Materia vegetal

Se colectaron alrededor de 15 kg de fruta de cada una de las variedades de granada Wonderful (agridulce), Apaseo (dulce) y Tecozautla (dulce), las cuales se obtuvieron del Rancho la Herradura, Ciudad Guzmán Jalisco, México, ubicado a 19°41'52.8"N 103°30'19.1"W. El estudio se realizó entre octubre de 2021 y enero de 2023.

Elaboración y estandarización de mermeladas

Los frutos se lavaron con agua potable y posteriormente se desinfectaron sumergiéndolas en una solución de 2 ppm de hipoclorito de sodio, se utilizaron 3 kg de frutos de cada una de las variedades. Subsiguientemente, y por separado, se desgranaron los frutos y se extrajeron los arilos de cada una de las variedades, los cuales se molieron en una licuadora marca Oster. Seguidamente, los arilos molidos se mezclaron con sacarosa y jarabe de glucosa en proporción 60:20:20 w/w/w respectivamente, a los cuales, se les adicionó 1,50 % de pectina de alto metoxilo, 1 % de ácido cítrico y sorbato de sodio. A la mezcla se les determinaron los sólidos solubles totales disueltos (SST, °Brix) con un refractómetro digital automático Reichert AR200 y el pH con un potenciómetro Thermo scientifics K06202; después fueron sometidas a calentamiento utilizando baño maría a 75°C. hasta obtener una concentración final de SST de 64-66°Brix de acuerdo con la norma oficial ¹¹. Finalmente, las mermeladas fueron envasadas al vacío en frascos estériles de 200 ml (Figura 1).

Figura 1 Mermeladas, jugo concentrado y arilos deshidratados estandarizados de las variedades de granada Apaseo, Tecozautla y Wonderful. 

Obtención de arilos deshidratados

Se tomaron 3 kg de arilos de cada una de las tres variedades de granada, los cuales fueron sometidos a deshidratación en un horno deshidratador de acero inoxidable digital, marca Excalibur, con circulación de aire, a temperatura de 55°C durante 18 h, los arilos se dejaron a una humedad máxima de 10 % (Tabla 1).

Obtención del jugo concentrado

Se incluyeron 6 kg de arilos de cada una de las tres variedades de granada, se les extrajo el jugo por medio de prensado manual y filtración, utilizando una tela de algodón. El jugo de cada variedad, fue sometido a un proceso de evaporación a través de baño maría a temperatura de 70°C, hasta obtener una merma cercana al 60% en volumen, permitiendo un incremento de °Brix igual o mayor al 50% respecto al jugo fresco. Al producto final se le determinó el valor de pH con un potenciómetro Thermo scientifics K06202 y los SST fueron determinados con un refractómetro Reichert AR200 de acuerdo con las normas mexicanas NMX-F-317-NORMEX-2013 y NOM-173-SCFI-2009, respectivamente ^12,13. Una vez obtenidos los tres productos de cada variedad de granada se determinó en cada uno de ellos el contenido de fenoles totales, contenido de antocianinas totales y capacidad antioxidante total por el método DPPH.

Extracción de compuestos biofuncionales

Para la extracción de compuestos biofuncionales, se pesaron 2 g de mermelada y de arilos deshidratados utilizando una balanza (Santorius Te2145) y 2 ml de jugo concentrado. Las muestras se colocaron en tubos Corning de plástico de 50 ml con tapa, se incluyeron cuatro repeticiones de cada subproducto en cada una de las tres variedades, se agregaron 4 ml de metanol acidificado a pH de 2, se cubrieron los tubos con aluminio para protegerlas de la luz y se colocaron en un agitador Benchmark Orbi Shaker a 200 rpm por 1 h. Posteriormente, se centrifugaron a 4000 rpm durante 15 min a temperatura ambiente, en una centrifuga Hermle z326 k. Cada sobrenadante se depositó en un matraz aforado de 10 ml y se cubrió con papel aluminio y se mantuvo a 4°C. Nuevamente, a los tubos se les agrego 4 ml de acetona al 70% y se pusieron en agitación y centrifugación del mismo modo que el paso anterior y el sobrenadante se depositó en el mismo matraz del paso previo, después se aforó a 10 ml con metanol acidificado a pH de 2. Los líquidos de las extracciones se depositaron en tubos Eppendorf de 1,5 ml y se almacenaron a -20°C hasta su cuantificación.

