Cambios en la Patogenicidad de Eimeria acervulina  en Presencia de Aflatoxina B₁ en Pollos de Engorde

 

Rosmar V. Marcano M.^*,¹  José M. Carabaño E.^*, Elías R. Ascanio E.^** y Luis A. Silva^***

 

^*Cátedra de Medicina Poblacional, ^** Cátedra de Farmacología, ^***Cátedra de Histología. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Central de Venezuela. Apartado 4563. Maracay 2101A, Estado Aragua,Venezuela

   

Resumen

 Con objeto de estudiar los efectos de la Aflatoxina B₁ (AFB₁), Eimeria acervulina (E. acervulina) y la combinación de ambos factores, sobre los pollos de engorde, se realizó un estudio bajo un diseño completamente aleatorizado con arreglo factorial 3², con dos factores: niveles de AFB₁ de no detectables, 20 y 200 mg/kg  y tres niveles de infestación con E. acervulina de 0, 250.000 y 500.000 oocystos. El experimento contó con un total de 216 aves y una duración de 5 semanas. El alimento fue contaminado con un estándar de AFB₁  y se verificó los niveles deseados con la técnica de inmunoafinidad Aflatest^®. Cada réplica recibió alimentación ad libitum y a la cuarta semana fueron inoculados con oocystos de E. acervulina. A la quinta semana, se realizó la necropsia y toma de muestras para histología y parasitología. Los frotis por aposición para E. acervulina resultaron positivos para los tratamientos donde hubo infección. Los resultados histológicos para E. acervulina evidencian los efectos de los dos niveles de inóculo sobre el duodeno. Cuando están presentes las dos variables se presentan dos situaciones. Para el nivel de 20 mg/kg de AFB₁, hubo un aumento de la patogenicidad por E. acervulina para ambos inóculos, en cambio para el nivel de 200 mg/kg de AFB₁,  por el efecto de erosión epitelial de ésta sobre la vellosidad, hubo una disminución de la patogenicidad para los dos inóculos de E. acervulina. Sobre la ganancia de peso no se evidenció interacciones estadísticamente significativa entre las  variables; hubo influencia tanto de la AFB₁ con sus dos niveles, como con los dos inóculos de E. acervulina, produciendo una disminución estadísticamente significativa en comparación con el tratamiento control. En conclusión, existe evidencia de que niveles de 20 mg/kg de AFB₁ pareciesen hacer al duodeno más susceptible para la infección con E. acervulina, mientras que nivel de 200 mg/kg de AFB₁ parece disminuir la patogenicidad de E. acervulina. No se evidenció interacción entre la AFB₁ y la E. acervulina sobre la ganancia de peso de las aves. 

 (Palabras clave: Pollos de engorde,  aflatoxinas, patogenicidad, Eimeria acervulina)

Patogenicity Changes of Eimeria acervulina in Presence of Aflatoxin B₁ in Broiler Chickens

 Abstract

 With the purpose of studying the effects of the Aflatoxin B₁ (AFB₁), Eimeria acervulina, and its combination, was performed a study on broilers following  a design of treatments factorial type 3² totally randomized; with two factors: AFB₁ levels with non detectables levels, 20 and 200 mg/kg and E. acervulina with oocysts levels of 0, 250.000 and 500.000. The study included a total of 216 birds, during 5 weeks. Feed was contaminated with an AFB₁ standard, and desired levels were verified with Aflatest^® inmmunoaffinity technique. Each replica was feeded ad libitum. On the fourth week of age chickens were inoculated with E. acervulina. At the fifth week necropsy was performed and samples were collected for histopathological and parasitological studies. The apposition smears of E. acervulina resulted positive for the treatments where there was coccidia infection. The histologic studies for E. acervulina evidenced the effects of the two levels of treatment on the duodenum. When the two variables are present two situations are presented. At the level of 20 mg/kg of AFB₁ there was an increase in the pathogenicity for E. acervulina for both treatments. On the other hand at the level of 200 mg/kg of AFB₁, due to epithelial erosion effect on the intestinal villi, there was a decrease of the pathogenicity for the two treatments of E. acervulina. As for the effects on the weight gain it did not evidence statistically significant interaction between the two variables; but there was influence of the two levels of AFB₁ as with the two treatments of E. acervulina, producing a statistically significant of decrease in comparison with control treatment.   In conclusión there is evidence that  a level of 20 mg/kg of AFB₁ appears to make more susceptible the duodenum to E. acervulina infection. As long as the level of 200 mg/kg of AFB₁, it seems to decrease the pathogenicity of E. acervulina. There is no interaction between AFB₁ and E. acervulina on the weigth gain of chickens. 

