Demora mediada por fructosa del proceso de renaturalización de la cadena de triple helice de gelatina en medio acuoso

Jesús Enrique Dávila-Pérez^1,2*, Rafael Martín-Landrove²

¹: Física Médica C. A., Grupo de Radioterapia Oncológica GURVE, Centro Plaza, Avenida Francisco de Miranda, Caracas Venezuela.

²: Centro de Física Molecular y Médica, Escuela de Física, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela, Paseo Los Ilustres, Caracas, Venezuela. *e-mail: jdavila@fisicamedica.com.ve

RESUMEN

La desnaturalizacion de las cadenas de triple helice en gelatina, producto de la interaccion con radiaciones ionizantes y la evolucion del proceso de renaturalizacion fueron estudiados empleando una mezcla de gelatina tipo B de 250 Bloom y fructosa hidratada con agua tridestilada (gelatina + fructosa), la cual fue irradiada con rayos-X producidos por un acelerador lineal de uso clinico con un potencial de operacion de 6 MV para entregar dosis entre 30 y 300 Gy. Tanto la muestra virgen como las irradiadas fueron analizadas por medio de espectroscopia de masas e imagenes por resonancia magnetica (IRM) utilizando tecnicas basadas en difusion. Los resultados con espectroscopia de masas indican que en las muestras estudiadas no hubo formacion de nuevos compuestos para las dosis entregadas. Con tecnicas de difusion en un resonador magnetico de 1,5 T se pudo hacer el seguimiento de los cambios macroscopicos producidos en la mezcla de gelatina + fructosa correspondiendo a la desnaturalizacion y posterior renaturalizacion incompleta de la cadena de triple helice, lo que indica que ocurrieron cambios de la estructura porosa del material a nivel microscopico con un tiempo de media vida para la renaturalizacion de 12,46 ± 0,15 h.

Palabras Claves: Gelatina, Fructosa, Renaturalizacion, Radiacion, Espectroscopia de Masas, Resonancia Magnetica por Imagenes.

Delay in fructose-mediated renaturalization process for irradiated triple-helix gelatin chains in aqueous medium

ABSTRACT

The triple-helix denaturalization in gelatin as a result of its interaction with ionizing radiation and evolution of renaturalization process were studied in a hydrated mixture of 250 Bloom type B gelatin, fructose and tridistilled water (gelatin + fructose), which was irradiated with X-rays produced by a clinical linear accelerator with an operating potential of 6 MV in order to deliver a dose between 30 and 300 Gy. Irradiated and non-irradiated samples were analyzed with the use of mass spectroscopy and magnetic resonance imaging (MRI) with diffusion techniques. The mass spectroscopy results indicate that no formation of new compounds took place for delivered doses. With diffusion techniques in a magnetic resonance 1.5 T scanner a follow-up of macroscopic changes in gelatin + fructose mixture could be done as they correspond to a triple-helix denaturalization followed by its incomplete renaturalization, which is an indication that changes in the material porous structure at microscopic level happened with a renaturalization half life time of 12.46 ± 0,15 h.

Keywords: Gelatin, Fructose, Renaturalization, Radiation, Mass Spectroscopy, Magnetic Resonance Imaging.

Recibido: 23-05-2015 ; Revisado: 16-07-2015 Aceptado: 01-10-2015 ; Publicado: 12-12-2015

1. INTRODUCCIÓN

La palabra desnaturalización se define como alejarse o estar lejos de la forma natural; en un sentido termodinámico se refiere al cambio de un estado ordenado de las moléculas a otro desordenado, lo que trae consigo un incremento de la entropía del sistema. En este proceso las proteínas pierden las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria, sin que haya una hidrólisis del enlace peptídico; es decir, los enlaces principalmente afectados son los de hidrógeno, los hidrófobos y los iónicos y, en ocasiones, los disulfuros. Esto puede ocurrir por pasos bien definidos y a diferentes velocidades. Cuando una proteína sufre la ruptura de las uniones disulfuro que estabilizan su estructura terciaria es difícil que regrese a su estado natural; pero en ocasiones el proceso puede ser reversible como sucede con la reactivación (o renaturalización) de algunas enzimas.