Contenido de Fenoles totales

La cuantificación de fenoles totales fue medida por espectrofotometría basándose en una reacción colorimétrica de oxidación, de acuerdo a Herald et al., (2012) ¹⁴ con algunas modificaciones, se colocaron 25 μl de la muestra o estándar de la curva, 75 μl de agua doblemente destilada y 25 μl de reactivo de Folin-Ciocalteu, se agitaron por 10 s a velocidad media, se dejó reposar 6 min a temperatura ambiente, durante todo el proceso los tubos se protegieron de la luz, se adicionó 100 μl de carbonato de sodio (Na2CO3) al 7,5%, se agitó por 10 s a velocidad media, se dejó reposar por 60 min a temperatura ambiente. Se cargaron en placas de 96 pocillos de fondo curvo, cada una de las 4 repeticiones se cargó por triplicado y se leyó a una absorbancia de 725 nm en un espectrofotómetro Thermo Scientific Multiskan Go 1510. Se utilizó ácido gálico (GA) para realizar la curva estándar partiendo de una solución stock de 0,5 mg/ml. Los resultados fueron expresados en mg/ GAE /100 g o ml ¹⁴.

Antocianinas totales

El contenido de antocianinas totales (CAT) se determinó según el método de pH diferencial, el cual se basa en el cambio de coloración de las antocianinas de acuerdo al pH en la que se encuentran, quienes presentan más coloración en su forma oxonio a pH 1,0 (KCl 0,025 M) e incoloro en su forma hemiacetal a pH 4,5 (CHCOONa 0,4 M), esta diferencia de color permite la cuantificación de antocianinas mediante sus absorbancias a diferentes longitudes de onda (510 y 700 nm), usando como blanco agua destilada ¹⁵. Los cálculos del CAT se realizaron con la siguiente fórmula:

Dónde: CAT es el contenido de antocianinas totales^{mg equivalente de cianidina-3-glucosido}/_L, A es el cambio en la absorbancia; expresado en A = (A_520nm-A_700nm)pH 1,0 - (A_520nm-A_700nm) pH 4,5; MW masa molecular para Cianidina-3-glucósido (449,2 g/mol), ε coeficiente de extinción para cianidina-3-glucósido (26900 L/mol.cm), l es el camino óptico de celda, (1 cm), FD factor de dilución. Los resultados fueron expresados en equivalente de Cianidina 3- glucosido (ECn3G) mg / 100 ml de producto de granada.

Potencial antioxidante por el método DPPH

Para la cuantificación de la capacidad antioxidante (CA) se preparó una solución de DPPH (150µM). Para la curva de calibración se utilizó Trolox 5mM. Se prepararon concentraciones de 0 a 0,8 mM. Se utilizó Butil Hidroxitolueno (BHT) 0,1 g/ml como control positivo. Cada una de las muestras se colocaron en una placa de 96 pocillos de fondo plano por triplicado, aplicando 20 µl de la muestra + 200 µl DPPH y se leyó a una absorbancia de 520 nm en el Multiskan Go, después de 30 min de la reacción. Los resultados fueron expresados en mili Molar de Equivalentes de Trolox (m MTE)/100 g o ml.

