Caracterización isoenzimática de aislados de Trichoderma spp.

Isoenzymatic characterization of isolated from Trichoderma spp.

Luis A. Salazar*, Glenda Y. Aponte*, Nelly H. Sanabria**, Efraín Salazar* y Luis Castro***

*Investigadores y ***TAI, respectivamente. Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA). Unidad de Protección Vegetal. Laboratorio de Bacteriología, Micología y Biotecnología Agrícola. Maracay, estado Aragua. Venezuela.

**Profesora. Universidad Central de Venezuela (UCV). Facultad de Agronomía. Instituto de Botánica Agrícola. Apdo. 4579. Maracay, estado Aragua. Venezuela. Correo electrónico: luisagronomia@gmail.com; gaponteve@gmail.com; salabrian@cantv.net; efra63@gmail.com

RESUMEN

Recientemente se ha demostrado que las técnicas isoenzimáticas son de gran apoyo a los criterios morfológicos tradicionales para la clara delimitación dentro y entre especies, así como la relación que existe en las pruebas patogénicas y electroforéticas de los microorganismos. La investigación tuvo como objetivo implementar el uso de técnica de isoenzimas para caracterizar la variabilidad genética de aislados de Trichoderma spp. Se emplearon diez aislados del género Trichoderma, entre ellos: T. harzianum, T. koningiopsi, T. longibrachiatum y T. atroviride provenientes del sur en el estado Aragua y al norte en el estado Guárico. Se evaluaron doce sistemas isoenzimáticos: alfa y beta esterasa, alcohol deshidrogenada, malato deshidrogenada, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, peroxidasa, glutamato oxalacetato transaminasa, isocitrato deshidrogenasa, enzima málica, glucofosfo isomerasa, glutamato deshidrogenasa. Asimismo, se realizó un cluster utilizando métricamente la distancia de similaridad de Jaccard, los datos se analizaron aplicando el programa Past®, Versión 1.55. Según los patrones electroforéticos para isoenzimas existe variabilidad en los aislados debido a la formación de cuatro grupos que corresponden a las localidades de colectas y no a las especies de Trichoderma evaluados. El análisis de agrupamiento (cluster) reveló la formación de aislados en cuatro grupos: I y II procedente del estado Aragua; el III proveniente de zonas de producción de los estados Guárico y Aragua; el IV originario del estado Guárico.

Palabras Clave: electroforesis; isoenzimas; variabilidad genética.

SUMMARY

Recently it has been shown that the techniques are highly isozyme support traditional morphological criteria clearly delineated within and between species, as well as the relationship between pathogenic and electrophoretic tests among these microorganisms. The research aimed to implement the use of isozyme technique to characterize the genetic variability of isolates of Trichoderma spp. Were used Trichoderma isolates including: T. harzianum, T. koningiopsi, T. longibrachiatum and T. atroviride from southern Aragua State and northern Guárico State. Isozyme twelve systems were evaluated: alpha and beta esterase, alcohol dehydrogenase, malate dehydrogenase, alkaline phosphatase, acid phosphatase, peroxidase, glutamate oxaloacetate transaminase, isocitrate dehydrogenase, malic enzyme, glucofosfo isomerase, glutamate dehydrogenase. Cluster was performed using as a metric distance (the distance of Jaccard similarity), the data is analyzed using Past® Version 1.55. According to the isoenzyme electrophoretic patterns there is variability in the isolates, this due to the formation of four groups corresponding to the locations of collections and not evaluated Trichoderma species. Cluster analysis (cluster) revealed the formation of 4 groups. I and II, formed by isolates from of Aragua State. The III, composed of the isolated from production areas Guárico and Aragua States, consisting of Group IV isolates from Guárico State.

Key Words: electrophoresis; genetic variability; isoenzyme.

RECIBIDO: junio 26, 2012 APROBADO: abril 02, 2013

INTRODUCCIÓN

La clasificación de los hongos está basada principalmente en las características morfológicas relacionadas con hifas vegetativas, estructuras de reproducción asexual y sexual, color, forma y septación de las esporas. El uso de caracteres morfológicos para clasificar hongos a nivel de especie es tradicional y vigorosamente definido (Sanabria, 1998). Sin embargo, la técnica isoenzimática provee un medio bioquímico aceptable para distinguir especies de Aspergillus (Nealson y Garben, 1967; Peronosclerospora (Micales et al., 1988); Colletotrichum (Gantoti y Davis, 1993), entre otros. Estos autores señalan que el análisis de isoenzimas representa una herramienta útil para el estudio de la variabilidad genética intraespecífica de los hongos fitopatógenos.