La desnaturalizacion producida por las radiaciones ionizantes en colageno y gelatina tanto por electrones de alta energia asi como con fuentes de emision de rayos g ha sido objeto de estudio a traves de los anos [1-9]. Los cambios en las propiedades fisicas del colageno despues de la irradiacion correspondiente a dosis entre 50 y 500 kGy han sido reportados por Bowes et al. [8]. Los cambios en la perdida de cristalinidad analizados a partir del patron de difraccion por rayos X para dosis de 100 a 300 kGy, asi como los observados a la temperatura de gelificacion y el incremento en la solubilidad, indican que se genera una alteracion en la estructura molecular para dosis altas. Las perdidas relativas de aminoacidos varian con las condiciones de irradiacion y se ven afectados de igual forma los aminoacidos acidos y basicos asi como los que tienen una estructura en anillo.

Cheung et al. [2] irradiaron colágeno con rayos gamma a dosis altas donde muestran cómo las moléculas de colágeno se dañan fácilmente con dosis comúnmente utilizadas para la esterilización total de productos biomédicos, las cuales están en el orden de 1 Mrad (10 kGy). Al mismo tiempo reportan que la eficacia de la radiación a una dosis más baja que la utilizada para esterilizar completamente un material es cuestionable y en ese caso se observa un menor daño de la cadena principal del péptido de colágeno. Por encima de las dosis de esterilización total se demostró un daño significativo tanto en colágeno solo como en colágeno en una matriz de tejido reticulado preparado químicamente. El estudio de la digestión por una enzima mostró que frente a una exposición a una dosis muy elevada de radiación, el material resiste la degradación por pronasa. Sin embargo, el análisis de peso molecular mostró un número significativo de enlaces peptídicos que fueron escindidos por la radiación, los cuales podrían causar cambios considerables en las características del material a largo plazo. Leontiou et al. [11] demostraron utilizando microscopia electrónica que al irradiar fibras de colágeno de piel de ratón con radiación gamma y una dosis de 5 Gy, hay modificaciones estructurales de las mismas caracterizadas por un engrosamiento. Para ello compararon estructuras patrón sin irradiar, cuyo diámetro está en el intervalo 64 – 82 nm, con las irradiadas que alcanzaron el intervalo de 110 – 138 nm.

Los efectos reportados a dosis muy altas y muy bajas tanto sobre la gelatina como el colágeno no permiten inferir lo que debe ocurrir en el intervalo que va de decenas a centenas de Gy, ello nos motivó a plantearnos los siguientes objetivos para este trabajo: (a) Estudiar la composición y el comportamiento de la muestra de gelatina + fructosa al ser irradiada con dosis entre 30 y 300 Gy, mediante espectrometría de masas y técnicas de difusión por resonancia magnética, respectivamente. (b) Como parte del estudio por resonancia magnética, cuantificar particularmente el tiempo de vida media útil de la señal en el maniquí para ser analizado.

Adicionalmente es importante señalar que lo fundamental en aplicaciones dosimétricas es que el material sea capaz de producir un daño que pueda correlacionarse con la dosis absorbida tanto en intensidad como espacialmente en su volumen, así como permitir su observación durante un intervalo de tiempo que resulte manejable en la práctica.

1.1 Estabilización del Gel por Adición de la Fructosa

Se conoce que los azúcares modifican las propiedades de gelación de la gelatina, incrementando su resistencia a la deformación del gel y su punto de fusión. La red extendida de proteínas en la gelatina presenta entrecruzamientos que consisten de regiones donde la proteína ha revertido a la estructura de triple hélice del colágeno [12-14]. La estabilidad de esta estructura, y de aquí la estabilidad de la gelatina, está influenciada por el soluto agregado. Los azúcares y polioles son utilizados para estabilizar la estructura plegada original de proteínas globulares y fibrosas [15,16] debido a su capacidad de desarrollar estructuras tipo puente de hidrógeno con el agua. Estudios sistemáticos han mostrado que la estabilización depende del efecto del azúcar en las propiedades del agua como solvente aumentando su rigidez y punto de fusión debido al incremento en la estabilidad de la cadena de triple hélice [16, 18-20]. En este trabajo se escogió la fructosa por ser una hexosa que puede obtenerse con muy alto grado de pureza.

