del subclón 229-13 y la emisión de brotes en los nudos superiores en los subclones 234-36, 232-78 y 232-69. La presencia de pelos epidérmicos en la lámina de la hoja es una característica marcadora del clon SP83-3079, carácter que ha sido observado en pocos clones de S. robustum y S. edule (Irving, 1991). La presencia de quimeras en plantas de caña de azúcar regeneradas a partir de callos, sugiere un origen multicelular de las plantas en las que estarían involucradas capas de células con plastidios carentes de clorofila y capas de células normales.

En los subclones inoculados con el virus del mosaico, también se observaron variaciones morfológicas muy evidentes. El subclón 298-7, presentó abundantes brotes en los nudos superiores, además de entrenudos de coloración morada. Esta planta proviene de un callo sometido a la dosis más alta de radiación (12 Krad).

La radiación puede generar cambios morfológicos y fisiológicos que son indeseables en una variedad, por ejemplo la variedad de caña de azúcar Co8152 es un mutante de la variedad Co527 inducido por rayos gamma, la cual tiene un 40% más rendimiento en caña que la variedad madre, pero que presenta como característica indeseable que las hojas inferiores se secan más rápidamente que la Co527 (Singh, 1999). En este caso, la característica de múltiples brotes en los nudos superiores observada en algunos subclones, pudiera considerarse indeseable para la producción de azúcar. Aún cuando pocas mutaciones morfológicas han sido identificadas en caña de azúcar, los cambios morfológicos que permanecen estables a través de diferentes generaciones de propagación vegetativa sugiere la presencia de efectos mutacionales (Irvine, 1991).

2. Evaluación Agronómica

De los 261 genotipos evaluados en un 1er ensayo comparativo, se seleccionaron un total de 60 subclones para ser incorporados al 2do ensayo comparativo. En este ensayo 16 subclones presentaron características sobresalientes en rendimiento y tolerancia a las principales enfermedades del cultivo (Cuadro 3).

Cuatro de los clones evaluados (6,6%) dieron rendimiento en t de caña ha-1 similares a los testigos en plantilla (B67-49 y PR980) y cinco clones (8,3%) con valores de Pol % en caña similares a los de variedad de origen B67-49. Estos resultados indican aún cuando el comportamiento agronómico de los subclones fue variable, un 26,6% de los clones evaluados en el 2do ensayo comparativo mantuvo características de rendimiento y adaptabilidad similares a los de la variedad de origen. Los cambios generados en estas plantas producto de la radiación, no afectaron las características de rendimiento y productividad de la variedad de origen, la B67-49.

Al evaluar el comportamiento agronómico de dos somaclones PR62-258, resistentes al virus del mosaico Oropeza y García (1996), encuentran que el comportamiento de las plantas a los 9 meses de cultivo fue similar a la variedad de origen en las características siguientes: grosor del tallo, número de tallos secundarios y grados Brix, sin embargo, observaron que la altura de los tallos fue significativamente menor.

La inducción de mutaciones en plantas de caña de azúcar ha permitido la selección de variedades resistentes a enfermedades como el carbón Ustilago scitamineae (Suni et al., 1984) y ha sido incorporada a programas de mejoramiento para suprimir la floración (Prida y Preecha, 1984), también se ha señalado que el estudio de mutaciones morfológicas, como es la presencia de múltiples yemas, que se considera ventajosa para la supervivencia de la yema y producción de plantas por unidad de área (Burner y Legender, 1998), pueden ser incorporada en programas de mejoramiento de este cultivo. En este caso, el uso de mutaciones en la obtención de clones resistentes al SCMV-B ha permitido además mantener las características de rendimiento de la variedad de origen, en seis de las plantas regeneradas, sin la presencia de características morfológicas o fisiológicas indeseables.

Los primeros síntomas (clorosis en las hojas más jóvenes) de la enfermedad se observaron la 3ra semana después de la aplicación del inóculo. A las 12 semanas se observaron síntomas severos (clorosis en todas las hojas y enrollamiento de los bordes). La variedad sorgo Maracay, mostró síntomas muy severos de la enfermedad con necrosis foliar.