 (Key words: Broiler chickens, aflatoxins, pathogenicity, Eimeria acervulina)

 Recibido: 10/05/06 - Aprobado: 18/09/06

 Introducción

 Las micotoxinas son un problema de interés mundial, por el hecho de  presentarse en localizaciones geográficas diferentes. Los problemas relacionados con micotoxinas pueden producirse en zonas tropicales a la altura del nivel del mar, lo mismo que en climas más frescos con una temperatura ambiental algo más baja (Wyatt, 1984).

Las Aflatoxinas son metabolitos fúngicos altamente tóxicos y carcinógenos originados por Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomius y Penicillium puberulum (Hoerr, 1991). Son reconocidas como unas potentes toxinas hepáticas, dentro de las cuales la más potente es la B₁. Sus efectos en animales varían según la dosis, tiempo de exposición, edad, especies y el estado nutricional. Dosis sub-letales producen una toxicidad crónica y pueden resultar en cáncer. Exposición a altas dosis puede conducir a una toxicidad aguda que afecta la sanidad y productividad animal. Los principales sistemas orgánicos afectados son el hepático, el inmunológico y el hematopoyético (Hoerr, 1991; Jordan  y Pattison, 1996)

Según  Guzmán (1991) y Carabaño et al. (1997), la AFB₁  produce erosión del epitelio intestinal, el cual es el principal lugar donde se alojan las coccidias como la E. acervulina. Aunado a ésto,  la coccidiosis es una patología de alta incidencia en el trópico.

La coccidiosis es una enfermedad que puede afectar cualquier tipo de explotación avícola (reproductoras, ponedoras o pollos de engorde), debido al ciclo de vida directo y corto del parásito y a su alto potencial reproductivo (Malcolm y McDougald, 1991). Los parásitos protozoarios del Género Eimeria se multiplican en el aparato intestinal y ocasionan daño tisular con interrupción de la alimentación y de los procesos digestivos o de absorción de nutrientes, deshidratación, pérdida de sangre, mortalidad y aumento en la susceptibilidad a otros patógenos infecciosos. La gravedad de la infección puede variar con la especie de coccidia, la cantidad de oocystos ingeridos y el estado inmunológico del ave  (Ruíz, 1990).

La  E. acervulina  produce una coccidiosis de tipo crónica, la cual tiene un gran impacto económico por su efecto en la ganancia de peso y la conversión alimenticia (Ruíz, 1984).

El objetivo de esta investigación fue evaluar la patogenicidad de E. acervulina en presencia de diferentes niveles  de AFB₁ evaluando los cambios morfológicos y  la respuesta productiva de los pollos de engorde sujetos a estudio.

 Materiales y Métodos

Tipo de estudio

Se realizó un estudio experimental, descriptivo y correlacional; bajo un diseño de tratamientos completamente aleatorizado tipo factorial 3²;  donde los factores fueron la AFB₁ y los niveles de oocytos de E. acervulina: no detectables, 20 y 200 mg/Kg para la AFB₁ y 0, 250.000 y 500.000, respectivamente.  Estos niveles fueron seleccionados  con base a estudios realizados anteriormente por diferentes autores (Ruíz, 1990; Carabaño et al., 1997; Carabaño, 1999, Carabaño et al., 2001). Para el nivel de 20 mg/kg de AFB1 por ser el mínimo permitido por la FAO,  en  alimento de aves, se tomó como referencia para evaluar si existían o no efectos utilizando este nivel. El experimento constó de nueve tratamientos con cuatro réplicas por tratamiento y 6 aves por cada réplica distribuidos de la siguiente manera: T1: niveles no detectables de AFB₁ con 0 oocytos de E. acervulina; T2:  niveles no detectables de AFB₁ con 250.000 oocytos de E. acervulina; T3: niveles no detectables de AFB₁ con 500.000 oocytos de E. acervulina; T4: 20 mg/kg de AFB₁ con 0 oocytos de E. acervulina; T5: 20 mg/kg de AFB₁ con 250.000 oocytos de E. acervulina; T6: 20 mg/kg de AFB₁ con 500.000 oocytos de E. acervulina; T7: 200 mg/kg de AFB1 con 0 oocytos de E. acervulina; T8: 200 mg/kg de AFB₁ con 250.000 oocytos de E. acervulina; T9: 200 mg/kg de AFB₁ con 500.000 oocytos de E. acervulina.