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 Preparación de las muestras para la irradiación

Se preparó una mezcla con 160,0 g de gelatina tipo B de 250 Blomm y 40,0 g de fructosa de alta pureza por litro de agua (0,2 g/mL) en baño de maría a temperatura de 35 ºC. Cada muestra se produjo introduciendo la mezcla en una esfera de vidrio de 16 cm de diámetro para formar un maniquí que emule los procesos de transporte de radiación en el cráneo de un paciente. Allí se dejó reposar a temperatura ambiente (22 ºC) por 4 horas y posteriormente se llevó a refrigeración a 4 ºC por 24 horas

2.2 Sondeo del maniquí virgen por resonancia magnética

Las muestras (maniquíes) fueron llevadas a un equipo de imágenes por resonancia magnética de 1,5 Tesla donde fueron adquiridas las imágenes del maniquí virgen, esto debido a que la difusión por resonancia magnética revela una imagen cuyo contraste es dependiente del movimiento del agua a través del gel el cual se ve alterado por la acción de la radiación. Para la obtención de los perfiles de los coeficientes de difusión se realizaron repetidas series de medidas utilizando técnica de imágenes con resonancia magnética (IRM) con secuencias que permiten obtener mapas del tiempo de relajación transversal T₂ y del tensor asociado al coeficiente de difusión.

2.3 Irradiación de las Muestras

Posteriormente los maniquíes fueron irradiados con un acelerador lineal de uso clínico cuyo potencial de aceleración es de 6 MV, utilizando una geometría de haz angosto y un tamaño de campo de 2,0 cm de diámetro. La forma de irradiación se realizó en un arco de rotación de 270 grados y a un conjunto de 3 muestras se les aplicó una dosis de 30, 100 y 300 Gy. Cada semana fueron irradiadas 3 muestras manteniendo una cuarta muestra virgen como testigo. Durante 10 semanas fueron irradiadas un total de 30 muestras en las mismas condiciones.

2.4 Espectroscopia e imágenes de las muestras

Tanto las muestras irradiadas como las no irradiadas fueron analizadas por espectroscopia de masa. El procedimiento consistió en disolver el gel en agua y añadir 0,5 mM de acetato de sodio y luego es introducido al equipo por inserción directa a la cámara para ionizar la muestra por ESI. Esta técnica tiene la ventaja de que la información en fase de solución se retiene completamente en fase gaseosa y el equipo utilizado fue un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo.

En los estudios de difusión se usa el método Stejskal-Tanner [21] (ver Figura 1), donde con un par simétrico de pulsos de gradiente se incrementa el desfasaje de los espines observados durante el espín-eco. Los espines que se mueven durante los gradientes de pulsos no recuperan la fase en el tiempo de eco TE y esto causa una pérdida en la amplitud de la señal, la cual viene dada por

S(TE) µ exp(-TE/T2) exp(-bD)     (1)

donde (g es el factor giromagnetico)

b = g² G^{2  d2} (D-^d/3)   (2)

La sensibilidad de la senal al movimiento esta determinada por el valor del parametro b . Grandes valores de b pueden obtenerse a traves de grandes amplitudes de gradientes G , pulsos de gradiente de larga duracion ^d , o tiempos entre pulsos de gradientes D que sean grandes. En la muestra en estudio con pequenos valores de D la tasa de crecimiento de la varianza del desplazamiento es baja y sufre poca perdida de senal. En cambio con grandes valores de D la tasa de crecimiento de la varianza del desplazamiento es alta y se produce una senal que se atenua significativamente.

Los geles estudiados en este trabajo van a ser isotropos y en consecuencia el coeficiente de difusion va a ser una cantidad escalar que es proporcional a la traza del tensor. En el protocolo de adquisicion de los datos se producen en principio imagenes donde hay una primera que esta ponderada en T2 (con b = 0 ), asi como tambien hay otras tres que estan ponderadas al mismo tiempo en T2 y en las componentes D_xx ≡ D₁, D_yy ≡ D₂ D_zz ≡ D₃ (con b =1000 s/ mm²).

El protocolo extrae la contribución de T2 en las últimas tres imágenes a través de un cociente simple del resultado de las dos ponderaciones anteriores y usando la Ec. (1). Se producen a continuación mapas de D₁, D₂ y D₃ tomando el logaritmo del cociente de señales. En principio se puede trabajar con la traza que indicamos anteriormente, pero dado que la muestra es isótropa y para reducir tiempo de adquisición se trabajó solamente con una componente. Una vez obtenidos los mapas del coeficiente de difusión se pueden extraer perfiles utilizando ventanas rectangulares. En este trabajo estas se tomaron de 16 cm de longitud y nueve pixeles de ancho.