Análisis estadístico

Se realizó un análisis 2 factorial de 3x3, en donde el primer factor fueron las tres variedades de granada (Apaseo, Tecozautla y Wonderful), el segundo factor fueron los tres subproductos (mermelada, jugo concentrado y arilos deshidratados). Para el análisis de los datos, se utilizó el software Statics Analysis System versión 9,1 ¹⁶. Se realizó un análisis de varianza y después una comparación de medias Tukey con ( 0,05, para las variables CFT, CAT y CA. Para el jugo fresco concentrado en cada variedad, se utilizó la prueba de t de Student.

Características fisicoquímicas de los tres subproductos de granada de cada variedad

Compuestos biofuncionales por producto

Los resultados del análisis combinado del contenido de fenoles totales (CFT), capacidad antioxidante (CA) y contenido de antocianinas totales (CAT), mostraron que el CFT de los arilos deshidratados (incluyendo los valores promedios de las tres variedades), fueron estadísticamente superiores con un valor de 1386,09 mg/GAE/100g, seguido de los jugos concentrados con 1271,73 mg/GAE/100g y las mermeladas con 312,70 mg/GAE/100g). De igual forma en CA, también los arilos deshidratados, tuvieron los valores más altos (220,12mMTE /100g), seguido del jugo concentrado y la mermelada fue quien mostró el menor valor (55,79 m MTE /100g) (Tabla 2).

Tabla 2 Promedio de contenido de fenoles totales (CFT), Capacidad antioxidante (CA) por el método DPPH, Contenido de antocianinas totales (CAT) en los tres productos de las tres variedades de granada 

Medias con la misma letra en la columna no hay diferencias significativas (Tukey, p<0.05).

Con relación al CAT, los jugos concentrados de las tres variedades fueron los que presentaron el mayor CAT con un valor de 34,97 ECn3G mg/100ml; a pesar de que, los arilos deshidratados presentaron una mayor cantidad de materia seca. En el caso de la mermelada, tiene adicionados otros compuestos como sacarosa y glucosa en elevadas proporciones y libres de fenoles, lo que redujo su CA, CFT y CAT respecto a los otros productos (Tabla 2).

Compuestos biofuncionales por producto y variedad

Al comparar de manera individual por producto y variedad, se encontró que en CFT el jugo concentrado (1821,44 mg/GAE/100 ml) y arilos deshidratados (1701,20 mg/ GAE/100 g) de la variedad Wonderful son estadísticamente iguales y superiores al resto de las combinaciones. De igual manera, en CA también los arilos deshidratados de la variedad Wonderful fueron quienes mostraron mayor CA con un valor de 272,87 m MTE/100 g, seguido del jugo concentrado de la misma variedad, con un valor de 210,89 m MTE/100 ml. Con relación al CAT, el jugo concentrado de la variedad Wonderful fue estadísticamente superior con un valor de 71,296 ECn3G mg/100ml, seguido de arilos deshidratados de variedad Wonderful con valor de 53, 875 ECn3G mg/100g (Tabla 4).

Tabla 4 Contenido de fenoles totales (CFT), Capacidad antioxidante (CA) por el método DPPH, Contenido de antocianinas totales (CAT) en variedades y subproductos de granada 

Medias con la misma letra en la columna no hay diferencias significativas (Tukey, p<0.05).

Características fisicoquímicas de los tres sub productos de granada de cada variedad