 Lugar y población 

El ensayo se llevó a cabo en el galpón experimental de la sección de aves en la Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Central de Venezuela (FCV-UCV). Dicho galpón fue lavado y desinfectado previo a dejar las aves en jaulas metálicas de 60 x 60 x 45 cm. Las jaulas modificadas para hacer su ambiente lo más parecido a las condiciones normales de los galpones, se les colocó cama de concha de arroz y una fuente de calor para su recepción. Se utilizaron 216 pollitos de engorde, machos de la línea comercial Arbor Acres, de un día de nacidos, no vacunados, clasificados como de «primera», recibidos con agua y alimento  suministrados ad libitum durante todo el ensayo.

 Preparación del alimento 

Formulación de la dieta basal: El alimento utilizado en el ensayo, se elaboró en la Planta de Alimento del INIA (Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias), considerando los requerimientos nutricionales de las aves según el manual de la Línea Arbor Acres. Se realizó el análisis de las materias primas para Aflatoxina B₁ y Ocratoxina A por los métodos de anticuerpos monoclonales (Aflatest^®) (Benjamín y Radlo, 1987) y prueba inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) (Enríquez y Ramírez, 1994), siendo negativo para ambas micotoxinas. 

Contaminación del alimento: Luego  de la preparación del alimento, se extrajeron 4 kilos, los cuales fueron traslados al Laboratorio de Farmacología de la  FCV – UCV, donde se realizó la contaminación con la AFB₁. Para ello se utilizó un estándar de AFB₁ (Laboratorios SIGMA C.A., USA, 1999). Los 4 kilos de alimento se dividieron en: 2 kilos para la contaminación con 20 mg/kg y los otros 2 kilos para la contaminación con 200 mg/kg;  agregándoles la cantidad de estándar necesario. Posteriormente se colocaron en un agitador por un lapso de dos horas. Cada uno de los dos kilos de alimento contaminado se mezclaron con 10 kilos sin contaminar durante 10 minutos en una mezcladora de 40 kilos y luego se mezcló al resto de los 200 kg de concentrado restantes en una mezcladora horizontal durante 15 minutos. Una vez obtenido el alimento concentrado final, se realizó el análisis por la Técnica de inmunoafinidad, Aflatest^® (Benjamín y Radlo, 1987) para la detección de las cantidades esperadas. 

Registros: Se llevó diariamente la cantidad de alimento suministrado en kilos y  la mortalidad. Se realizaron pesajes semanales de las aves, en una balanza mecánica (Ohaus). El pesaje se efectuó tomando la totalidad de los pollos de cada réplica (6 aves). 

Contaminación con E. acervulina: A  la cuarta semana se practicó la infección de las aves con oocystos de E. acervulina. Dicho inóculo fue obtenido de una cepa de campo, donde se encontraban oocystos de E. acervulina  y  E. tenella. Esta cepa de campo se les suministró a 6 pollos para lograr la reactivación y la producción de mayor cantidad de oocystos. Luego se preparó el inóculo (Ruíz, 1990) calculándose de esta manera la cantidad del mismo a suministrar a cada ave para lograr las dosis infectivas de 250.000 y 500.000 oocystos, respectivamente.

 Fase experimental  

La fase experimental fue de 5 semanas. A la quinta semana de edad, las aves fueron sometidas a una evaluación clínica, posteriormente pesada, y luego sacrificadas por sangramiento de la vena yugular. Luego se les realizó el examen físico externo y se procedió a realizar la necropsia para la toma de las muestras de los órganos de interés. Se hizo evaluación macroscópica de los órganos internos y se tomaron muestras de hígado y duodeno; las cuales fueron colocadas en formol al 10% para evaluación  histopatológica. Se tomaron muestras de duodeno y se realizaron frotis por aposición para determinar la presencia o no de oocystos.