3. RESULTADOS Y DISCUSSIÓN

3.1 Espectroscopia de masas

El espectro de masa de la muestra virgen patrón de la mezcla de gelatina y fructosa en agua de alta pureza se muestra en la Figura 2 y el correspondiente a la mezcla irradiada para una dosis de 300 Gy en la Figura 3. De la misma manera los detalles de ambos espectros para su comparación se presentan en la Tabla 1. Se hizo el análisis de todos los iones aductos que se pueden formar con el apoyo de una herramienta de computación desarrollada para ese propósito. El pico dominante, que vamos a encontrar en ambos espectros y que sirve de referencia para la abundancia relativa está ubicado en un valor m/z nominal de 203 y corresponde al ión aducto formado por la fructosa y el ión precursor de sodio, Na⁺, así como también hay contribución del aducto que incluye los aminoácidos de la gelatina glicina (Gly) y serina (Ser), además del ión precursor de sodio. Igualmente hay iones aductos que incluyen fragmentos de la fructosa para valores de m/z nominal de 127 y 145. Al comparar los dos espectros se observa que la posición de los picos es la misma y ello indica que con la irradiación no se producen compuestos diferentes a los ya existentes en el gel virgen. Hay picos asociados a bases de Schiff y fructosilamidas que debieron formarse al producir el gel por calentamiento y como resultado de reacciones entre la fructosa y los aminoácidos presentes en la gelatina. Estos picos los designamos en la Tabla 1 con las siglas BSF acompañadas con la abreviatura del aminoácido que debió tomar parte en la reacción. Todos los picos tienen asignadas contribuciones de iones aductos de aminoácidos con un ión precursor que puede ser H⁺, Na⁺ o H₃O⁺ y ellas compiten en porcentaje con aquellas relacionadas a compuestos BSF. Se observa entonces que la mayoría de los picos donde hay contribución de compuestos BSF sufren una reducción porcentual en la muestra irradiada como es el caso de BSF(Arg), BSF(Glu,Lys,Ala,Hlys,Arg), BSF(Hlys) y BSF(Ser) para m/z nominales de 85, 104, 127, 145, 180, 290 y 391, asociadas a los aminoácidos ácido glutámico (Glu), lisina (Lys), alanina (Ala), hidroxilisina (Hlys) y arginina (Arg). La excepción viene dada por un pico de BSF(Hlys), así como BSF(Hpro, Met, Leu, Ileu) y BSF(Tyr) para m/z nominales de 101, 312 y 362, respectivamente, los cuales están asociados a hidroxilisina, hidroxiprolina (Hpro), metionina (Met), leucina (Leu), isoleucina (Ileu) y Tyr (tirosina). Como en todos los picos hay contribución de aductos de aminoácidos de la gelatina, ese incremento puede deberse a una mayor presencia relativa de estos aductos después de la irradiación como ocurre particularmente con los picos de m/z nominales en 87 y 475. Vemos que picos relacionados con BSF(Hlys) reducen su contribución para m/z nominal de 127 y 145, lo que nos indica que su contribución en m/z nominal 312 debiera igualmente disminuir y el incremento global observado debe corresponder a aductos de aminoácidos. Dado que estamos empleando fructosa, se espera que la generación de bases de Schiff o fructosilamidas ocurra con mayor frecuencia con la hidrolisina y la lisina durante la generación del gel con calor y entonces con bases de Schiff o fructosilamidas asociadas al resto de los aminoácidos debe ocurrir igualmente una reducción. La reducción en los picos relacionados con compuestos BSF junto con el importante incremento de aquellos con picos de m/z nominal 87 y 475, sugiere que aparte de no haber producción de compuestos nuevos vamos a tener cambios estructurales en el material irradiado y ello da la motivación para estudiar el daño por radiación empleando técnicas de resonancia magnética por imágenes, lo cual va a ser considerado en las siguientes secciones.

3.2 Análisis de las imágenes obtenidas por resonancia magnética

3.2.1 Maniquí sin irradiación: perfil del coeficiente de difusión

Previo a la irradiación de la muestra de gelatina + fructosa se realizó un sondeo de la misma y la imagen obtenida con el mapa del coeficiente de difusión se muestra en la Figura 3. Esta prueba sirve como referencia de base para comparaciones posteriores con los maniquíes que recibieron irradiación. La imagen que se presenta en la Figura 4 se ve uniforme pero el perfil del coeficiente de difusión a lo largo de su diámetro revela que hay un máximo central como se ve en la Figura 5. Para el tratamiento cuantitativo de las imágenes va a ser fundamental encontrar la dependencia de ese perfil con la posición.

