Drs. Karina Nieto-Dionisio*, María Teresa Urbina*, Randolfo Medina*, Isaac Benjamín*, René Utrera**, Jorge Lerner Biber*

Trabajo presentado en el II Congreso de AVEMERE, Caracas, Venezuela. Trabajo presentado por Licenciada Karina Nieto-Dionisio para optar por el título de Licenciada en Biología de la Universidad Simón Bolívar.

Métodos: Comparamos la morfología espermática de las muestras seminales de 30 pacientes infértiles, evaluada a través de las tinciones Testsimplets® y Diff-Quik. Adicionalmente, en pacientes que presentaron más de 106 de células redondas por mL de semen (n=7), comparamos la evaluación de leucocitos por Testsimplets® y el test de peroxidasa.

Ambiente: Centro de fertilidad UNIFERTES, en Caracas, Venezuela.

Palabras clave: Testsimplets®. Diff-Quik. Morfología espermática. Criterio estricto de Kruger. Test de peroxidasa. Leucocitospermia.

SUMMARY

Methods: We compared sperm morphology of 30 infertile patients evaluated by Testsimplets® and Diff-Quik staining. Additionally, in patients with more than 106 round cells per ml semen (n=7), we compared the assessment of leukocytes by Staining cellular peroxidase and Testsimplets®.

Setting: Fertility clinic UNIFERTES, in Caracas, Venezuela.

Key words: Testsimplets®. Diff-Quik. Sperm morphology. Kruger strict criteria. Peroxidase Test. Leukocytospermia.

El examen que brinda la visión más amplia de la capacidad reproductiva del hombre, y el que hasta ahora sigue siendo la forma de detectar el factor masculino, es el espermograma, que incluye el estudio de la concentración, movilidad y morfología espermáticas. La pobre calidad seminal está representada entonces por parámetros anormales, como concentración espermática baja, movilidad espermática baja y morfología espermática (ME) anormal. El porcentaje de espermatozoides con ME anormal ha sido asociado con las tasas de fecundación, clivaje embrionario, implantación e infertilidad en humanos (3-6). Otros estudios proponen además que esta relación puede verse afectada por otras variables, como la concentración espermática o los riesgos de las técnicas utilizadas (7-9).

Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo es comparar los resultados de la evaluación de ME mediante dos tinciones: Testsimplets® y Diff-Quik. Adicionalmente, se comparará la evaluación de los leucocitos en el semen mediante Testsimplets® y el Test de peroxidasa.

En cabeza: si era alargada, piriforme, si presentaba doble cabeza, si era redonda, si era grande (macrocéfala), si era pequeña (microcéfala), o si era amorfa.

En pieza media: si en la unión pieza media-cabeza, la primera estaba doblada; si era gruesa, si era irregular, o si presentaba gotas citoplasmáticas.

En flagelo: si se encontraba enrollado, si era doble, si era corto, si respecto a la unión con la cabeza era abaxial y si estaba doblado.

Se compararon los resultados de cabezas piriformes y alargadas, entre ambas tinciones, ya que algunos autores explican que los espermatozoides podrían permanecer de lado debido al soporte húmedo de la lámina de Testsimplets®, que no implica un proceso de fijación, llevando a confundir al observador inexperto con el defecto de cabeza alargada o piriforme (13,14). Además, se deseó saber si Testsimplets® podía ser utilizado para evaluar el porcentaje de células redondas en semen, en vez de con el test de peroxidasa (23). En aquellos pacientes (n = 7) que en la observación inicial presentaban un número de células redondas mayor a 106 por mL de semen, se realizó el test de peroxidasa, contando el porcentaje de células redondas de la línea blanca y de la línea espermática. También se contaron células redondas de ambos tipos en la lámina de Testsimplets®. Posteriormente, con el programa estadístico STATGRAPHICS Centurion XVI (StatPoint Technologies), se compararon los resultados obtenidos tanto en la evaluación morfológica como en el conteo de células redondas, siguiendo una prueba-t pareada.

Se compara el porcentaje promedio de espermatozoides con defectos de cabeza alargada y piriforme en la Figura 2, ya que el aumento de estos defectos en Testsimplets® podría estar asociado al uso del mismo. Se puede observar que, aunque no se rechaza la hipótesis nula al comparar cabezas alargadas, sí se rechaza en cabezas piriformes.

Se compararon los promedios de defectos morfológicos observados que presentaban diferencias significativas entre tinciones y se presentan en la Figura 3. Se obtuvo que los siguientes defectos morfológicos diferían entre ambas tinciones: además de cabeza piriforme, pieza media doblada o irregular y presencia de gotas citoplasmáticas.

Finalmente, en el Cuadro 1 se puede observar que en la comparación entre Testsimplets® y el test de peroxidasa, el valor P calculado no es menor que 0,05, por tanto no se rechaza la hipótesis nula. Es decir, no hay diferencias significativas entre el contaje de células redondas entre Testsimplets® y el test de peroxidasa.

