Metabolism of the dibenzothiophene by Pseudomonas stutzeri PLC 16

Mariángela Bracho G.^1,3*, Luis Querales¹, Cateryna Aiello Mazzarri³ y Luz Marina Soto²

¹Laboratorio de Virología, Centro de Investigación del Agua, CIA.

²Laboratorio de Microbiología Acuática, Departamento de Biología, Facultad Experimental de Ciencias.

³Laboratorio de Fermentaciones Industriales, Departamento de Ingeniería Bioquímica, Facultad de Ingeniería. Universidad del Zulia, Apartado 526, Maracaibo, Venezuela. Telf.: 02617597193, Fax: 02617597182. *mabracho@gmail.com

Abstract

In this work, the degradation of dibenzothiophene (DBT) by Pseudomonas sutzeri PLC 16 was evaluated by the study of the bacterial growth kinetic in the presence of this hydrocarbon as only carbon source, and the analysis of its metabolites of degradation by UV spectrophotometry. The kinetic growth of Pseudomonas sutzeri PLC 16 was determined by the quantification of the bacteria number through the ephifluorescence microscopy technique. The bacterial oxidation of the DBT was evaluated through the appearance of the 3-hydroxy-2-formyl benzothiophene and trans-4-[2-(3-hydroxy)-thionaphthenyle]-2- oxo-3 butenoic acid, which are the main metabolites in the degradation of this compound. As result, a rate growth of the culture of 0.828 h-1 with a time of duplication of 0.837 hours were observed. The dibenzothiophene oxidation was verified observing the appearance of the metabolite accumulation maximum peaks at 48 and 96 hours, a period that agreed with the logarithmic growth phase of the culture, condition that evidence the oxidation of the dibenzothiophene by P. stutzeri PLC16 and the potential of this strains for future biotechnological applications.

Key words: Didenzothiphene, biodegradation, Pseudomonas.

Metabolismo del dibenzotiofeno por Pseudomonas stutzeri PLC 16

Resumen

En este trabajo se evaluó la degradación de dibenzotiofeno (DBT) por Pseudomonas sutzeri PLC 16 mediante el estudio de la cinética de crecimiento bacteriano en presencia del hidrocarburo como única fuente de carbono y del análisis por espectofotometría UV de los metabolitos de degradación. La cinética de crecimiento de P stutzeri se determinó mediante la cuantificación del número de bacterias a través de la técnica de contaje directo por microscopia de epifluorescencia. La oxidación bacteriana del DBT se evaluó a través de la determinación de la cinética de aparición del 3-hidroxi-2-formil benzotiofeno y el ácido trans-4-[2-(3-hidroxi)-benzotiofeno]-2-oxo-3 butenoico, principales metabolitos de la degradación del compuesto. Como resultado se observó, una constante de velocidad de crecimiento del cultivo de 0,828 h-1 con tiempo de duplicación de 0,837 horas en presencia de DBT. La oxidación del dibenzotiofeno se comprobó al observar la aparición de los picos máximos de acumulación de los metabolitos a las horas 48 y 96 del cultivo, período que coincidió con la fase de crecimiento logarítmico de la bacteria, condición que pone en evidencia la degradación oxidativa del dibenzotiofeno por P. stutzeri PLC16 y el potencial que presenta esta cepa para futuras aplicaciones biotecnológicas.

Palabras clave: Dibenzotiofeno, biodegradación, Pseudomonas.

Recibido el 30 de Junio de 2006 En forma revisada el 30 de Julio de 2007

Introducción

Los hidrocarburos poliaromáticos heterocíclicos presentes en el petróleo, al ser liberados en los ecosistemas, contaminan fuentes de agua y suelos, ocasionando un gran impacto ecológico, en virtud de los efectos recalcitrantes y tóxicos que ejercen sobre los seres vivos [1].

