Kasmera
versión impresa ISSN 0075-5222
Kasmera vol.40 no.2 Maracaibo jul. 2012
Detección fenotípica de metalobetalactamasas en aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa
Phenotypic Detection of Metallo-beta-lactamase in Clinical Isolates of Pseudomonas aeruginosa
Perozo Mena, Armindo José1,2;
Castellano González, Maribel Josefina1;
Ling Toledo, Eliana2 y Arraiz, Nailet1,3
1Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia.
2Centro de Referencia Bacteriológica, Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo.
3Laboratorio de Biología Molecular, Centro de Investigaciones Endocrino Metabólicas Dr. Feliz Gómez, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia
aperozomena@cantv.net ; aperozomena@interlink.net.ve ; maribelcast@interlink.net.ve ; maribeljo@cantv.net
Resumen
Pseudomonas aeruginosa, es considerado uno de los más importantes gérmenes hospitalarios, siendo común su aislamiento en pacientes hospitalizados, adicionalmente, este microorganismo presenta una marcada multiresistencia, lo que incrementa la mortalidad. El tratamiento de estos pacientes suele ser difícil, ya que además de su resistencia natural, Pseudomonas puede adquirir mecanismos de resistencia para prácticamente la totalidad de los antimicrobianos disponibles para su tratamiento, por lo que cada vez es más frecuente y necesario el empleo de antibióticos como los carbapenems, lo que facilita la adquisición de mecanismos de resistencia a estas drogas. El presente estudio intenta determinar la producción de metalobetalactamasas (MBL) en aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa, utilizando para ello dos métodos fenotípicos. Se utilizó el método del doble disco (MDD) y el test de Hodge modificado (MHT). Se analizaron 726 aislados clínicos de P. aeruginosa, el 20,11% (146) de estos fueron resistentes a imipenem (IPM) y meropenem (MEM), por lo que se les realizaron los dos métodos fenotípicos, de los 146 aislados resistentes a carbapenems, 139 fueron positivas para el MDD, mientras que 144 lo fueron para el MHT, estos dos métodos permitieron confirmar la presencia de una carbapenemasa tipo MBL en el 98,63% de los aislados de P. aeruginosa, por otra parte, cinco aislados no fueron positivos para el MDD pero si para el MHT, lo que indicaría la presencia de carbapenemasas no MBL en estos aislado, también se obtienen 2 aislados que a pesar de ser IPM y MEM resistentes fueron negativos por los dos métodos fenotípicos utilizados, esto indicaría la presencia de un mecanismo de resistencia no enzimático que confiere resistencia a carbapenems. La utilización de métodos fenotípicos para la detección de MBL en aislados de P. aeruginosa es una opción bastante aceptable para utilizar en laboratorios de rutina donde pruebas especializadas de biología molecular no están disponibles.
Palabras clave: Pseudomonas aeruginosa, MBL, imipenem, meropenem.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa is considered one of the most important hospital germs; its isolation is common in hospitalized patients. In addition, this microorganism has a marked multi-resistance, which increases mortality. Treatment of these patients is often difficult, since in addition to its natural resistance, Pseudomonas can obtain resistance mechanisms to virtually all antimicrobial drugs available for its treatment; due to this, its appearance is increasingly frequent and necessitates the use of antibiotics such as carbapenems, which facilitates the acquisition of resistance mechanisms to these drugs. This study attempts to determine the production of metallo-beta-lactamase (MBL) in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa, utilizing two phenotypic methods: the double disc method (MDD) and the modified Hodge test (MHT). 726 clinical isolates of P. aeruginosa were analyzed; 20.11% (146) of these were resistant to imipenem (IPM) and meropenem (MEM); 139 were positive for the MDD, while 144 were positive for the MHT. These two methods permitted confirming the presence of an MBL-type carbapenemase in 98.63% of P. aeruginosa isolates; five isolates were negative for the MDD but positive for the MHT, indicating the presence of non-MBL-type carbapenemase in these isolates. Also, 2 isolates were obtained that, despite being resistant to IPM and MEM, were negative according to the two phenotypic methods used; this would indicate the presence of a non-enzymatic resistance mechanism conferring resistance to carbapenems. The use of phenotypic methods for detecting MBL in P. aeruginosa isolates is quite an acceptable option for use in routine laboratories where specialized molecular biology tests are not available.