Se pudo observar que solamente cinco subclones B67-49 y un subclón PR62-258, mostraron síntomas de la enfermedad (Cuadro 4), considerando los resultados obtenidos por Rea et al. (1994) y Oropeza y García (1996), quienes encontraron que el SCMV está presente únicamente en las plantas que muestran síntomas de la enfermedad, se puede señalar que la resistencia al virus del mosaico observada en los subclones asintomáticos durante todo el proceso de evaluación en campo, es producto de un cambio genético inducido por la radiación. A este respecto, Oropeza y García (1996), aún sin el uso de radiación y sólo como producto de la variación somaclonal, señalan la obtención de dos variantes resistentes al virus del mosaico y confirman la no presencia de partículas virales en estas plantas, lo que demuestra la característica de resistencia a esta enfermedad.

Las diferencias de los productos de RAPDs utilizando para la amplificación el iniciador OPM20 (Figura 2), permitieron detectar la separación entre los quince genotipos mutantes y cultivar B67-49.

Los productos de PCR obtenido con el iniciador OPM-14 (Figura 2) exhiben un fragmento de 854 pares de bases que puede ser usado para caracterizar los quince clones resistentes a SCMV obtenidos por mutaciones (2-21-19, 2-23-08, 2-25-28, 2-25-62, 2-29-04, 2-31-06, 2-32-06, 2-32-23, 2-32-28, 2-32-46, 2-32-49, 2-32-67, 2-34-06, 2-34-31 y 2-34-36). Este segmento no está presente en el cultivar B67-49 susceptible al virus. Estos resultados son similares a los obtenidos por Oropeza y García (1996), quienes encuentran una banda de 874 bp en somaclones de caña de azúcar que mostraron resistencia al virus del mosaico, la cual no fue observada en el cultivar PR62258 susceptible a esta enfermedad. Estos autores utilizaron el iniciador OPA04 para obtener los productos de PCR.

Las diferencias detectadas entre los genotipos mutantes y el genotipo del cultivar B67-49 que los originó a través de irradiación gamma corrobora las diferencias detectadas en campo con respecto a la resistencia a SCMV de los mutantes.

El análisis usando iniciadores para la amplificación aleatoria de segmentos de ADN diferencia eficientemente clones de caña de azúcar resistentes al SCMV generados por mutaciones inducidas de su progenitor cv B67-49 susceptible a dicha enfermedad. Esto confirma que las variaciones agronómicas, morfológicas y fisiológicas observadas durante los ensayos de campo en los subclones al compararlos con la variedad de origen, se deben a cambios genéticos producidos por el tratamiento mutagénico, que en todas las plantas seleccionadas corresponde a la dosis de 2 Kr.

- Los resultados obtenidos durante el proceso de evaluación de los subclones de caña de azúcar, permiten señalar que se trata de plantas con un comportamiento diferente a la variedad de la cual se originaron.

- Las diferencias se observan en un alto porcentaje de plantas, en la respuesta a la presencia de agentes patógenos como el virus del mosaico, al mantenerse la característica de resistencia a esta enfermedad luego de ser inoculadas nuevamente con la raza B de este virus.

- Los 16 subclones seleccionados después de 8 generaciones de propagación vegetativa, mantienen características de rendimiento como t de caña ha-1 y Pol% en caña, similares a las de B67-49.

- Aún cuando, un porcentaje muy bajo de estas plantas mostraron cambios en su morfología, los estudios de caracterización molecular realizados, demostraron que existen cambios genéticos en ellas, al compararlas con B67-49, los cuales se atribuyen al efecto de la radiación.

- Estos resultados sugieren la posibilidad de que al finalizar el proceso de selección en campo (ensayos replicados y regionales) se pueda contar con al menos una planta que mantengan buenas características de rendimiento y adaptabilidad, es decir con una nueva variedad, mutante de la B67-49.

Al Instituto Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (IVIC) por su colaboración en la irradiación de los callos. Al personal técnico del programa varietal del INIA-Yaracuy: Anfer Ortiz, Milagros Niño y Jose George, por la colaboración prestada en la evaluación y toma de muestra de las plantas.