En Venezuela se realizaron estudios electroforéticos que permitió establecer diferencias y semejanzas entre las especies por Fusarium oxysporum y F. verticillioides (Sanabria 1998; García 2011). Asimismo, se logró identificar la raza dos por F. oxysporum f. sp. lycopersici presente en siembras de tomate en zonas de producción de los estados Aragua y Guárico (norte), presentando variabilidad interna (Lugo, 1998).

Recientemente, varios investigadores demostraron que las técnicas isoenzimáticas son de gran apoyo a los criterios morfológicos tradicionales para la clara delimitación dentro y entre especies, así como la relación que existe en las pruebas patogénicas y electroforéticas de estos microorganismos (Magnano et al., 1995).

Las cepas de Trichoderma se diferencian entre sí por los niveles de expresión de las enzimas hidrolíticas, lo cual determina sus características antagónicas. Trichoderma puede parasitar la hifa del hongo fitopatógeno mediante enrollamientos, ganchos y cuerpos de tipo apresorios que penetrando la pared celular por la acción hidrolítica de las enzimas quitinasas y glucanasas. Ésto es posible porque la pared celular de los hongos fitopatógenos como Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani y Pythium spp., está compuesta principalmente por β-1.3-glucanos y quitina, con celulosa encontrada en los Oomycetes, como Pythium spp. (González, 2012).

En esta investigación se implementó el uso de la técnica de isoenzimas para caracterizar la diversidad genética de aislados de Trichoderma spp., así como evaluar su efectividad en el control de la fusariosis del tomate y el grado de agresividad que presenten en cada una de estas pruebas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los análisis isoenzimáticos se llevaron a cabo en la Unidad del Biotecnología del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA – CENIAP) en Maracay.

Aislamiento e identifi cación de Trichoderma spp.

Los aislados de Trichoderma spp. utilizados en todas las pruebas fueron obtenidos en zonas de producción de cultivos de tomate, sorgo y cebolla del sur del estado Aragua y al norte del estado Guárico. Se colectó 1 kg de suelo aproximadamente, cerca de la rizosfera de estas plantas, donde el mismo estuvo en condiciones de humedad a capacidad de campo.

En el Cuadro 1 se muestra el tipo de cultivo presente en el lugar y las localidades donde se colectaron las muestras de suelo que posteriormente son procesadas para aislar Trichoderma spp. De los aislados obtenidos, ocho se colectaron durante esta investigación y dos corresponden a los productos ofrecidos por casas comerciales para el control biológico de enfermedades en plantas.

Procesamiento de las muestras de suelos para aislar Trichoderma spp.

Seguidamente de la colecta bajo condiciones de laboratorio se tomaron 10 g de suelo de cada uno de los sitios colectados y se le agregaron 90 ml de agua destilada estéril (ADE) contenidos en una erlenmeyer, siendo ésta la solución madre.

Luego se realizaron diluciones en tubos de ensayo con 9 ml de ADE, a las cuales se le agregaron 1 ml de la solución madre para obtener diluciones de 10-2, 10-3 y 10-4; de cada dilución se colocó 1 ml en platos de Petri de 100 x 15 mm de dimensión.

Por último, se les agregó 15 ml de medio de cultivo de papa dextrosa agar (PDA), se extendió cada una de las diluciones en el plato correspondiente, realizando por cada dilución cuatro réplicas, estas se colocaron a incubar a 28 °C, por un lapso de 24 a 48 h, tomándose parte del crecimiento del hongo y se sembró en cultivos unicelulares para la obtención del cultivo puro y a partir de allí replicar.

Los aislados comerciales estaban en presentación sólida (liofilizado), se multiplicaron en medio de cultivo PDA y se incubaron a la misma temperatura que los aislados colectados, con la fi nalidad de obtener la colonia del hongo para las posteriores pruebas.

Identificación de las especies de Trichoderma utilizadas

Una vez alcanzados los aislados puros, se procedió a su identificación taxonómica a nivel de especie, considerando las características fundamentales descritas por Rifai (1969) y Bisett (1991 a, b, y c).

Extracción de proteínas

La preparación del tejido y la extracción de proteínas se hizo mediante una modificación de los protocolos descritos por Bonde et al. (1991), Marlatt et al. (1996) y Sanabria, 1998.