Esta situación, ha generado en los últimos años un creciente interés en el diseño y aplicación de biotecnologías, que complementen los métodos químicos y físicos tradicionales, con el fin de recuperar ambientes contaminados con petróleo [2]. Esta tecnología, denominada biorremediación, se basa en el uso de microorganismos para degradar los hidrocarburos contaminantes del petróleo y otros combustibles, hasta metabolitos que puedan ser removidos más fácilmente del ambiente [2, 3]. Es por ello, que se hace particularmente importante el aislar y caracterizar fisiológicamente cepas autóctonas que presenten la capacidad de degradar este tipo de hidrocarburos complejos, de manera que las mismas puedan ser empleadas en la recuperación de ambientes impactados con petróleo a una mayor velocidad, con un mejor rendimiento, a menores costos y sin los inconvenientes que representa utilizar cepas genéticamente modificadas [3, 4].

La degradación del dibenzotiofeno (DBT) por algunas especies bacterianas ha sido objeto de intensa investigación en los últimos años, convirtiéndose este hidrocarburo en sustrato modelo para los estudios de degradación, persistencia y bioacumulación de compuestos heterocíclicos azufrados del petróleo en el ambiente. Algunos grupos microbianos son capaces de utilizar el DBT y otros compuestos relacionados como fuente de carbono y energía para su crecimiento, biodegradándolo aeróbicamente hasta 3- hidroxi-2 formil benzotiofeno y otros metabolitos azufrados solubles en agua, que pueden ser removidos del ambiente por lavado, condición que abre la posibilidad de la aplicación de la degradación bacteriana de los contaminantes petrosulfurados con fines biotecnológicos destinados a la recuperación de ambientes impactados con petróleo [5].

En este trabajo se estudió la degradación de DBT por P stutzeri PLC 16 a través del estudio de la cinética de crecimiento de esta bacteria, empleando DBT como única fuente de carbono y del análisis espectrofotométrico de los metabolitos de degradación. Se demuestra de esta manera el potencial que poseen las bacterias autóctonas aisladas de suelos contaminados con petróleo, para la degradación de DBT.

Parte Experimental

Microorganismo de estudio

Se emplearon cultivos puros de la cepa Pseudomonas stutzeri PLC 16, la cual es capaz de degradar los hidrocarburos: antraceno, naftaleno, y fenantreno, aislada en trabajos previos mediante técnica de cultivos enriquecidos a partir de muestras de suelos impactados con petróleo [6].

Cinética de crecimiento bacteriano en DBT

Con el objeto de estudiar la cinética de crecimiento de P stutzeri PLC 16 en DBT se cultivó la cepa por duplicado, en fiolas de 250 mL que contenían 125 mL de Medio Mínimo Mineral (MMM) el cual contenía por litro de solución: 1,2 g de NH₄Cl; 2,4 g de KNO₃, 0,00067 g de CaCl₂ 2H₂O, 2,4 g de Na₂SO₄, 2,04 g de MgSO₄ 7H₂O, 0,65 g de K₂HPO₄ 3H₂O, 0,5 g de KH₂PO₄ 3H₂O, 0,02 g de FeSO₄, 7H₂O y DBT al 0,05%. [7].

Todas las fiolas se inocularon a una concentración de aproximadamente 1× 10³ cel/mL. Para ello, un cultivo de la cepa a estudiar en MMM al 0,05% de DBT se centrifugó a 10.000 g por 5 minutos, las células se lavaron dos veces con solución salina al 0,85% (pH 7,0) y fueron resuspendidas en la misma solución hasta alcanzar la concentración deseada. Una vez que las fiolas fueron inoculadas se incubaron a 37°C durante 8 días, tiempo durante el cual se tomaron muestras de 5 mL de cada fiola por duplicado.

Una de las muestras se empleó para estimar el crecimiento bacteriano midiendo la densidad óptica del cultivo a 660 nm, y con la otra se determinó la constante de velocidad de crecimiento (µ) y el tiempo de duplicación del cultivo (td) mediante la cuantificación del incremento del número de bacterias mediante la técnica de contaje directo por microscopía de epifluorescencia. Este método consistió en la fijación de la muestra con solución de formaldehído al 40% y tinción con el fluorocromo 4´,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), el cual tiene afinidad por el material genético de la bacteria. Posteriormente, se filtró al vacío la muestra sobre una membrana de policarbonato negro de 0,22 µm de tamaño de poro y se procedió a enumeración las células por contaje en un microscopio de epifluorescencia bajo luz UV [8].