No existen diferencias significativas en el análisis de ME normal entre ambas tinciones, lo cual concuerda con los resultados de algunos autores como Schirren y col. (11), Calamera y Vilar (12), quienes no encontraron diferencias significativas en sus análisis, y que además concluyeron que Testsimplets® es una tinción rápida y confiable, pero que no puede ser preservada, y Schoenfeld y col. (13), quienes resaltaron que, aunque las instrucciones de Testsimplets® recomienda esperar 2 horas para que los espermatozoides se inmovilicen, ellos observaron que al cabo de 4 minutos ya todas las células se encontraban inmovilizadas y teñidas (11-13). Mientras otros autores como Henkel y col. (14), que compararon la ME según Kruger con Papanicolaou y Shorr, sí observaron diferencias significativas entre Testsimplets® y las otras tinciones. También describen la imposibilidad de guardar las muestras en las láminas de Testsimplets® para futuras observaciones (14).

Para subsanar este problema, la empresa productora de Testsimplets® recomienda una técnica con formalina 10 % que permite preservar las láminas de Testsimplets® hasta por 4 meses. Schoenfeld y col. (13) observaron que si se cubría la lámina de Testsimplets® con un cubreobjeto y luego se recubría con pintura de uñas, la muestra podía ser observada hasta 5 días después. Si además, luego de la evaluación, se le removía el cubreobjetos y se dejaba secar la muestra al aire, la tinción podía durar hasta 3 meses. Si se removía el cubreobjetos, la muestra se dejaba secar al aire y se fijaba con formalina al 10.%, la tinción podría durar hasta 3 meses, de la misma manera como recomienda Testsimplets® (13).

Durante la evaluación de la ME con Testsimplets®, se hicieron algunas observaciones. Una de ellas era que algunos de los espermatozoides observados parecían estar de lado debido a la forma que presentaba la cabeza, lo cual concuerda con las observaciones realizadas por Henkel y col. (14). Schoenfeld y col. (13) y otros autores (14) explican que los espermatozoides podrían permanecer de lado debido al soporte húmedo de la lámina de Testsimplets®, que no implica un proceso de fijación, llevando a confundir al observador inexperto con el defecto de cabeza alargada o el defecto de cabeza piriforme; sin embargo, en este trabajo no se obtuvieron diferencias entre el defecto de cabeza alargada entre tinciones, pero sí se obtuvo un mayor porcentaje de espermatozoides con cabezas piriformes en la evaluación con Diff-Quik que con Testsimplets®. También explican que, por este mismo soporte húmedo, los espermatozoides podrían hincharse, modificando también las observaciones realizadas. Henkel y col. (14) no recomiendan el uso de Testsimplets®, aunque lo hayan encontrado correlacionado con Papanicolaou.

De entre todos los defectos morfológicos evaluados (de cabeza, pieza media y cola), solo cuatro presentaban, al comparar las medias de cada tinción, diferencias estadísticas (cabeza piriforme, pieza media doblada, con borde irregular y con presencia de gotas citoplasmáticas). Según lo observado por Henkel y col. (14), cabe resaltar el hecho que se esperaba mayor porcentaje de cabezas piriformes en la evaluación por Testsimplets® que en la evaluación por Diff-Quik. Mortimer y Mortimer (24) comentan que una cabeza piriforme, en la cual la base de la cabeza no es redondeada sino puntiaguda, indica una debilidad de la región entre cabeza y pieza media.

Respecto a las cabezas piriformes, Rousso y col. (25) realizaron un estudio para investigar la frecuencia de espermatozoides con cabeza piriforme, el porcentaje de ocurrencia de este defecto morfológico, y para evaluar la posible correlación de este defecto con otros parámetros seminales. Los espermatozoides con cabeza piriforme fueron observados en 98,2 % de las muestras seminales; en hombres subfértiles, el defecto se presentaba en 22 % del total de espermatozoides contabilizados; y observaron una correlación positiva entre este defecto y otros, como la pieza media doblada, la presencia de gotas citoplasmáticas y el flagelo enrollado. Los autores afirman que "a mayor número de espermatozoides con la cabeza piriforme, mayor el porcentaje de formas espermáticas anormales y mayor el número de anormalidades morfológicas por espermatozoide" (25). Las imágenes de las células de la muestra seminal se ven en tres dimensiones (3D), debido posiblemente al soporte húmedo de la lámina. En el frotis y tinción con Diff-Quik, las imágenes se observan en dos dimensiones (2D), es decir, el enfoque de la imagen de la célula se encuentra en un solo plano al observarla a través del microscopio, mientras que con Testsimplets® se debe mover el micrómetro del microscopio para observar en varios planos todas las partes de la célula analizada; quizás este hecho podría permitir en Testsimplets® observar mejor las anomalías de flagelo y pieza media, y podría explicar las diferencias obtenidas al evaluar los defectos de pieza media. Sin embargo, Mortimer y Menkveld (26), comentaron que Testsimplets® puede dar preparaciones de baja calidad, y que su análisis puede ser más difícil y lento que la tinción de Papanicolaou. Incluso, Diff-Quik tampoco puede proveer de todos los detalles y penetración que Papanicolaou puede ofrecer.