Se utilizaron colonias puras de cada uno de los aislados cultivados durante 7 d en medio de cultivo PDA. A partir de éstas, se trasladaron tres secciones tomadas con la punta de una micropipeta de cada colonia en ocho frascos que contenían 50 ml de un medio de cultivo líquido de caldo papa – dextrosa y se colocaron por 4 d en agitación continua a temperatura entre 26 y 28 °C. El micelio formado se destiló al vacío en un papel de filtro Watman N° 1, se hizo un lavado con ADE secándolo con papel de filtro y se colocó en congelación.

Para obtener el extracto proteico, el micelio congelado fue macerado en un mortero adicionándole tampón de extracción Tris – Glicina a pH 8,3 en una proporción de 3:1 (g de micelio/ml de buffer). El macerado se realizó en morteros fríos colocados en una cama de hielo.

Una vez obtenido el extracto, se centrifugó la suspensión a 18 000 rpm por 10 min en una centrifuga Sorvall rotor SS-34. Luego se colectó el sobrenadante y se mantuvo en congelación hasta el momento de realizar la corrida electroforética.

Preparación de las muestras

Para la separación electroforética las muestras se prepararon adicionando 120 μl del extracto (sobrenadante), 5 μl de azul de bromofenol al 1% y 50 μl de glicerol al 85%.

Preparación del gel

Los geles se elaboraron de acuerdo a una modificación de los métodos descritos por (Marlatt et al., 1996). La separación electroforética se realizó en una cámara Sigma minidual vertical, se empleó un sistema discontinuo de geles de poliacrilamida con un gel concentrador al 5% y un gel separador al 10%, de 1 mm de espesor cada uno.

Una vez polimerizados los geles, se colocaron en la cubeta de la cámara electroforética y se le adicionó el buffer Tris – Glicina, a pH 8,3 como buffer de corrida añadiendo por carril 10 μl de cada una de las muestras.

Electroforesis y visualización enzimática

La separación electroforética se realizó a un voltaje constante de 100 V y 80 mA de corriente a 4 °C durante 3 h. Las bandas de las isoenzimas se visualizaron sumergiendo los geles en una solución de tinción específi ca para cada sistema de isoenzimas, evaluando 12 isoenzimas (Cuadro 2). La tinción se realizó en oscuridad y posteriormente el gel se lavó con ADE y se procedió a interpretar los zigmogramas.

Interpretación de los geles

El registro de las bandas fue de naturaleza cualitativa, registradas en un código binario (bandas: 0 ausente y 1 presente). Esta información se adquirió para cada banda del sistema enzimático de los aislados. A partir de esta información se generó una matriz binaria que permitió establecer los patrones electroforéticos para cada aislamiento. Las corridas de los aislados se realizaron por duplicado. El análisis de agrupamiento (cluster) se utilizó como distancia métrica para la similaridad de Jaccard y los datos se analizaron utilizando el programa Past®, Versión 1.55.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Identificación de las especies de Trichoderma utilizadas

Las características de los aislados correspondieron a la descripción taxonómica dada por Rifai (1969) y Bissett (1991ª, 1992b y 1991c), en el Cuadro 3 se muestran cada uno de los aislados identificados a nivel de especie, ubicándolas de la siguiente manera: cuatro se relacionó a T. harzianum, cuatro con T. koningiopsi, uno para T. longibrachiatum y uno correspondió a T. atroviride.

Caracterización isoenzimática de los aislados de Trichoderma spp.

De los 12 sistemas isoenzimáticos evaluados, solo seis indicaron polimorfismos en el revelado de las bandas, siendo éstos α-esterasa, ß-esterasa, malato deshidrogenasa, fosfatasa alcalina, alcohol deshidrogenasa y fosfatasa ácida.

El número de bandas en los geles varió según el sistema isoenzimático utilizado, para las α-esterasas se obtuvieron cinco bandas (Figura 1), para las ß-esterasas seis bandas (Figura 2), la malato deshidrogenasa reveló cuatro bandas (Figura 3), la fosfatasa alcalina siete bandas (Figura 4), la alcohol deshidrogenasa tres bandas (Figura 5) y para la fosfatasa ácida cuatro bandas (Figura 6).