Keywords: Pseudomonas aeruginosa, MBL, imipenem, meropenem
Introducción
Pseudomonas aeruginosa, es considerado un patógeno nosocomial que ha emergido como uno de los más importantes gérmenes hospitalarios, siendo común su aislamiento en pacientes de unidades de cuidados intensivos (UCI), en quienes además presenta una marcada multiresistencia, incrementando la mortalidad asociada (1). El tratamiento de las infecciones causadas por este agente suele ser difícil, ya que además de su amplia resistencia natural producida principalmente por la baja permeabilidad de su membrana externa, también puede adquirir mecanismos de resistencia para prácticamente la totalidad de los antimicrobianos disponibles para su tratamiento (2, 3).En respuesta a esto, es cada vez más frecuente y necesario el empleo de antibióticos de amplio espectro como los carbapenems en las instituciones hospitalarias, lo que facilita la adquisición de mecanismos de resistencia, ya que se ha demostrado que la administración de estas drogas es uno de los principales factores de riesgo para el desarrollo de resistencia (4).
En el estudio SENTRY para Latinoamérica, P. aeruginosa ocupó el tercer puesto entre los agentes patógenos aislados con mayor frecuencia, luego de los aislamientos reportados de S. aureus y E. coli (5). A nivel local, el Programa Venezolano de Vigilancia de la Resistencia Bacteriana a los Antimicrobianos (PROVENRA), reporta un 8% de aislamientos de cepas de P. aeruginosa, a partir de muestras clínicas en Venezuela, es decir un tercer lugar en frecuencia de aislamiento al igual que el estudio SENTRY (6). Por otra parte, el Boletín de Etiología y Resistencia Bacteriana del Centro de Referencia Bacteriológica del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo, ubica a P. aeruginosa en el quinto lugar de frecuencia de aislamientos con un 7,63% (7). Estos datos demuestran el importante papel que desempeña este microorganismo como patógeno dentro de nuestras instituciones de salud.
Los mecanismos más frecuentemente implicados en la resistencia a carbapenems en Pseudomonas aeruginosa son la disminución de la permeabilidad del antibiótico a través de la membrana externa debido al decremento en la expresión de porinas; disminución de la concentración intracelular del antibiótico mediada por la presencia de bombas de eflujo; y modificación e inactivación del antibiótico por hidrólisis mediada por enzimas (8). En relación a los mecanismos enzimáticos, las dos betalactamasas (BL) que con mayor frecuencia pueden llevar a resistencia a los carbapenems son las del grupo AmpC y las carbapenemasas del tipo metalo-beta-lactamasas (MBL) (8, 9). Las BL tipo AmpC presentan baja afinidad por los carbapenems; sin embargo, cuando la enzima se produce en exceso y la bacteria altera sus porinas (especialmente OprD), la baja cantidad del antibiótico presente en el espacio periplásmico permite que la enzima lo hidrolice, lo que favorece la expresión de resistencia a los carbapenems. Por otra parte, las MBLs se caracterizan por producir resistencia a todos los BL, incluyendo los carbapenems, pero presentan susceptibilidad variable al aztreonam, las MBL se transfieren fácilmente entre diferentes microrganismos, ya que se encuentran ubicadas en genes cassetes, localizados principalmente en integrones tipo 1, así como en plásmidos o transposones (10-13).
De estos mecanismos, el que merece especial atención es la producción de MBL, ya que confiere resistencia a un amplio rango de agentes antimicrobianos, se disemina rápidamente dentro de instituciones hospitalarias y aumenta significativamente las tasas de morbilidad, por lo que este trabajo se propone determinar la incidencia de aislados clínicos de P. aeruginosa productores de MBL, utilizando para ello el método del disco con un agente quelante como el ácido etilendiamintetraacético (EDTA)/ácido tioglicólico (SMA) y el test de Hodge modificado para confirmar la presencia de este mecanismo de resistencia enzimático.
Materiales y métodos
La población estudiada estuvo conformada por 726 aislados clínicos de P. aeruginosa obtenidas a partir de los cultivos de rutina practicados con fines diagnósticos a los pacientes que asisten al Centro de Referencia Bacteriológica del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (CRB-SAHUM). Se estudiaron cepas aisladas de pacientes hospitalizados de ambos sexos, y cualquier edad.
El aislamiento de las cepas de P. aeruginosa a partir de las diferentes muestras clínicas fue realizado por el personal del CRB-SAHUM, para ello utilizaron las técnicas de aislamiento convencionales descritas en el Manual de Microbiología Clínica (14; 15), para la identificación se utilizó el equipo automatizados VITEK 2C (Biomerieux®) y las tarjetas de identificación para Gram negativos GN; estas tarjetas permiten la identificación de la mayor parte de los bacilos Gram negativos de interés clínico (incluyendo especies de Pseudomonas), en un tiempo máximo de 7 horas.