Aunque se analizaron pocos casos, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en el análisis de células redondas entre el test de peroxidasa con Testsimplets®, los resultados sugieren que es confiable utilizar Testsimplets® para el análisis de células redondas en la muestra seminal, en concordancia con el estudio de Henkel y col. (14). En otro estudio realizado por Riedel (27), en el cual compararon el uso de Testsimplets® con la tinción de Papanicolaou para determinar la presencia de células redondas de la línea blanca, se concluyó también que es posible utilizar Testsimplets®. Schoenfeld y col. (13) sugieren que Testsimplets® permite una diferenciación fácil entre células redondas, ya que las células de la línea blanca exhiben claramente sus gránulos individuales. Angelopoulos y col. (28), también analizaron células redondas con Testsimplets® y confirmaron el tipo celular mediante FISH (Fluorescent In Situ Hybridization), y sugirieron que se puede utilizar Testsimplets® para seleccionar células redondas de la línea espermática para uso investigativo o clínico.

El Test de peroxidasa consiste en mezclar 10 μL de bencidina/o-toluidina con 10 μL de peróido de hidróeno y 10 μL de la muestra seminal. La bencidina y el o-toluidina son potentes carcinogénicos; en humanos se han asociado a un aumento de contraer cáncer en riñones, uretra y vejiga. Una de las ventajas del Testsimplets® es que no contiene bencidina ni o-toluidina, aunque las cantidades de estos compuestos a las que se expone el operador durante la realización del Test de peroxidasa son mínimas. La realización de la tinción con Testsimplets® es mucho más rápida que las otras tinciones, ya que Testsimplets® es una tinción del tipo pancromático (todos los colorantes neutros actúan juntos en un solo paso), mientras la tinción de Diff-Quik es del tipo panóptico (coloración combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros). Henkel y col. (14) reportan, además, los altos costos de Testsimplets®. Una investigación realizada por las páginas web de algunas distribuidoras médicas señala que ofrecen este producto a €90 aproximadamente para 100 muestras, mientras que Diff-Quik está por el orden de los €112 o los $226, para más de 1 000 muestras (29,30).

Es muy importante realizar una buena historia clínica, ya que algunos factores que causan anomalías morfológicas espermáticas pueden ser disminuidos con cambios en el estilo de vida del paciente. Este trabajo comparó la evaluación de la ME siguiendo el criterio estricto de Kruger, mediante las tinciones Testsimplets® y Diff-Quik. Es importante resaltar que ninguno de los trabajos anteriores comparó Testsimplets® con Diff-Quik siguiendo el criterio estricto de Kruger, bien sea porque estos trabajos compararon Testsimplets® con otra tinción, o lo compararon con Diff-Quik pero siguiendo un criterio distinto al de Kruger. Los resultados de este trabajo muestran que se puede utilizar Testsimplets® para el análisis de la ME, y permite ahorrar tiempo y mejorar la eficiencia del laboratorio de andrología en cuanto al tiempo de entrega de resultados, lo cual es importante en la evaluación clínica; pero es mucho más costoso que Diff-Quik. Si la rapidez en la entrega de resultados en la evaluación clínica es importante, se puede usar Testsimplets® mencionándolo en el reporte, ya que los resultados no son diferentes significativamente en este estudio. El método considerado el estándar de oro para la evaluación morfológica por la mayoría de los autores es el criterio estricto de Kruger con la tinción de Papanicolaou y Diff-Quik. Si mantener los altos estándares en el laboratorio es lo importante, este es el método que se debe utilizar, al menos para tomar decisiones en pacientes que tienen resultados morfológicos dudosos o muy cercanos a lo normal (borderline). Son necesarios más trabajos para poder establecer el uso de Testsimplets® como una técnica confiable para la evaluación de la ME. Si los métodos producen diferentes perfiles de ME, quizás sea necesario establecer un valor normal para cada método (Testsimplets® y Diff-Quik) que se relacionen con los resultados de la fecundación in vitro (FIV).

1. Zegers-Hochschild F, Adamson GD, De Mouzon J, Ishihara O, Mansour R, Nygren K, et al. en nombre de ICMART y WHO. The International Committee for Monitoring Assisted Reproductive Technology (ICMART) and the World Health Organization (WHO) Revised Glossary on ART Terminology. Hum Reprod. 2009;24:2683-2687.         [ Links ]