Estos resultados concuerdan con los reportados por Grondona et al. (1997), quienes realizaron una caracterización isoenzimática a 15 aislados de T. harzianum, obteniendo para el caso de la fosfatasa ácida un revelado de seis bandas, cinco para la fosfatasa alcalina, la malato deshidrogenasa reveló 15 bandas.

El sistemas isoenzimático α -esterasa, reveló al menos una banda para cada aislado, en el caso de las ß-esterasas, no se detectó presencia de bandas en A1, G7 y H8. La malato deshidrogenasa no obtuvo actividad enzimática en B2, D4 y G7 y para la fosfatasa alcalina no se detectó actividad en C3 y D4. Grondona et al. (1997) señalan que algunos aislados no presentaron actividad enzimática. Estos resultados indican que la técnica isoenzimática pudo identifi car todos los aislados evaluados, demostrando que con seis sistemas utilizados para cada aislado se logró un perfil de bandas de isoenzimas característico, lo cual se convierte en su identificación isoenzimática y se presenta en el Cuadro 4.

El análisis de agrupamiento (cluster), utilizando como distancia métrica la distancia euclidiana, reveló la formación de cuatro grupos (Figura 7). Grupo I formado por los aislados H8, G7 y J10, procedente del estado Aragua. Grupo II derivado por el I9, estado Aragua. Grupo III conformado por los F6 y E5 exhibieron igual coeficiente de similaridad, siendo estos pertenecientes a las especies Trichoderma atroviride y Trichoderma koningiopsi, lo cual signifi ca que estos aislados guardan información común en su constitución genética. Los aislados A1, B2, C3 y D4 pertenecientes al grupo IV provienen de zonas de producción del estado Guárico, a excepción del aislamiento C3, al cual no se le conoció su procedencia. Estos resultados sugieren que la población es genéticamente heterogénea.

De lo resultados mostrados anteriormente, se puede inferir mediante el análisis de los sistemas isoenzimáticos, que los aislados se agrupan según la zona geográfica de donde fueron aislados, y no según la especie taxonómica a la cual pertenecen o al grado de agresividad que puedan tener para controlar un patógeno en particular. Este fenómeno pudiera deberse a lo señalado por Lugo (1998), quien indica que pudieran existir varias causas, por ejemplo, las características morfológicas que están altamente influenciadas por el ambiente, pudiera deberse a que los genes de variabilidad isoenzimática presentan baja correspondencia con la variabilidad de los genes para las características morfológicas.

Asimismo, Grondona et al. (1997) evaluaron 15 aislamientos de T. harzianum colectados de diferentes países del continente Europeo, encontraron variabilidad a nivel isoenzimático y molecular y señalan que estas diferencias pudieran deberse al medio ambiente o a las condiciones ecológicas de donde se colectó el aislado.

Hermosa et al. (2000) consideran que las condiciones del ambiente son importantes en el momento de seleccionar un biocontrolador, aunado a las evaluaciones taxonómicas, para así, mejorar el aprovechamiento de la especie a utilizar.

También señalan que mediante la secuenciación y amplificación de ADN ribosomal lograron analizar filogenéticamente 33 especies del género Trichoderma provenientes de diferentes partes del mundo.

Por su parte, Stasz et al. (1989) usaron isoenzimas para evaluar las relaciones morfológicas y filogenéticas entre especies del género Trichoderma y Gliocladium, encontrando que existe correlación entre ellas, evidenciando un alto número de alelos que pueden ser el resultado de cambios genéticos entre los aislados.

El análisis de isoenzimas fue utilizado para estudiar el efecto que puede generar el ambiente sobre la diversidad genética de una población de hongos, tal es el caso de Micales et al. (1988) quienes señalan que mediante análisis de componentes principales y análisis de cluster con isoenzimas en el hongo Suillus tomentosus (Kauffman) Singer, Snell and Dick, obtuvieron que el hábitat y la selección del hospedador puede ser el responsable de la variación genética de este hongo en la mayoría de las regiones forestales.

CONCLUSIÓN

- A través de la técnica isoenzimática se pudo identificar a todos los aislados evaluados, por tanto, con los seis sistemas evaluados que presentaron polimorfismos se obtuvo un perfil de bandas de isoenzimas característico para cada uno, de esta manera este patrón se convierte en la identificación isoenzimática para estos aislados.