Las mermeladas presentaron un pH que oscila entre 2,7 y 3,4 y SST que fluctúan entre 66 y 68°Brix, valores que son acordes a las especificaciones de la Norma Mexicana NMX-F-131-1982 ^11,12. El contenido de materia seca de los arilos deshidratados estuvo entre 92,5 y 97,87 % y la humedad entre 3,13 y 7,5%. En el jugo concentrado se evaporó entre el 60 y el 68% del agua, lo cual propició un incremento en los SST y una disminución del pH en todas las variedades excepto en Apaseo, esto se debe a una alteración en las propiedades químicas a través del procesamiento térmico que se manifiestan en un exceso de acidez total, y una disminución de humedad. Por lo tanto, un aumento de compuestos químicos como resultado del concentrado de jugo ¹⁷. En un estudio realizado en granadas de la región mediterránea de Turquía encontraron que el jugo de granada pasteurizado a diferentes tiempos y temperaturas, presentó un pH entre 3,39 y 3,47 ¹⁸, resultados similares a los valores obtenidos en este estudio en la variedad Apaseo. En otro estudio, determinaron el pH de jugo fresco de granada de la variedad Wonderful, reportando un valor de pH de 3,16+ 0,05, ¹⁹, valor superior al obtenido en el presente trabajo en jugo fresco para Wonderful que fue de 2,89. Respecto a los SST, en jugo concentrado han reportados 75 °Brix en Wonderful¹⁷, valor superior al encontrado en este estudio. En cambio, lo SST reportados en jugo naturales de granada, entre 17,2 ± 0,1 y 14,6 ± 0,2 °Brix ¹⁸, son similares a este trabajo.

Compuestos biofuncionales por producto

Los arilos deshidratados fueron los que presentaron el mayor CFT y CA con valores de 1386,09 mg/GAE/100g y 220,12 mMTE/100g, seguido de los jugos concentrados con 1271,73 mg/GAE/100g y 175,82 mMTE/100g y las mermeladas con 312,70 mg/GAE/100g y 55,79 mMTE /100g, respectivamente. Los valores obtenidos en este estudio son mayores a los reportados en otra investigación sobre deshidratado de arilos de granada con diferentes métodos de secado a 55 ºC, ellos reportaron valores de CFT de 8,22 vs 6,13 mg GAE/g, en CAT valores de 92,87 vs 41,48 mg ECn3G/ 100g y en CA de 87,246 vs 64,821 %, en arilos sin deshidratar y arilos deshidratados con aire caliente, respectivamente ²⁰; por lo que se, observa un deterioro en 55 y 25 % en CAT y CFT con secado con aire caliente. De igual manera, se ha reportado que los compuestos biofuncionales en jugo de granada son afectados por la pasteurización a 95 °C por 3 min, disminuyendo en 27, 31, 13 y 49% CFT, CA, CAT y vitamina C, respectivamente comparado con el jugo tratado con pulsos de luz a 2988 J·cm− 2 ²¹.

El CAT fue mayor en los jugos concentrados que en arilos deshidratados y mermeladas; esto se debe a que el jugo concentrado está libre de la semilla de los arilos y las antocianinas están presentes en el líquido del grano ^2,19. Se ha reportado una concentración de antocianinas totales entre 28,1 y 55,6 mg/100 mL en jugos de granada obtenidos con presiones de 0 -1,8 bares, estos valores obtenidos son similares a los obtenidos en jugos concentrados y arilos deshidratados de este estudio ²². Es importante recalcar que las mermeladas mostraron los más bajos contenidos de compuestos biofuncionales y esto puede atribuirse a la adición de (sacarosa y glucosa) 40 % sin fenoles o debido al proceso térmico al que es sometida para la elaboración del producto, ya que se ha reportado que el CFT, CAT y la CA en mermelada de frutillas disminuye en una forma lineal con relación a la temperatura (80, 85 y 90 °C) y al tiempo (1 -60 min) ²³. Además, se ha reportado que el procesamiento térmico en mermelada degrada parcial o totalmente el CFT ²⁴, a causa de a una disminución del ácido elágico o por alteraciones en la estructura celular ²⁵. De igual manera, en jugo concentrado se reporta una degradación de antocianinas para la variedad Wonderful de 19,503 a 14,713 mg/100g, pero no en CFT ¹⁷.

Compuestos biofuncionales por variedad

La variedad Wonderful fue la que presentó el mayor CFT, CA y CAT en comparación con las variedades Apaseo y Tecozautla. Otros autores también han reportado diferencias de compuestos biofuncionales entre variedades reportando valores en CFT entre 0,81 y 1,52 mg GAE/ml, y CA entre 3,44 y 6,81 mg TE/ml ²⁶.

