Aplicación de la proteómica comparativa para la identificación de proteínas en phaseolus vulgaris asociadas a resistencia a plagas

Carolina Bernal* Ivan Galindo*, Delis Pérez** y Nardy Diez*

Trabajo financiado parcialmente por el Subproyecto FONACIT-BID II Nº 2004000410.

* Instituto Fundación de Estudios Avanzados (IDEA). Centro de Biotecnología, Lab. de Genómica y Proteómica. Carretera Hoyo de la Puerta, Sector Monte Elena, Baruta, Caracas 1080.

** Investigadora. INIA. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP). Zona Universitaria, Av. Universidad, vía El Limón. Apdo. 4653. Maracay 2101,  estado Aragua Venezuela.

RESUMEN

Los coleópteros de la familia bruchidae representa uno de los más importantes riesgos que enfrentan los agricultores de caraota, Phaseolus vulgaris, la infección por esta plaga disminuye el rendimiento de los cultivos y la calidad del grano afectando así la producción y costos de este rubro alimentario que forma parte importante de la dieta tradicional de muchos países. Varios autores han descrito un posible efecto insecticida asociado a la presencia de proteínas de almacenamiento de la familia de las lectinas (Phytohemagglutinins, PHA; Arcelin, Arc; and α-amylase inhibitor, αAI), pudiendo ser la presencia de estas una forma muy efectiva para colaborar con el control de plagas que atacan a muchas variedades de P. vulgaris durante su almacenaje. Algunos investigadores han centrado su atención en el análisis de estas proteínas, abordándolas de forma individual, sin tener en cuenta las posibles interrelaciones funcionales que pueden existir entre ellas. El presente trabajo utiliza la proteómica para analizar la presencia de proteínas en diferentes variedades cultivables de P. vulgaris, y con el uso de las electroforesis bidimensionales junto a la inmunodetección de proteínas insecticidas específicas se plantea una estrategia interesante para simplificar un proceso inicial de correlación entre la expresión de ciertas lectinas y los fenotipos observados con resistencia a los bruquidios.

Palabras Clave: Phaseolus vulgaris; proteómica; lectinas; arcelinas; resistencia a plagas; caraota.

Application of comparative proteomics to identify proteins in phaseolus vulgaris associated with pest resistance

SUMMARY

The attack of coleopteran from the bruchidae family represent one of the most important risks that farmers confront, lowering crop yield and bean quality of Phaseolus vulgaris, and affecting the production costs of this important food staple in many traditional diets. Several authors describe the presence of storage proteins from the lectins family (Phytohemagglutinins, PHA; Arcelin, Arc; and α-amylase inhibitor, αAI) as insecticidal proteins, representing a very effective means to control pest attacks during storage on many varieties of P. vulgaris. However, these investigations focus their analysis on one protein at a time, without taking into account their functional interrelationships. The present work is aided by proteomics to analyze insecticidal protein expressions in various cultivated P. vulgaris varieties. The use of 2D-immunedetection of specific insecticidal proteins has shown to be a simplified procedure to initially establish functional correlations between this group of proteins and the observed bruchid resistance phenotype.

Key Words: Phaseolus vulgaris; proteomics; lectines; arcelines; pest resistance; black beans.

RECIBIDO: febrero 20, 2006.

INTRODUCCIÓN

El ataque de coleópteros de la familia bruchidae (Zabrotes subfasciatus, Acanthocelides obtectus y Callosobruchus maculatus) afecta la producción de caraota, Phaseolus vulgaris al provocar importantes pérdidas en los granos durante su almacenamiento. Algunos estudios han relacionado la presencia de ciertas proteínas de la familia de las lectinas, tales como las fitohemaglutininas (PHA), Arcelinas (Arc) e inhibidor de la α-amilasa (IαA), con una actividad insecticida en diferentes variedades de este rubro (Osborn et al., 1988; Chrispeels y Raikhel, 1991; y Lioi et al., 2003), pero se han centrado principalmente en el análisis individual de cada una de ellas. En el presente trabajo se utiliza la proteómica como una herramienta para estudiar las relaciones en la expresión de estas proteínas de resistencia en diversos materiales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizaron extracciones de proteínas de los endospermos de diversos materiales de P. vulgaris en Buffer borato de sodio 20 mM pH 9, incubando 1g de harina a 37 ºC durante 1 hora, en presencia de inhibidores de proteasas. Se centrifugó la mezcla a 14.000 rpm por 15 min y se tomaron los sobrenadantes. Para la determinación de proteínas de los extractos se utilizó el método de Bradford (1976). Se realizaron electroforesis SDS-PAGE al 12% (Laemmli, 1970) y electroforesis bidimensionales en el rango de pH NL 3-10 y SDS-PAGE al 12% teñidos con plata.

Para el análisis por inmunoensayo se realizó la transferencia de los geles bidimensionales a membranas de nitrocelulosa y se revelaron de acuerdo a la metodología descrita por Brunette (1981), empleando un antisuero de conejo específico contra Arcelinas, PHA e IαA (1:6000), y como anticuerpo secundario IgG anti-conejo unido a peroxidasa.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El resultado de la extracción de proteínas de un total de 32 accesiones de P. vulgaris provenientes del Banco de germoplasma del INIA-CENIAP (Maracay), fueron separadas mediante electroforesis SDS-PAGE 12%, permitiendo una primera selección de dos materiales con base en los patrones unidimensionales que arrojaron estos granos. Se realizaron las electroforesis bidimensionales de ambos materiales y se procedió a un análisis más específico de las proteínas de interés realizando la inmunodetección con un antisuero que permite evidenciar la presencia y patrón de expresión de las fitohemaglutininas (55-65 kDa), arcelinas (31-40 kDa) e inhibidor de α-amilasa (15–18 kDa) presentes.

Los resultados alcanzados permitieron obtener los proteomas correspondiente a las muestras seleccionadas de P. vulgaris, donde se hacen evidentes diferencias globales entre el total de proteínas reveladas en geles bidimensionales para cada muestra, así como proteínas o grupos de proteínas presentes en un material y ausentes en el otro (Ver Figura).

Por otra parte, el inmunoensayo sobre los geles bidimensionales permite una rápida evaluación de un conjunto de proteínas a las que se les asocia una actividad insecticida y que pertenecen a la familia de las lectinas. Este estudio comparativo permitió, de una manera sencilla, abordar el análisis integral de estas proteínas insecticidas en P. vulgaris, procedimiento éste que podría erigirse como una estrategia útil para relacionar la presencia o expresión diferencial de estas lectinas con la resistencia o susceptibilidad a plagas durante el almacenamiento del grano.

AGRADECIMIENTO

Los autores agradecen la colaboración del Dr. Roberto Bollini del Instituto de Biología y Biotecnología Agraria (Milan, Italia) quien gentilmente suministró el antisuero contra la familia de lectinas utilizado para los inmunoensayos en este trabajo.

BIBLIOGRAFÍA

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