- Mediante el análisis de los sistemas isoenzimáticos se reveló un agrupamiento más cercano a la zona geográfica de donde fueron aislados que a la especie taxonómica a la cual pertenecen o al grado de agresividad que puedan tener para controlar un patógeno en particular

- El ambiente juega un papel importante en el comportamiento de los aislados de Trichoderma, lo cual nos permite inferir qué especie debemos utilizar en el momento de aplicar en una zona de producción agrícola determinada y de esta forma garantizar el éxito en cuanto al desarrollo y colonización, posteriormente su efecto inhibitorio en los patógenos que deseamos controlar.

BIBLIOGRAFÍA

1. Bissett, J. 1991a. A revision of the genus Trichoderma II. Intrageneric classification. Canadian Journal of Botany 69:2.357-2.372.         [ Links ]

2. Bissett, J. 1991b. A revision of the genus Trichoderma III. Section Pachybasium. Canadian Journal of Botany 69:2.373-2.414.

3. Bissett, J. 1991c. A revision of the genus Trichoderma IV. Aditional notes on section Longibrachiatum. Canadian Journal of Botany 69:2.418-2.420.

4. Bonde, M., G. L. Peterson and J. L. Y. Maas. 1991. Isozyme comparisons for identification of Colletotrichum species pathogenic to strawberry. Phytopathology 81:1.523-1.528.

5. Gantoti, B. and M. Davis. 1993. Pectic zymogram analysis for characterizing genetic diversity of the mango anthracnose pathogen. Acta Horticulturae 341:353-359.

6. García, J., A. Trigos, L. Andreu, N. Estevez y M. Luna. 2011. Variaciones Isoenzimática y Patogénica de Fusarium spp., asociadas con la pudrición de tallo y raíz de vainilla. Tropical and Subtropical Agroecosystems 13:299-306.

7. González, I., D. Infante, B. Martínez, Y. Arias, N. González, Ll. Miranda y B. Peteira. 2012. Inducción de quitinasas y glucanasas en cepas de Trichoderma spp., promisorias como agentes para el control biológico. Biotecnología Aplicada 29:7-11.

8. Grondona, I., M. R. Hermosa, M. Tejada, M. D. Gomis, P. F. Mateos, P. D. Bridge, E. Monte and I. Garcia-Acha. 1997. Physilogical and biochemical characterization of Trichoderma harzianum, a biological control agent against soilborne fungal plant pathogens. Applied and Environmental Microbiology 63:3.189-3.198.

9. Hermosa, M. R., I. Grondona, I. A. Iturriaga, J. M. Díaz- Minguez, C. Castro, E. Monte and I. Garcia-Acha. 2000. Molecular characterization and identification of biocontrol isolates of Trichoderma spp. Applied and Enviromental Microbiology. American Society for Microbiology 66(5):1 890-1 898.

10. Lugo F., Zunilde C. 1998. Identifi cación de razas de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Sacc) Snyder & Hansen procedentes de algunas zonas productoras del estado Aragua y norte de Guárico. Tesis de Maestría. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía. Maracay 101 p.

11. Magnano, G., F. Scala and Q. Michelli. 1995. Moderne tecnichnique diagnostiche in mycologie phytopathology. Petria 5:53-90.

12. Marlatt, M., J. Correll and P. Kaufman. 1996. Two genetically distinct populations of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici race 3 in the united Stated. Plant Disease 80:1 336-1 342.

13. Micales. J. A, R. M. Bonde and G. L. Peterson. 1986. The use of isoenzymes analisis in fungal taxonomy and genetics. Mycotaxon 27:405-449.

14. Micales, J. A., R. M. Bonde and G. L. Peterson. 1988. Izoenzyme analysis and aminopeptidase activities within the genus Peronosclerospora. Phytopathology 78:1 396-1 402.

15. Nealson, K. and E. Garber. 1967. A electrophoreses survey of esterases, phosphatases and lemineaminopectidasas in micelial extracts of species of Aspergillus. Mycología 59:330-336.

16. Rifai, M. A. 1969. A revision of the genus Trichoderma. Mycological paper N° 116.

17. Sanabria de, A. N. 1998. Serología y electroforesis para identificación de tres especies de Fusarium. Tesis de doctorado. Maracay, Ven. Universidad Central de Venezuela 102 p.

18. Stasz, Nixon, G. Harman and F. Weeden. 1989. Evaluation of phonetic species and phylogenetic relationships in the genus Trichoderma by cladist analysis of isoenzyme polymorphism. Mycologia 81:391-403.