El comportamiento productivo de las aves se evaluó siguiendo los parámetros de consumo de alimento, ganancia de peso, conversión alimenticia y porcentaje de mortalidad.

 Estudio histopatológico 

Las muestras de hígado y duodeno recolectadas durante la necropsia fueron procesadas para estudios histopatológicos efectuándose cortes en  secciones de 5 a 7 micras teñidas con hematoxilina-eosina (Stevens y Lowe, 1998) y evaluadas al microscopio de luz. Finalmente, se tomaron microfotografías de las lesiones con el fotomicroscopio con cámara incorporada  Carl Zeiss con objetivos de 2.5, 10 y 16x y una película kodak color de asa 100.

 Frotis por aposición 

Se realizó la observación macroscópica del intestino y se procedió a seccionar una pequeña parte de su pared (aproximadamente de 1 cm), la cual se frotó y comprimió suavemente sobre la superficie de una lámina, realizando un extendido delgado de la mucosa intestinal  para adherir el epitelio, lámina propia y sub-mucosa. Se agregaron 2 gotas de solución fisiológica y se colocó el cubreobjeto, para la obtención de un frotis fresco (Ruíz, 1990). Finalmente, se evaluó al microscopio para evidenciar la presencia o no de oocystos. 

 Análisis estadístico 

Los resultados obtenidos luego de las 5 semanas de ensayo, fueron organizados y tabulados, y luego analizados (SAS, 1989) de acuerdo a un diseño completamente aleatorizado, efectuándose un análisis de varianza. Los casos donde se presentaron diferencias significativas fueron analizados por pruebas de comparaciones múltiples de Duncan. Las variables medidas fueron peso promedio del ave durante las 5 semanas e incremento de peso en ese período.

 Resultados y Discusión

 Estudios anatomopatológicos

Los resultados obtenidos en el presente estudio permiten evidenciar los efectos individuales de la AFB₁, E. acervulina y de la combinación de ambos factores.   Es de hacer notar que en este ensayo no hubo un cuadro clínico de intoxicación aguda, por lo que las aves no manifestaron ninguna signología clínica. No se presentó efecto sobre la mortalidad de ninguno de los tratamientos en estudio. A continuación  se describen los hallazgos en duodeno estudiado bajo los diferentes tratamientos. 

 Duodeno

Las aves del grupo control, mostraron macroscópicamente un aspecto normal, sin lesiones aparentes. Microscópicamente, se observaron vellosidades con revestimiento epitelial conservado, de aspecto normal  (Figura 1).

Figura 1. Microfotografía de mucosa duodenal de pollo de engorde (37 días de edad) con tratamiento de niveles no detectables de AFB₁ y0 oocystos de E. acervulina,  mostrando vellosidades con revestimientoepitelial conservado de aspecto normal (A). Coloración H y E. 125 X

 La mayoría de los estudios macroscópicos de los efectos de  Eimeria sobre el duodeno se reportan por la escala de Johnson y Reid (1970), siendo Ruíz  (1990) y Malcolm y McDougald (1991), los que principalmente hacen referencia a los estudios microscópicos.

Con el inóculo de 250.000 oocystos se observó, macroscópicamente según la escala de Johnson y Reid (1970), lesiones +1 que indican presencia de estrías blancas en la mucosa orientadas en sentido transversal. Estos resultados, se corresponden con los reportados por Ruíz (1990) y  por Malcolm y McDougald (1991). Microscópicamente se observó un infiltrado linfocitario de leve a moderado en el corion de la vellosidad, con presencia de formas sexuales (macrogametocitos y microgametocitos) de E. acervulina de leve a moderada.  Ruíz (1990) y Malcolm y McDougald (1991), describen la presencia de un infiltrado linfocitario y de formas parasitarias dentro de las vellosidades, lo cual corrobora los resultados encontrados en este   tratamiento. Sin embargo, la distribución de las formas parasitarias no fue uniforme, observándose moderada carga de ésta en unos campos y leve carga en otros. 

