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Introducción
Stevia se deriva de la Stevia rebaudiana, una planta herbácea perenne nativa de Paraguay y Brasil. Es utilizada para conferir sabor dulce, debido a su contenido de glucósidos de esteviol entre los cuales destacan el esteviósido y rebaudiósido A presentes principalmente en la hoja de la planta que poseen un dulzor 200-300 veces mayor que la sacarosa 1,2,3. Los glucósidos de esteviol de alta pureza son considerados GRAS por sus siglas en inglés que significa generalmente reconocido como seguro 4. No así para la hoja de stevia y los extractos de stevia crudos los cuales no se consideran GRAS y no cuentan con la aprobación de la Food and Drug Administration para su uso en alimentos (FDA, 2018). Se ha establecido una ingesta diaria aceptable de glucósidos de esteviol de 4 mg/kg/día 1,5; respecto al metabolismo de los glucósidos de esteviol no se ha descrito acción enzimática que actúe sobre ellos ni demuestre que son absorbidos por el tracto gastrointestinal alto, solo las bacterias del colon logran descomponerlos 6,1.
El uso de la stevia dentro de la industria alimentaria aun no es tan extenso como se esperaba, esto debido a que no posee propiedades de sabor tan deseables como la sacarosa, lo cual se ha atribuido a la afinidad que presenta con los receptores hT2R4 y hT2R14 que provocan un sabor amargo 1. El objetivo del uso de la stevia inicialmente fue reducir el aporte calórico proveniente de endulzantes, sin embargo, en los últimos años su consumo se ha asociado a efectos antidiabético, antihipertensivo, antiinflamatorio y diurético 7,1; así como un efecto en la disminución de la ingesta de alimento y peso corporal, resultados obtenidos principalmente en modelos murinos machos. Al respecto, se ha observado que el suministro de extracto líquido de stevia a una dosis de 500 ppm produce una disminución sobre el peso corporal, ingesta de alimento, niveles de triglicéridos, colesterol total, colesterol de baja densidad y un aumento del colesterol de alta densidad en ratas macho con hipercolesterolemia inducida 8. Esta misma dosis demostró también un efecto positivo sobre los niveles de glucosa, hemoglobina glucosilada e incremento en la producción de insulina en ratas macho con diabetes mellitus inducida 9. Así mismo, una concentración del 0,2 % de stevia líquida de alta pureza mostró resultados similares en el peso corporal, ingesta de alimento y colesterol total en ratas macho sanas 10. Sin embargo, al utilizar stevia granulada de baja pureza, los resultados han mostrado un incremento en el peso corporal y resistencia a la insulina 11. Dado que la revisión de la literatura disponible sobre el tema arrojaba principalmente resultados en murinos machos, el presente estudio tuvo como objetivo determinar el efecto de la disponibilidad de stevia sobre el peso corporal, ingesta de alimento y parámetros metabólicos en ratas hembras de la cepa Wistar, así como realizar una predicción sobre el peso corporal y la ingesta de alimento a través del método de estimación «Nearest Neighbour Method for Time-Series» llamado también el k-NN, dicho método se ha utilizado en estudios para el análisis de alimentos mediante el uso de sentidos artificiales 12, clasificación de imágenes de alimentos 13 y factibilidad en el reconocimiento de alimentos 14.
Materiales y métodos
Animales
Se utilizaron 20 ratas hembras de dos meses de edad de la cepa Wistar que fueron divididas en dos grupos: control (CG, n= 10) y stevia (SG, n=10). A los dos grupos se les proveyó de agua y alimento a libre acceso; al grupo SG se le proporcionó solución de stevia al 0,2 % (extracto líquido de alta pureza) durante 13 semanas. Los animales se alojaron en cajas individuales y fueron mantenidos en ciclos de 12 horas de luz-obscuridad (7:00 am - 7:00 pm); con 22 +/- 1°C de temperatura ambiental. La manipulación de los roedores se realizó apegándose al manejo adecuado de los animales de laboratorio acorde a la NOM-062-ZOO-1999 sobre las especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio y la guía del cuidado y uso de animales de laboratorio del Consejo Nacional de Investigación 15. Adicionalmente se siguieron las recomendaciones de la Asociación Americana de Psicología sobre la investigación en modelos animales.
Procedimiento experimental
Se registró diariamente el consumo de agua, alimento y solución de stevia; el peso corporal se registró semanalmente. Una vez finalizadas las 13 semanas de experimentación se sacrificaron a los animales y se tomó una muestra de sangre, el suero se separó por centrifugación y se mantuvo a una temperatura de -70°C. Posteriormente, la muestra de sangre fue evaluada por espectrofotometría de absorción para la determinación de triglicéridos, colesterol y glucosa. Los niveles de insulina se cuantificaron mediante un ensayo de micro ELISA utilizando un procedimiento estandarizado que se basa en el kit de insulina DSL-10-1600 Active8482; y el kit de lectura BIO-ELISA.