Para evaluar la dependencia del coeficiente de difusion con la posicion del punto de observacion en el maniqui esferico consideramos la funcion de Green asociada a difusion en presencia de una fuente puntual en para un medio homogeneo e infinito, en el instante t , punto de observacion  y que viene dada por la gaussiana

(3)

cuyo ancho s viene dado por  s² ≡ 2Dt , siendo D el coeficiente de difusion y es simetrica frente al intercambio de con . La cantidad s² es la varianza de la distribucion gaussiana del desplazamiento en el instante t , cuando la difusion ocurre en un medio homogeneo e infinito. Para

evaluar el coeficiente de difusion observado en un punto del maniqui no irradiado en principio se puede emplear una funcion de Green , que satisfaga condiciones de frontera homogeneas en la superficie esferica del maniqui y ella se puede obtener inmediatamente por el metodo de imagenes a partir de la funcion dada en la Ec. (3) con el resultado

(4)

para posteriormente obtener la varianza efectiva s ²_EF como 

(5)

donde el desplazamiento medio corresponde a

(6)

Para obtener el perfil podemos usar como referencia la varianza efectiva en el centro o en la superficie del maniquí no irradiado esférico. En nuestro caso el hacer el cálculo detallado de la varianza efectiva dada por la Ec. (5) puede ser un esfuerzo innecesario ya que s² = 2Dt<< R². Efectivamente el coeficiente de difusion del medio homogeneo e infinito correspondiente al gel debe tener como cota superior el coeficiente de difusion del agua libre sin barreras, el cual corresponde a 

D_{agua libre} =2560 ± 270 µm²/^S  (7)

y si suponemos un tiempo de medicion en el resonador de 10 minutos, asi como un maniqui de 16 cm de diametro, encontramos que

s^{2 £} s ² D _{agua libre} = 0.027 cm² << 256 cm² = R² (8)

y ello indica que podemos comparar las varianzas efectivas en el centro y el borde del maniqui con un calculo sencillo ya que en el primer caso tomamos simplemente el resultado de un medio infinito y en el segundo evaluamos la varianza en la pared de un medio semi-infinito. Entonces en el centro del maniqui esferico, reemplazando la Ec. (3) en la Ec. (5) y Ec. (6), obtenemos

(9)

Para trabajar el medio semi-infinito la funcion de Green debe anularse en la pared, la cual va a ser perpendicular al eje- z y esta colocada en z´=0. Volvemos a usar el metodo de las imagenes y el resultado es

(10)

Para obtener el desplazamiento medio dado en Ec. (7) hay que tomar el limite cuando z´®0 y entonces llegamos a

(11)

Empleando la Ec. (5) y la Ec. (10) la varianza efectiva en este caso pasa a ser la contribucion en x e y , la cual es de s²  cada una y debe sumarse a la contribucion 2 s²  en z , para finalizar restando con el resultado

(12)

Entonces a partir de la Ec. (9) y la Ec. (12) encontramos la fracción ƒ ₀ que representa el cociente del valor en el centro entre el valor en la superficie del maniquí esférico y que viene dada por

(13)

Igualmente se puede demostrar empleando la Ec. (10) que la derivada de s²_EF como funcion de z en la superficie se anula. Este ultimo hecho combinado con el resultado de la Ec. (13), donde se evidencia que s² _EF tiene un maximo en el centro, permite inferir que la funcion mas sencilla a considerar para representar el perfil es un polinomio de cuarto orden ya que al menos tres puntos tienen derivada nula como funciones de la posicion en el perfil, uno en el centro y los otros dos en los extremos. El perfil del coeficiente de difusion en el maniqui sin irradiar viene entonces dado por

(14)

Donde ahora 0 D es el coeficiente de difusión en la superficie, el cual es el único parámetro a ser ajustado. La Ec. (14) permite calcular el perfil mostrado en la Figura 5 el cual tiene un grado de acuerdo con los observado experimentalmente de 1.36% y va a ser empleado para el tratamiento cuantitativo que permite la obtención de la dosis como función de la posición.

3.2.2 Comparación de las imágenes de dos maniquíes irradiados, uno con gelatina y el otro con la mezcla de gelatina+fructosa

Se prepararon dos maniquíes, uno de gelatina y otro con la mezcla de gelatina y fructosa. Estos dos maniquíes fueron irradiados en idénticas condiciones y sometidos al sondeo por resonancia magnética para obtener los mapas del coeficiente de difusión.

En las imágenes de la Figura 6 se presenta la comparación de la irradiación del maniquí que contiene solo gelatina (Figura 6a) y el maniquí que contiene la mezcla de gelatina y fructosa (Figura 6b), irradiados en las mismas condiciones, es decir, 6 MV de voltaje acelerador y en un arco de rotación de 270 grados para producir la máxima entrega de 300 Gy en el centro. En ellas se puede ver claramente el efecto que produce la adición de la fructosa y que conduce a la visualización del daño por radiación en el maniquí.