Paralelamente se procesaron dos controles uno conteniendoMMMcon DBT al 0,05% sin inocular, para determinar la oxidación no biológica del hidrocarburo, y otro inoculado conteniendo únicamente MMM. Este último se usó para determinar si la bacteria tenía la capacidad de crecer en el medio de cultivo sin ninguna fuente de carbono disponible.

Degradación del DBT y formación de metabolitos

La oxidación bacteriana del DBT fue comprobada por la aparición de los metabolitos de degradación de la ruta oxidativa de este hidrocarburo. Para ello, se tomaron muestras de 5mL del cultivo y de los controles cada dos días, las cuales se filtraron a través de filtros milipore de 0, 2 µm de diámetro y se analizaron por espectrofometría UV determinando la absorbancia del filtrado a 390 nm y 480 nm, longitudes de onda de máxima absorción del 3-hidroxi-2-formil benzotiofeno y del ácido trans-4-[2-(3-hidroxi)-benzotiofeno]-2- oxo-3 butenoico respectivamente, principales metabolitos de degradación del DBT [5]. Los estudios espectrofotométricos se llevaron a cabo en un espectrofotómetro modelo Spectronic Génesis 5 de Spectronic Instruments.

Resultados y Discusión

En la curva de crecimiento de P. stutzeri en MMM con DBT como única fuente de carbono, se observó una rápida adaptación de la bacteria al hidrocarburo, ya que desde el inicio el cultivo estaba en fase de crecimiento logarítmico, en la que permaneció hasta la ultima medición del ensayo (hora 192 horas), momento en el que el cultivo alcanzó la máxima densidad celular que fue de 48 × 105 cel/mL (Figura 1). En presencia de DBT el cultivo mostró una velocidad de crecimiento máximo de 0,828 h^–1, con un tiempo de duplicación de 0,837 horas.

Es importante destacar que en el cultivo de P. stutzeri PLC16 enMMMsin DBT, no se observó crecimiento bacteriano, ya que la densidad celular del cultivo permaneció constante a lo largo de todo el período de incubación, hasta la hora 144 (día 6), cuando se observó la declinación de la concentración bacteriana. Estos resultados ponen en evidencia que en ausencia de dibenzotiofeno como fuente de carbono la bacteria no es capaz de crecer.

Al comparar los resultados obtenidos para los parámetros de crecimiento bacteriano en MMM y MMM con DBT, y destacando el incremento de la biomasa observada en fase logarítmica en presencia del hidrocarburo, puede aseverarse que la bacteria efectivamente creció utilizando el DBT como única fuente de carbono.

La constante de velocidad de crecimiento de Pseudomonas stutzeri PLC 16 en presencia de DBT, puede considerarse baja si se compara, con las constantes de crecimiento obtenidas para este mismo genero bacteriano en los medios de cultivo complejos y ricos utilizados rutinariamente en los laboratorios. Al respecto, Stanier et. al [9] reportan que el tiempo de duplicación para Pseudomonas putida en medio complejo es de 0,75 horas. Las diferencias observadas pueden atribuirse a la naturaleza del sustrato, ya que la fuente de carbono suministrada (DBT) no es fácil de degradar, debido a las propiedades fisicoquímicas que presenta, entre las que cabe mencionar su baja solubilidad en agua y la elevada energía de resonancia negativa que posee, lo cual, lo convierte en un compuesto termodinámicamente estable frente al ataque bacteriano [10].