Análisis estadístico
Los resultados se expresaron como medias y desviaciones estándar. Las diferencias entre los grupos y la relación de aumento de peso se calcularon mediante la prueba t de Student, se utilizó el software STATA / SE, versión 12,0 16. Se adoptó un nivel de significancia p <0,05. Posteriormente, se realizó un análisis predictivo del aumento de peso corporal a 20 semanas a través del método de estimación "Nearest Neighbour Method for Time-Series" llamado también k-NN. Este método se ha utilizado en varias aplicaciones, particularmente para tareas de clasificación 17. El método k-NN consiste en que las muestras con entradas similares tengan valores de salida similares. Se seleccionan los vecinos más cercanos, de acuerdo con la distancia euclidiana y sus valores de salida correspondientes se utilizan para obtener la aproximación de la salida deseada.
Para este análisis, la estimación de la salida de los datos de consumo de alimento, peso corporal y consumo de agua se calcularon promediando las salidas de los vecinos más cercanos: donde y representa la estimación (aproximación) de la salida, y j(i) es la salida del enésimo vecino más cercano de la muestra xi y k denota el número de vecinos utilizados. Las distancias entre las muestras están influenciadas por la selección de entrada. Entonces, los vecinos más cercanos y la aproximación de las salidas dependen de la selección de entrada. Además, para las salidas se utilizó un factor de innovación basado en la desviación estándar de todos los datos anteriores. Cuando el factor de innovación da positivo quiere decir que la tendencia del vecino anterior es descendente, y de lo contrario, es ascendente.
El k-NN es un método no paramétrico y solo se debe determinar k, el número de vecinos. La selección de k puede ser realizada por muchas estructuras de modelos diferentes. Se ha demostrado que el k-NN en sí mismo es un buen estimador para series de tiempo. En este documento, sin embargo, el k-NN no se usa como un estimador, sino como una herramienta para seleccionar el conjunto de entrada. Para este análisis se utilizó el software MATLAB versión 10.0 18.
Resultados
Se presentan los hallazgos del consumo de alimento, agua y stevia en 13 semanas. Posteriormente, se muestra el peso corporal, parámetros metabólicos y análisis predictivo del aumento de peso corporal a 20 semanas mediante el método de estimación k-NN.
Consumo de alimento, agua y solución de stevia
Existe una diferencia significativa en la ingesta de alimento entre el CG (14,71 g/día) y el SG (17,5 g/día), t= 16,77, p= de 0,000, r= 6,57 (Figura 1). Respecto al consumo de agua, el CG mostró una ingesta mayor (24,46 ml/día) y estadísticamente significativa t= 12,10, p= 0,000, r= 4,74 versus SG (18,3 ml/día) (Figura 2). En la figura 3 se muestra el consumo de stevia durante las 13 semanas de experimentación. Se observa un patrón de consumo estable.
Peso corporal
A continuación, se muestra la fórmula que se utilizó para el cálculo del porcentaje proporcional de cambio de peso durante las 13 semanas de experimento.
pf: Peso final
pi: Peso inicial
Se observó una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos (p< 0,0019) siendo el SG el que mostró una mayor proporción de ganancia de peso corporal (Tabla 1).
Tabla 1 T-Student entre la proporción de aumento de peso corporal de CG y SG
| Proporción | [95% IC] | |
|---|---|---|
| CG | 10,10±1,56 | 6,56 - 13,64 |
| SG | 17,29 ± 1,21 | 14,54 - 20,05 |
| p valor | 0,0019* |
CG = control, SG = stevia.
Parámetros metabólicos
El SG mostró una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de glucosa t= 2,54, p= 0,020, r= 1,13 y colesterol t= 2,39, p= 0,025, r = 1,06 respecto del CG. Mientras que en los niveles de triglicéridos e insulina no se encontraron diferencias significativas con respecto al grupo control (Tabla 2).
Tabla 2 Niveles de glucosa, insulina, colesterol y triglicéridos
| CG | SG | p | |
|---|---|---|---|
| Media ± DE | Media ± DE | Sig | |
| Glucosa (mg/dL) | 133,9 ± 6,95 | 160 ± 7,54 | 0,0203* |
| Colesterol (mg/dL) | 47,3 ± 2,48 | 64,7 ± 6,72 | 0,0259* |
| Insulina(mg/dL) | 12,07±1,13 | 12,34 ± 1,16 | 0,8694 |
| Triglicéridos (mg/dL) | 154,9 ± 19,87 | 161 ± 21,71 | 0,8382 |
CG = control, SG = stevia.
Consumo de alimento y peso corporal k-NN
Mediante el método de estimación no paramétrico k-NN se pudo predecir el consumo de alimento por 7 semanas más y se encontró que el SG mantendría un consumo elevado (Figura 4), lo cual tendría una repercusión directa en la proporción de ganancia de peso corporal tal como se muestra en la tabla 3, sin embargo, el resultado no fue estadísticamente significativo.
Figura 4 Consumo de alimento entre CG (gris) y SG (blanco) durante las 7 semanas proyectadas a través de k-NN. CG = control, SG = stevia.