Las imágenes corresponden a una de las componentes del tensor de difusión ya que por isotropía las otras dos no van a aportar más información. Hay una variación del coeficiente de difusión, donde los tonos más oscuros representan los valores más bajos y ello indica un cambio en la estructura de poros que debe alterar el transporte de agua en el interior del maniquí. Ello debe estar asociado al entrecruzamiento amino-fructosa que potencia el efecto sobre la desnaturalización de las triples hélices y es consistente con el análisis de los espectros de masas obtenidos, lo cual reitera que el único cambio es estructural. Este entrecruzamiento lleva al sellamiento de poros a todas las escalas y hace que la reparación de las cadenas de triple hélice se lleve a cabo en intervalos de tiempo más largos de manera que pueda ser detectado con técnicas de imágenes.

3.2.3 Efectos a observar con la variación de la dosis

Para explorar la respuesta del material cuando se entrega una dosis por debajo de 300 Gy, se irradiaron muestras para alcanzar dosis de 30 y 100 Gy. Por las intensidades relativas observadas en las imágenes producidas se desprende que el fenómeno tiene una memoria o una edad y que en consecuencia el sondeo debe hacerse en un tiempo lo suficientemente corto como para evitar que la intensidad de la imagen disminuya y no se pueda obtener la información requerida para la comparación con la dosis entregada. Esta alteración de la imagen hacia una disminución de la intensidad con el tiempo evidencia la existencia de mecanismos de reparación en el gel aun cuando tenemos gelatina en presencia de cantidades importantes de fructosa como las empleadas para la mezcla.

Para una verificación adicional de que hay mecanismos de reparación funcionando la siguiente prueba fue hacer el sondeo 72 horas después de la irradiación en el maniquí originalmente irradiado a 100 Gy y el resultado se presenta en la Figura 7. En este caso el mapa de coeficiente de difusión es completamente uniforme y carece de máximo central. Entonces podemos concluir que la señal se va debilitando por la reparación o renaturalización de las cadenas de triple hélice.

Con la motivación que proporciona el resultado anterior, donde a las 72 horas se obtiene un mapa de coeficiente de difusión uniforme, el mismo maniquí fue llevado a irradiación nuevamente pero ahora a una dosis de 300 Gy con el propósito de observar la respuesta a la radiación del gel que ha sido reparado y la reversibilidad que pudiera exhibir dado que uno de los componentes de la mezcla es gelatina. En la Figura 8 podemos apreciar la imagen del maniquí que ha sido irradiado nuevamente para alcanzar una dosis de 300 Gy.

Como en la Figura 8 la imagen ofrece un mapa completamente uniforme podemos concluir que la reparación de las cadenas de triple hélice por efecto de la renaturalización es necesariamente incompleta ya que el gel no regresó a su estado original y entonces estamos en presencia de un comportamiento irreversible. Ese no sería el caso si se irradia un maniquí virgen para alcanzar la misma dosis de 300 Gy y el mapa de coeficiente de difusión corresponde a lo mostrado en la Figura 6b donde hay una clara variación en el espacio. Podemos decir entonces que la desnaturalización de las cadenas producto de la irradiación conduce a una regeneración parcial que altera considerable las funciones del material. Ello no hace el gel reversible y el maniquí no puede usarse para varias irradiaciones. Desde el punto de vista de la práctica clínica esto no es un problema porque los materiales son de fácil acceso y bajo costo.

Analizando lo anterior podemos representar la evolución del maniquí como se indica en la Figura 9. Allí vemos que mientras el maniquí está sin irradiar los poros dentro de la matriz del gel están uniformemente distribuidos y como se muestra en la Figura 5, el coeficiente de difusión en el centro del maniquí tiene un máximo. Luego que el maniquí se irradia la distribución de poros se modifica quedando parcialmente conectada de acuerdo a la zona irradiada y a la dosis entregada. La distribución de poros se afecta localmente y en este caso podemos hablar de una difusión restringida debido a la desnaturalización de las cadenas de triple hélice, lo que lleva a una mayor caída del coeficiente de difusión en las regiones de mayor entrega de dosis. Posterior a esto sucede la renaturalización de las cadenas volviendo a formarse las triples hélices pero no con la configuración original. Debido a esto, los poros se encuentran aislados y parcialmente conectados y la difusión pasa a ser uniforme en todo el gel. Este hecho impide que el gel pueda ser reutilizado para producir cambios con una nueva irradiación.