Una vez identificada la cepa como Pseudomonas aeruginosa, se procedió a determinar la susceptibilidad a imipenem (IPM) y meropenem (MER) utilizando el método de difusión del disco (16), para ello se preparó una suspensión ajustada al patrón 0,5 de McFarland (1-2×108 UFC/mL) del microorganismos en estudio y se inoculó, con un hisopo de algodón, la superficie de una placa de agar Müeller-Hinton (MH) a manera de césped para obtener un crecimiento confluente, luego se colocó en la superficie del agar un disco de IPM y MEM de 10 µg cada uno. El medio de cultivo se incubó a 35±2°C de 18 a 24 horas antes de realizar la lectura de los resultados. Para la interpretación de la prueba de susceptibilidad a IPM y MER se utilizaron los criterios del Clinical and Laboratory Standard Institute(CLSI) (17), considerándose susceptible un tamaño de la zona de inhibición ³ 23 mm, intermedio de 20 a 22 mm y resistentes £ 19 mm para ambos antimicrobianos.
Una vez determinada la susceptibilidad a IPM y MEM se utilizó el método fenotípico del doble disco (MDD) con EDTA/SMA (750/300 µg) para determinar si la resistencia a carbapenems era debido a la presencia de una enzima del tipo MBL. Este método fue descrito por Arawaka y cols. (18), y se basa en que las MBL necesitan como cofactor en la reacción iones metálicos como el Zn+2, el EDTA es un agente quelante que posee la capacidad de atrapar estos iones metálicos y por consiguiente inhibir la acción de la enzima, por lo que en esta prueba se utiliza el EDTA/SMA como inhibidor de MBL, mientras que, otras carbapenemasas (KPC, OXA, SME, NDM, etc.), la presencia de mecanismos de hiperproducción de AMP-C, impermeabilidad y eflujo, no son inhibidas por el EDTA. Para realizar la prueba se utiliza una placa de agar Müeller-Hinton (MH), esta placa es sembrada con un inóculo estandarizado (0,5 McFarland), luego se colocó un disco de papel Whatman Nº 6 con un diámetro de 9mm en la placa y se impregnó con 10µl de EDTA/SMA, posteriormente se colocaron a cada lado del disco de EDTA/SMA un disco de IPM y MEM a una distancia de 15 mm centro-centro. Una vez colocados los discos, se incubó la placa en atmosfera aeróbica a 35±2°C de 18 a 24h. Después de la incubación se procede a realizar la lectura de la prueba, esta se considera positiva cuando se observa una ampliación o distorsión (efecto sinérgico) entre los discos de imipenem y meropenem con el disco de EDTA/SMA. Esta prueba tiene el inconveniente de producir un 15% de falsos positivos, por lo que se realizó la confirmación con el Test de Hodge Modificado (MHT).
El Test de Hodge fue descrito inicialmente por Hodge y cols. (19), para detectar la presencia de penicilinasas en cepas de Neisseria gonorrhoeae, este método detecta la presencia de una enzima inactivadora de antibióticos en la cepa estudiada, la especificidad del método para distinguir distintos tipos de betalactamasas está dada por el antibiótico que se utilice. Lee y cols. (20), modificaron el método original cambiando el microorganismo indicador y el antibiótico probado, haciendo que la prueba sea bastante sensible para la detección de MBL.
Para realizar la prueba, se inoculó la superficie de una placa de agar MH, con una suspensión de colonias de un cultivo joven de Escherichia coli ATCC 25922, ajustada al estándar 0,5 de la escala de McFarland. Se dejó secar por tres minutos la superficie de la placa y se colocó un disco de IPM en el centro de la placa, posteriormente, se realizó una estría desde el borde del disco hacia la periferia de la placa para cada cepa de P. aeruginosa sospechosa de la producción de MBL, se pueden colocar máximo cuatros aislados en placas de Petri de 90 mm. Las placas se incubaron en atmósfera aerobia por 18-24 h a 35°C. La presencia de una zona de distorsión del halo de inhibición alrededor de la estría del microorganismo probado será interpretada como positiva para la producción de MBL por el método de Hodge modificado. Para el control de calidad de la prueba del doble disco como para el Test de Hodge modificado, se utilizó un control positivo (P. aeruginosa CRB 3256-08) y un control negativo (P. aeruginosa ATCC 27853).
Resultados
De los 726 aislados clínicos de P. aeruginosa probados en esta investigación, solo 146 (20,11%) mostraron resistencia a los carbapenems (IPM y MEM) mediante el método del disco, lo que sugiere probablemente la presencia de una enzima carbapenemasa tipo metalobetalactamasa.
Al realizar el MDD con EDTA/SMA, 139 (95,21%) cepas mostraron efecto sinérgico entre este disco y el de IPM o MEM (Figura 1), lo que sugiere la presencia de una metalobetalactamasa, sin embargo, este método posee de un 10 a un 15% de resultados falsos positivos debido a que el EDTA es capaz de solubilizar la membrana externa de especies de Pseudomonas, por lo que se debe confirmar un resultado positivo. A los 146 aislados clínicos de P. aeruginosa, se les realizó también el MHT, dando positivo en 144 (98,63%) de las cepas (Figura 2). La Tabla 1 resume los resultados del DD y HMT.