Discusión
Diversos estudios sobre los efectos del consumo de stevia han reportado amplios beneficios como la reducción del consumo de alimentos y peso corporal, disminución de los niveles de insulina, glucosa, colesterol y triglicéridos entre otros parámetros metabólicos; sin embargo, estos estudios han utilizado en su mayoría murinos machos 8,9,10.Uno de los pocos estudios identificados en hembras 19 reportó que el consumo de stevia en diferentes concentraciones durante 12 semanas resultó en una disminución de la ingesta de alimento, menor ganancia de peso corporal y niveles inferiores de colesterol y triglicéridos. Resultados que difieren de lo reportado en la presente investigación. Otras investigaciones con respecto al consumo de stevia en ratas hembras estuvieron enfocadas en los efectos sobre la fertilidad y la toxicidad, concluyeron que la stevia no era tóxica y no afectaba la fertilidad de forma considerable, pocos evaluaron efectos sobre el peso corporal e ingesta de alimento sin obtener resultados contundentes 20,21. Sin embargo, en la presente investigación los resultados indicaron que las ratas prefirieron el consumo de stevia respecto del agua tal como se describió en un estudio previo 22; además se observó un incremento en la ingesta de alimento, peso corporal, niveles de colesterol y glucosa respecto de las ratas que consumieron agua, con cifras estadísticamente significativas. Al realizar la proyección por 7 semanas más mediante la prueba estadística k-NN, se observó una tendencia al aumento del consumo de alimento y peso corporal, no obstante, se pierde la significancia. Resultados de estudios realizados en ratas hembras en los cuales se utilizaron otros endulzantes como glucosa, sacarosa, fructosa y HFCS-55 no son concluyentes 23. Mientras que otros autores han reportado que la ingesta de algunos de estos endulzantes disminuye el consumo de alimento e incrementa el peso corporal con y sin modificaciones en los niveles de colesterol y triglicéridos 24. En otro estudio se ha encontrado que no hay efecto en la ganancia de peso independientemente de si el endulzante se consume líquido o sólido 25,26. Dentro de la investigación en seres humanos y los efectos del consumo de stevia, los resultados son poco contundentes debido a que se utilizan muestras pequeñas y periodos cortos de consumo además de existir amplia variación en las dosis suministradas. Al respecto un estudio realizado en 16 mujeres adultas reportó disminución de los niveles de colesterol, triglicéridos y lipoproteínas de baja densidad (LDL) tras un mes de consumo 27. Otro estudio indicó que el consumo de una precarga de stevia no provocó conductas ingestivas compensatorias tanto en personas delgadas (n=19) como obesas (n=12) 28. Sin embargo, un estudio realizado en 9 mujeres y 6 hombres adultos diabéticos demostró que el consumo de extracto de hoja de stevia 3 veces al día durante 15 días no disminuyó significativamente los niveles de glucosa en comparación con el fármaco metfomina 29. Otros diseños no experimentales han asociado el consumo de stevia con un peso corporal normal en jóvenes universitarios bajo el diseño de autoreporte 30. Una posible explicación de los resultados obtenidos en la presente investigación pudiera basarse en lo propuesto en un estudio en líneas celulares 5 para evaluar los efectos de dos de los principales glucósidos de stevia (esteviósido y rebaudiósido A) y su metabolito (esteviol). Se menciona que los glucósidos de esteviol poseen una estructura esteroidal que podría estar actuando como disruptor químico endocrino alterando el funcionamiento del sistema endocrino, dando como resultado efectos nocivos en la salud. De acuerdo con sus resultados, el esteviol incrementó los niveles de progesterona al mismo tiempo que interfirió en la trascripción de receptores a progesterona. La progesterona interfiere en la secreción de insulina y por lo tanto en la regulación de la glucemia además se ha encontrado una relación entre niveles altos de progesterona y aumento de peso corporal en ratas 31,32. Por lo anterior, se advierte que los efectos de la stevia continúan siendo contradictorios. Posiblemente, el estudio del metabolismo de la stevia pueda generar mayor certeza sobre su uso. Hasta ahora se puede advertir que la generación de esteviol parece actuar como un posible disruptor químico, situación que invita a seguir investigando al respecto dado que la mayoría de los consumidores de este edulcorante son mujeres.
Conclusiones
El consumo de stevia líquida de alta pureza en ratas hembras de la cepa Wistar incrementa la ingesta de alimento de forma sostenida, lo que derivó en un aumento del peso corporal relacionado probablemente con un balance energético positivo. También se identificaron alteraciones en los parámetros metabólicos de glucosa y colesterol, ambos indicadores de enfermedades crónico degenerativas. Por lo que utilizar otros métodos de análisis predictivo, como fue el caso del algoritmo k-NN, demuestra matemáticamente que mantener la disponibilidad de la bebida endulzada con stevia genera un incremento significativo en el consumo de alimentos y una tendencia en la ganancia de peso corporal que podrían llevar al deterioro de la salud. Esto indica que el consumo de stevia en ratas hembras parece tener efectos contrarios a lo observado en machos, por lo que resulta necesario el desarrollo de más estudios tanto en modelos animales como humanos que generen mayor certidumbre sobre el consumo de stevia y sus efectos.