Un resultado reciente que confirma y complementa estos resultados es el obtenido por Zhang et al. [22] donde se evaluó la arquitectura de los poros internos y las propiedades mecanicas de hidrogeles del colageno cuando se produce entrecruzamiento por efecto de la radiacion gamma, encontrandose que los poros disminuyen de tamano y el modulo de compresion aumenta.

3.2.4 Teoria asociada al perfil del coeficiente de difusion

Para analizar el problema de manera conveniente consideramos perfiles como los mostrados en la Figura 10. Las mediciones se realizaron para TE= 90,752 ms , TR=3107,9 ms y  b =1000 s/mm². Alli vemos que la region de interes (normalmente abreviada como ROI, region of interest) corresponde a una ventana rectangular cuyo ancho se selecciona para reducir ruido y al mismo tiempo no producir una distorsion importante en el valor de la senal.

Una primera observación experimental que es fundamental para establecer la teoría es encontrar que a través de una transformación lineal los perfiles hallados a 30, 100 y 300 Gy se pueden hacer coincidir dentro de los errores experimentales como puede verse en la Figura 11. Esto va a tener importantes consecuencias que van a ser examinadas más adelante en esta sección y aun en la circunstancia en la que este resultado no sea exacto, ello nos va a permitir dar un paso necesario en la construcción de la teoría.

Para la comparacion de los perfiles hay que recurrir a esta transformacion lineal debido a que el resonador en el manejo de las imagenes utiliza una ventana variable de tonos de gris donde hay cambio de escala y de linea base, lo que obliga a trabajar el perfil del coeficiente de difusion en unidades arbitrarias. Para encontrar los factores de escala y linea base se recurrio a un procedimiento de optimizacion donde uno de los perfiles se toma como referencia. Para encontrar esas cantidades en el caso del perfil a, distinto del que hemos tomado como referencia, buscamos el minimo de la funcion de costo D_a dada por

 (15)

donde N_P es el numero de puntos experimentales y es el conjunto de datos crudos del perfil de coeficiente de difusion experimental que va a ser tomado como referencia. De la misma manera es el perfil experimental transformado del coeficiente de 

difusion, correspondiente al perfil de dosis D_a y que viene dado por

  (16)

donde representa el conjunto de datos crudos asociados al coeficiente experimental para el perfil de dosis D_a, asi como S_a y 

L_a son respectivamente el factor de escala y la linea base que van a permitir la superposicion. Como nuestro principal interes esta orientado a desarrollar un nuevo metodo en dosimetria aplicada a radioterapia, la referencia la vamos a tomar con el perfil de 30 Gy por ser el mas cercano a las aplicaciones. Los resultados de las optimizaciones se presentan en la Tabla 2 donde se puede observar que el valor porcentual tanto de la funcion de costo como del error medio sobre el perfil promedio, estan por debajo del valor de la incertidumbre experimental de 4.17%. A continuacion se va a extraer la forma funcional del perfil del coeficiente de difusion partiendo de observaciones experimentales como la que acabamos de presentar.

Para ello consideramos el perfil del coeficiente de difusion en su forma mas general como  D_dif,a [z, D_a (z), t_a] y ello significa que depende del instante de tiempo t_a en que se realiza la observacion, del perfil de dosis  D_a(z) y en principio depende de la posicion z que estamos tomando a lo largo del maniqui esferico.

Al examinar experimentalmente la evolucion del perfil del coeficiente de difusion encontramos dos aspectos importantes, uno es que este se extingue entre uno o varios días a partir del momento de la irradiación según la dosis entregada total y se llega a un perfil que dentro de la incertidumbre experimental es constante con respecto a la posición z , es decir, carece de estructura. El otro es que según lo mostrado en la Figura 11 la forma no cambia con la posición z conforme el tiempo transcurre, aunque su amplitud debe decrecer. Estas dos observaciones llevan a considerar

(17)

donde T (t_a) decrece de manera que T (t_a®¥) ® 0 y tomamos T ( t_a = 0) =1 y los detalles restantes del perfil se incluyen en H[z, D_a (z)] . Por otro lado B_a(t_a) debe alcanzar un valor de saturacion cuando t_a®¥ y esto permite obtener para tiempos de observacion largos el perfil sin estructura anteriormente comentado.