Discusión
Al comparar los resultados de ambos métodos se puede concluir que de los 726 aislados clínicos de P. aeruginosa, el 20,11% es resistente a los carbapenems, probablemente por un mecanismo enzimático (producción de MBL). Un estudio realizado por Crespo y col. (21) en Cali, Colombia indica que para el año 1996, la presencia de cepas de P. aeruginosa productoras de MBL era del 2%, para el año 1997 del 28% y para el año 2003 era superior al 40%, estos resultados son superiores a los obtenidos en esta investigación. Por otra parte, Castanheira y col. (22) en la India, reportan un 35,5% de cepas de Pseudomonas spp. con susceptibilidad disminuida a IPM y MEM, las que después confirman como productoras de MBL mediante reacción en cadena de la polimerasa; mientras que Yan y col. (23) en Taiwan, reportan un 10% de cepas de Pseudomonas spp. productoras de MBL, valor inferior al obtenido en nuestro estudio. Estos resultados indican que la incidencia de MBL en aislados clínicos de Pseudomonas está estrechamente relacionada con la ubicación geográfica, por lo que es imperativo realizar estudios que permitan determinar la incidencia local de este mecanismo de resistencia en nuestras instituciones de salud.
El 95,21% de los aislados de P. aeruginosa resistentes a IPM y MEM, por el método del disco, fueron positivos en el MDD utilizando una mezcla EDTA/SMA como agente inhibidor, esto sugiere la presencia de un mecanismo de resistencia enzimático muy probablemente producción de MBL. Galani y col. (24) reportan un 99% de sensibilidad y un 91,9% para la detección de MBL, por lo que lo recomiendan como método de rutina para la detección de cepas productoras de MBL. Por otra parte Guevara y col. (25), en Venezuela también reporta una buena especificidad y especificidad (superior al 95%), utilizando discos de IPM con EDTA/SMA. Lee y col. (26), reportan una sensibilidad y especificidad del 100% para el método del doble disco con IPM/EDTA.
Por otra parte, el 98,67% de las cepas de P. aeruginosa estudiadas dieron positivo el MHT, este valor es superior al detectado por el método del doble disco (95,21%), debido principalmente a que el MHT detecta la presencia de cualquier mecanismo enzimático de resistencia, mientras que el MDD solo detecta la presencia de MBL. En el MTH, la especificidad del método está dada por el antibiótico utilizado como sustrato en la prueba, en este caso IPM, por lo que el método detecta la presencia de enzimas que hidrolizan a los carbapemens, es decir, carbapenemasas; en nuestro medio, la resistencia a carbapenems en Pseudomonas spp. se debe principalmente a la producción de MBL, sin embargo existen otras carbapenemasas no MBL que pueden conferir resistencia a los carbapenems como por ejemplo KPC, SME y NDM-1 entre otras, estos mecanismos enzimáticos de resistencia pueden ser detectados por el MHT pero no por el MDD, lo que explica la diferencia existente entre los dos métodos.
Resultados del método del doble disco y Hodge Modificado en 146 aislados de Pseudomonas aeruginosa resistentes a IMP y MEM.
Test de Hodge | Disco EDTA/SMA | |
(+) | (-) | |
(+) | 139 | 5 |
(-) | 0 | 2 |
Al analizar los resultados de la Tabla 1, se observa que existe una buena correlación entre el MDD y el MHT, sin embargo, se observa que 5 aislados fueron positivos para el MTH y negativos para el MDD, esto puede ser debido a la presencia de otras carbapenemasas no MBL. Por otra parte se observa que 2 aislados resistentes a IPM y MEM por el método del disco fueron negativos por el MDD y el MTH, esto probablemente indicaría la presencia de un mecanismo de resistencia no enzimático, posiblemente producido por un sistema de eflujo (27-29) o por la pérdida de porinas específicas a nivel de la membrana externa (28-30), que impiden la entrada del antibiótico al interior de la bacteria.
Diferentes autores recomiendan el MDD y el MTH para la detección de MBL en aislados de Pseudomonas spp. (20, 25, 26, 29), este estudio demuestra que estos métodos son una buena recomendación para laboratorios de rutina donde métodos moleculares no están disponibles (29, 31). La utilización de ambos métodos permite detectar de manera adecuada la producción de MBL en aislados de Pseudomonas spp., incluso permite la detección de carbapenemasas no MBL en estas cepas, lo que resulta útil en el laboratorio para dirigir de manera óptima la terapéutica aplicada a los pacientes, así como, la activación rápida de los programas de control de infecciones nosocomiales, para de esta manera evitar la diseminación de la resistencia.
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