Macroscópicamente para el tratamiento con 500.000 oocystos se observó lesiones entre +1  y +2 en la escala de Johnson y Reid (1970), lo cual señala una mayor presencia de estrías blancas en la mucosa, orientadas en sentido transversal con tendencia a la formación de placas. Microscópicamente se notó erosión epitelial moderada por efecto de las coccidias (macrogametocitos y microgametocitos), con una infección parasitaria masiva, congestión, edema y atrofia de la vellosidad (Figura 2). Estas lesiones fueron más severas que las observadas con la inoculación del tratamiento anterior y concuerdan con las reportadas por Ruíz (1990) y Malcolm y McDougald (1991).

Figura 2. Microfotografía de mucosa duodenal de pollo de engorde (37 días de edad) con tratamiento de niveles no detectables de AFB₁ y 500.000 oocystos de E. acervulina. mostrando erosión epitelial por efecto de la coccidias (A). Nótese la infección parasitaria masiva, congestión, edema de la vellosidad. Coloración H y E. 125 X.

 En el tratamiento de 20 mg/kg de AFB₁ y 0 oocystos de E. acervulina, macroscópicamente se observó hemorragia y edema leve de la mucosa con un valor 0 en la escala de lesiones, es decir, sin lesiones de coccidias. Microscópicamente se observaron vellosidades conservadas con la lámina epitelial sin lesiones aparentes. En el estudio macroscópico con 20 mg/kg + 250.000 oocystos se evidenciaron lesiones +2, con presencia de estrías blancas en la mucosa, orientadas en sentido transversal con tendencia a la formación de placas. En el estudio microscópico las vellosidades revelaron una presencia moderada de gametos de coccidias intraepitelialmente, congestión de vasos sanguíneos, hemorragia, edema del corión y atrofia (Figura 3). Estos resultados se corresponden con los de  Johnson y Reid (1970), Ruíz (1990) y Malcolm y McDougald (1991). Aún cuando la dosis del inóculo fue de 250.000 oocystos, las lesiones fueron más severas en presencia de la AFB₁, que cuando la E. acervulina se encontró en forma individual.

 

 

Figura 3. Microfotografía de mucosa duodenal de pollo de engorde (37 días de edad) con tratamiento de 20 mg/kg de AFB₁ y 250.000 oocystos de E. acervulina. Se observan vellosidades con presencia moderada de gametos de coccidias intraepiteliales (A), congestión de vasos sanguíneos, hemorragia (B) y edema  del corion. Coloración H y E. 125 X.

 Para la evaluación macroscópica del tratamiento de 20 mg/kg de AFB₁ y 500.000 oocystos de  E. acervulina, se observaron lesiones +4 en la escala de Johnson y Reid (1970), con presencia de estrías blancas fusionadas en la mucosa, congestión, petequias, engrosamiento de la pared intestinal e intestino con un contenido de un exudado cremoso.    Ruíz (1990 ) y Malcolm y McDougald (1991) reportaron hallazgos compatibles con los de este estudio. Es de hacer notar, que estas lesiones fueron más severas a las observadas en el tratamiento anterior, lo cual pudo deberse a la mayor carga de oocystos, ya que el nivel de AFB₁ fue el mismo. Estos resultados no concuerdan  con los señalados por Witlock y Wyatt (1981), quienes reportaron que las lesiones macroscópicas por coccidia se mantenían iguales con o sin la presencia de AFB₁. Por el  contrario,  Wyatt et al. (1975), reportaron que la severidad de las lesiones macroscópicas disminuían de +4  a +3 cuando se les administraba AFB₁ conjuntamente con la coccidia. Cabe señalar que estos autores utilizaron concentraciones de 2500 mg/kg de AFB₁ y de 10.000 y 100.000 oocystos tanto de E. acervulina como E. tenella.  