Por otra parte, los valores de constante de velocidad de crecimiento de Pseudomonas stutzeri PLC 16 en presencia de DBT, obtenidos en este estudio, son mayores que los reportados en la literatura para el crecimiento de este genero sobre hidrocarburos aromáticos policíclicos y heterocíclicos (11,12), condición que pone en evidencia el elevado potencial degradativo que presenta esta cepa para metabolizar este tipo de compuestos. Al respecto, Díaz [13] reporta para Pseudomonas alcaligenes LDA19 valores constantes de velocidad de crecimiento de 0,022 h–¹ y 0,0111 h–¹, así como tiempos de duplicación de 31,4 horas y 62,04 horas en naftaleno y antraceno respectivamente. Por su parte, Soto [8] reporta el crecimiento de un cultivo puro de Bacillus sp en presencia de DBT como fuente de azufre con valores de constante de velocidad de crecimiento máximo de 0,020 h–¹ y tiempo de duplicación de 34,04 horas.

La cinética de aparición de los metabolitos de degradación del DBT: 3-hidroxi-2-formil benzotiofeno y Ácido trans-4-[2-(3-hidroxi)-benzotiofeno]- 2-oxo-3 butenoico, observada en este estudio, se ajustó a la cinética de crecimiento bacteriano mostrada por el cultivo de Pseudomonas stutzeri PLC 16 en el hidrocarburo (Figura 2), demostrándose que el incremento en la concentración bacteriana fue directamente proporcional al aumento de la absorbancia a 390 y 480 nm. Al respecto se observó que, las máximas concentraciones de estos metabolitos se produjeron a las 48 y 96 horas de incubación del cultivo, período que coincidió con la fase de crecimiento logarítmico del cultivo, lo que evidencia la degradación del DBT por P. stutzeri PLC 16 a través de la ruta de oxidación del hidrocarburo propuesta por Kodama [14] y la relación existente entre el crecimiento bacteriano y la degradación del hidrocarburo.

Es importante destacar la disminución del pico de máxima absorción del cultivo a 390 y 480 nm que se observa en la Figura 2 después de la hora 96 de incubación para ambos productos de degradación, esto puede ser debido al metabolismo o utilización de estos intermediarios por la población bacteriana para convertirlos en productos de menor peso molecular que continúan como intermediarios en la ruta de degradación oxidativa del hidrocarburo.

Conclusiones

Se demostró la degradación oxidativa del dibenzotiofeno (DBT) por un cultivo puro de Pseudomonas stutzeri PLC 16 a 3-hidroxi-2 formil- benzotiofeno, con una constante de velocidad de crecimiento del cultivo de 0,835 h–1 y un tiempo de duplicación de 0,837 h.

Los resultados obtenidos en esta investigación ponen en evidencia el potencial que presentan cepas aisladas en nuestra región, como la cepa de Pseudomonas stutzeri PLC 16, para futuras aplicaciones biotecnológicas destinadas a la recuperación de ambientes impactados con este tipo de compuesto.

Referencias Bibliográficas

1. Luan A., Keith S., Zhong A., Zhou B., Lan A., Nora F., Tam B.: “Study of metabolites from the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by bacterial consortium enriched from mangrove sediments”. Chemosphere, Vol. 65 (2006) 2289-2296.

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8. Soto L.M.: “Influencia de las relación es bacterianas ínter especificas en el proceso de biodesulfuración de hidrocarburos aromáticos”. Trabajo de Grado para optar al Título de Doctora en Ciencias, Universidad Central de Venezuela, Postgrado en Ecología, (2001) 65-68. 2001.

9. Stanier R., Igraham J., Wheelis M and Painter P.: “The Microbial World”. Prentice -Hall, Englewood Cliffs, USA (1986).

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13. Díaz L.: “Caracterización del perfil plasmídico, susceptibilidad a antibióticos y a metales pesados en bacterias hidrocarbonoclasticas aisladas de sedimento marinos”. Trabajo de Grado para optar al titulo de Magíster Scientiarum, Universidad del Zulia, Maestría en Microbiología, (2001).

14. Kodama K.: “Induction if dibenzothiophene oxidation by Pseudomonas jianii”. Agric. Biol. Chem, Vol. 41 No. 7 (1977) 1193-1196.