Compuestos biofuncionales por producto y variedad

El CFT y la CA y CAT del jugo concentrado y arilos deshidratados de la variedad Wonderful fueron los que obtuvieron los valores más altos. Por lo anterior, se puede notar que, bajo las condiciones evaluadas, la variedad Wonderful tanto en arilos deshidratados como en jugo concentrado es líder en valores de los compuestos biofuncionales, esto puede deberse a que los arilos de variedad Wonderful son de una coloración tinto y las variedades Apaseo y Tecozautla sus colores son rojos claros y el color más oscuro está relacionado con mayor cantidad de algunos compuestos biofuncionales ². En este estudio se encontraron diferencias significativas para CFT, CA y CAT; caso contrario, en otra investigación donde cuantificaron CAT en jugos de granada pasteurizados, reportaron valores entre 44,86 a 45,08 mg/l, sin diferencias significativa (p = 0,127) ¹⁸.

Estudio comparativo entre jugo fresco y jugo concentrado de granada El jugo concentrado mostró valores más altos en comparación con jugo fresco en CA, CFT y CAT, excepto en CAT en variedad Apaseo, donde fueron estadísticamente iguales. En otros estudios han reportado una concentración de antocianinas totales en jugo fresco de granada de la variedad Bedana de 5,4 mg/100 ml, el cual es un valor menor al obtenido en jugo fresco de las tres variedades estudiadas (10,01 a 41,91 mg/100 ml) en el presente trabajo ¹⁸. El contenido de compuestos biofuncionales del jugo de granada puede variar según la variedad, el área de cultivo, el clima y el estado de madurez ^28,29,30. La granada se caracteriza por tener gran concentración de polifenoles y actividad antioxidante en todas las partes del fruto, lo que los convierte en candidatos potenciales para el empleo en la industria alimentaria y farmacéutica (28, 30). Sin embargo, otros autores han reportado un alto porcentaje (52,21 %) de degradación de antocianinas en el jugo cuando fue sometido a una temperatura de 75°C por 30 m ³¹. También se coincide con los autores previamente citados, en que también en este estudio hubo degradación del CAT en jugo concentrado atribuido al tratamiento térmico (70°C) ya que se obtuvieron los siguientes valores para jugo fresco vs concentrado para las variedades de Apaseo (14,51 vs 18,31), Tecozautla (7,41 vs 5,311) y Wonderful (54,02 vs 71,29 EC3G mg/100ml), y si se considera la merma en el jugo concentrado fue de 60, 60 y 68% para Apaseo, Tecozautla y Wonderful, respectivamente; representaría que el jugo concentrado tendría que haber obtenido valores de 2,5, 2,5 y 3,125 veces más que, el jugo fresco, pero no pasó; por lo que, la degradación de CAT fue de 49, 17 y 58% para el jugo concentrado de las variedades Apaseo, Tecozautla y Wonderful, respectivamente. Sin embargo, no hubo degradación del CFT y por lo tanto no se afectó la CA, estos resultados coinciden con otros investigadores que no encontraron diferencias al agregar extracto de cáscara de granada a un platillo mexicano y aplicar cocción ³².

La CA en jugo fresco para Apaseo fue de 20,2, para Tecozautla fue 69,16 y para Wonderful fue de 60,2 mMTE/l, los valores obtenidos en este estudio son más altos que los reportados en granadas de la región del mediterráneo en Turquía (5,60 y 7,35 mMTE/l) ¹⁸.

En este estudio en el análisis por factor, variedad, subproducto y en el análisis individual se observa que existe una relación positiva entre el CFT, CA y CAT, lo que coincideconotros estudios en donde reportan también esta relación ³³. Se considera que este trabajo es importante ya que no se encontraron estudios sobre compuestos biofuncionales en subproductos de arilos deshidratados, jugo concentrado y mermelada con algunas de estas variedades.