Otra consecuencia de lo observado en la Figura 11 es que T (t_a) debe ser una exponencial decreciente en el tiempo y ello esta fundamentado en que la exponencial es la funcion que preserva su forma frente a un desplazamiento finito del dominio, es decir, al considerar un corrimiento en el tiempo t ® t -t₀ vemos que

(18)

El corrimiento en el tiempo produce escalamiento a traves de un factor multiplicativo, aspecto que sera tomado en cuenta mas adelante. El que la exponencial sea decreciente se desprende de que T (t_a®¥) ® 0 . El mismo argumento no aplica en general para B_a(t_a) ya que corresponde a una linea base, pero lo que si es cierto es que T (t_a) y B_a(t_a) van a estar correlacionadas en su evolucion al proceso de reparacion que ocurre en el material despues de la irradiacion.

La funcion H[z, D_a (z)], contiene la informacion relacionada con el dano producido por irradiacion en el material para t_a= 0. Teniendo en cuenta la situacion donde se irradia el maniqui uniformemente de manera que D_a (z) es una constante C₀ para cualquier z, podemos escribir 

(19)

Donde ƒ_v(z)  es el perfil del maniqui virgen o sin irradiar y ello es el resultado de producir dano de manera uniforme, que al no alterar la forma y tener en consecuencia un medio uniforme el perfil del coeficiente de difusion resultante debe ser proporcional al perfil original. La Ec. (19) permite factorizar H[z, D_a (z)], como 

 H[z, D_a (z)]≡ ƒ_v(z)F[D_a (z)]  (20)

y entonces la forma final para  D_dif,a [z, D_a (z), t_a]  corresponde a 

(21)

donde T(t_a) ≡ exp (- l_Rt) y l_R debe ser la constante de desaparicion del dano debido a la radiacion por el efecto de los mecanismos de reparacion. En la misma forma podemos hablar de un tiempo de media vida dado por  T_R ≡ ln2/l_R . Es importante senalar que debido a que la determinacion con el resonador del perfil del coeficiente de difusion no es absoluta por el manejo que se hace de la imagen con ventana variable de tonos de gris, no es posible observar directamente la caida de la exponencial. No obstante haciendo uso de las Ecs. (17) y (21) se puede notar que

(22)

donde vemos que la Ec. (22) tiene la misma forma que la Ec. (16) y esta asociada a un corrimiento temporal. El factor de escala S_b viene dado por . Al examinar el contenido de la Tabla 2 para los perfiles tomados para dosis totales de 100 y 300 

Gy se observa que los correspondientes factores de escala tienen valores muy cercanos, lo cual es compatible con el hecho de que el tiempo de observación después de la irradiación es el mismo y no son iguales por la incertidumbre experimental (2.06% en este caso). Entonces se obtiene como resultado 

l_R = 0.0556 ± 0.0007 h^-1

T_R = 12.46 ± 0.15 h

y la escala de tiempo observada en la practica para la extincion de los perfiles es consistente con este resultado.

4. CONCLUSIONES

Al irradiar la mezcla de gelatina y fructosa propuesta se produce un daño en el material que altera su estructura de poros y por ende sus propiedades de transporte. Cuando se hizo la prueba con y sin fructosa se pudo comprobar que la respuesta se genera en la muestra que contiene fructosa y no en la que contiene solo gelatina. Esto solo comprueba el hecho que la gelatina se autorepara luego del impacto con radiaciones ionizantes y que al añadirle fructosa a la preparación, está va a hacer más lenta la reparación del daño al punto de hacerla incompleta. Esto queda demostrado cuando al irradiar nuevamente no se producen daños detectables en la muestra que puedan observarse por los métodos de imágenes. La reparación incompleta de la triple hélice es lo que permite que el fenómeno pueda ser observado en las imágenes de resonancia magnética. Aunque la señal al cabo de unos días desparece del maniquí, el material no queda en el estado original debido a la reparación incompleta. La irradiación del maniquí y tiempo de medición deben estar sincronizadas para evitar que la señal caiga tanto en intensidad que no pueda ser detectada por el equipo de resonancia magnética por imágenes. Las pruebas dieron satisfactorias para 30 Gy medidos 2 horas después, 100 Gy y 300 Gy medidos 24 horas después.

5. AGRADECIMIENTOS

Agradecimiento especial al Grupo Gurve de Radioterapia Oncológica y a Física Médica C.A. por el apoyo institucional y económico para la realización de este trabajo. También agradecemos al Servicio de Imágenes MEDIMAGEN y a su personal técnico por el apoyo y colaboración en la realización de los estudios de imágenes con resonancia magnética, al Laboratorio de Espectroscopia de Masas del Centro de Química del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas y a la MSc Ana Angarita por permitirnos realizar el análisis de las muestras en estudio.

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