A nivel microscópico, se observó la presencia masiva y severa de los gametos y oocystos de coccidias en la lámina epitelial, infiltrado mononuclear y edema moderado en el corion, con erosión epitelial moderada y atrofia severa de la vellosidad (Figura 4). Estas lesiones han sido reportadas por Ruíz (1990) y Malcolm y McDougald (1991). Sin embargo, cabe destacar que estas lesiones fueron más severas que las observadas cuando se administraba E. acervulina  en forma individual. No está claro el mecanismo por   el  cual  se  produce  esta  acción,   pero  se   conoce  que   bajos   niveles  de AFB₁ producen efectos sobre órganos del sistema inmune como bursa, bazo y timo; deprimiendo la respuesta inmune celular y la humoral; disminuyendo así la resistencia contra ciertas enfermedades como  la Coccidiosis, Marek, Gumboro entre otras (Wyatt y Hamilton, 1975; Chang y Hamilton, 1982; Hamilton, 1992; Reddy, 1992). 

 

 

Figura 4. Microfotografía de mucosa duodenal de pollo de engorde (37 días de edad) con tratamiento de 20 mg/kg de AFB₁ y 500.000 oocystos de E. acervulina. Se observa la infección masiva de gametos de coccidias en la vellosidad (A), con ruptura de la misma y salida de los gametos. Coloración de H y E. 200 X.

 Los reportes de efectos de las aflatoxinas sobre el intestino no son frecuentes. Sin embargo, en el tratamiento de 200 mg/kg, macroscopicamente se observó presencia de un puntillado hemorrágico, congestión y edema leve. A nivel microscópico se observó la vellosidad con marcada erosión epitelial, edema del corion y hemorragia (Figura 5); resultados  similares a los reportados por Carabaño et al. (1997); Carabaño, (1999); Escalona et al. ( 2001); Machado, (2002); quienes utilizaron concentraciones de AFB1 entre 100 y 350 mg/kg. Contrario a lo descrito en este ensayo, Mahalingam et al. (1989), no observaron lesiones a nivel de duodeno con el uso de 3000 mg/kg de AFB₁. 

 

Figura 5. Microfotografía de mucosa duodenal (zona apical) de pollo de engorde (37 días de edad) con tratamiento de 200 mg/kg de AFB₁ y 0 oocystos de Eimeria acervulina. Se muestran vellosidades con  marcada enteritis, erosión epitelial (A) e infiltrado inflamatorio mononuclear (B). Coloración H y E. 125 X.

 Mientras que para los tratamientos de 200 mg/kg de AFB₁ y 250.000 oocystos y 500.000 oocystos de E. acervulina los hallazgos macroscópicos fueron leve puntillado hemorrágico y congestión, a nivel microscópico se muestran  las vellosidades en la zona apical con  erosión epitelial, congestión y hemorragia de los vasos y severo infiltrado inflamatorio mononuclear, revelando una marcada enteritis (Figura 6). En la zona basal se observó un infiltrado inflamatorio interglandular y la dilatación de los fondos glandulares. La presencia de enteritis ha sido descrita por Hoerr (1991) y Leal y De Rosa (1993). En cuanto al estudio microscópico Carabaño et al. (1997); Carabaño (1999); Escalona et al. (2001) y Machado (2002); reportan lesiones que se corresponden con las de este ensayo, con el uso de las mismas concentraciones de AFB₁. 

   

 Figura 6. Microfotografía de mucosa duodenal (zona apical) de pollo de engorde (37 días de edad) con tratamiento de 200 mg/kg de AFB₁ y 250.000 oocystos de E. acervulina. Se muestran vellosidades con marcada enteritis, erosión epitelial (A), hemorragia de vasos (B) y un infiltrado inflamatorio mononuclear (C). Coloración H y E. 125 X.

Ruíz (1990) y McDougald (1998), reportan la afinidad que tiene E. acervulina por el duodeno y  que su penetración en el  epitelio  es  superficial. Por  lo  cual,  se puede asumir que el efecto de erosión del epitelio de las vellosidades intestinales, posiblemente causado por la AFB₁, pareciera no permitir que la células invasoras de E. acervulina se instauren, debido a la ausencia del sitio de colonización y multiplicación, produciéndose de esta manera una disminución de la carga parasitaria, situación contraria a lo que ocurre cuando el nivel de la AFB₁ es de 20 mg/kg. 

 Frotis por aposición 

Los resultados reportados se basan en el estudio de 36 muestras de duodeno, obteniéndose 12 muestras negativas y 24 muestras positivas; considerándose como positivas aquellas donde se observaban formas parasitarias como esquizontes, merozoítos, oocystos, y como negativas aquellas donde no se observaba ninguna forma parasitaria. Los resultados se presentan en la Tabla 1.

                     Tabla 1. Resultados sobre la presencia de oocystos mediante frotis por aposición

Tratamientos	Aflatoxina B1 (mg/kg)	Coccidia (Nº oocystos)	Nº Aves	Resultados
1	No detectables	0	4	-
2	No detectables	250.000	4	+
3	No detectables	500.000	4	++
4	20	0	4	-
5	20	250.000	4	+
6	20	500.000	4	++
7	200	0	4	-
8	200	250.000	4	+/-
9	200	500.000	4	+

 (-): no se evidenció la presencia de oocystos de E. acervulina

(+/-): leve presencia de oocystos de E. acervulina

(+): moderada presencia de oocystos de E. acervulina

(++): severa presencia de oocystos de E. acervulina

 La presencia de mayor cantidad de oocystos se notó en los tratamientos 3 y 6, siendo éstos los que tenían el mayor  inóculo. Llama la atención que los tratamientos 8 y 9 tuvieron menor cantidad de oocystos en comparación con los otros tratamiento, a excepción de los que no tenían ningún inóculo de E. acervulina.

El frotis por aposición es reportado por Ruíz (1990) y Malcolm y McDougald (1991), como una técnica diagnóstica importante. Los resultados obtenidos se corresponden con la dosis de inóculo utilizada para cada uno de los tratamientos. Para las dosis de 500.000 oocystos se observó mayor presencia de formas parasitarias, a excepción del tratamiento 9, lo cual se pudiera atribuir a la posible erosión que produce la AFB₁ sobre el epitelio de la vellosidad, que es el sitio donde se instauran las coccidias, éstos, al no encontrar su sitio  de fijación, no se instauran y por ende hay menor presencia de formas parasitarias.

Para las dosis de 250.000 se observó el mismo comportamiento que en la dosis de 500.000 oocystos, pero con menor cantidad de formas parasitarias.

 Efectos sobre la respuesta productiva  

La ganancia de peso por pollo (g/peso vivo) en los diferentes tratamientos durante las 5 semanas del ensayo se presentan en la Tabla 2. Para el tratamiento de AFB₁ no hubo diferencias significativas entre los tratamientos durante las 4 primeras semanas. Para la semana 5, hubo diferencias significativas entre los tratamientos de AFB₁ en comparación con el tratamiento control, pero no hubo diferencias significativas entre los dos tratamientos de AFB₁. 

                      Tabla 2. Ganancia de peso semanal e incremento total de peso (g)

Medias en la misma columna con diferente letra difieren significativamente (P<0,05).

 Para el caso de E. acervulina, se puede señalar que en una semana de infección hay efectos estadisticamente significativos sobre el incremento de peso de ambos tratamientos inoculados, en comparación con el tratamiento control; sin embargo, entre ambos tratamientos inoculados no hubo diferencias estadísticamente significativas, lo cual evidencia el efecto negativo sobre el incremento de peso de las aves producto de la infección con  E. acervulina.

Para las variables consumo de alimento y conversión alimenticia no se evidenció diferencia significativa entre los tratamientos suministrados y el tratamiento control.

Estadísticamente no se evidencia interacción entre la AFB₁ y E. acervulina sobre la respuesta productiva en el período estudiado (Tabla 3), lo cual permite asumir que los efectos de estos factores son independientes el uno del otro. 

                      Tabla 3. Peso promedio (g) por tratamiento durante la quinta semana y su acumulado                       bajo los tratamientos de la interacción Aflatoxina B₁ y E. acervulina

 

                                   (P<0,05)                     ns= no significativo

 

 En los ensayos realizados por Smith y Hamilton (1970); Reddy et al. (1982); Huff  et al. (1986); Mahalingam et al. (1989); Enríquez y Ramírez (1994); Jindal et al. (1994); Jordan y Pattison (1996), las disminuciones en el peso corporal e incremento de peso se observaron a niveles iguales o mayores a 2.500 mg/kg   de AFB1 suministradas en un período de tiempo que oscilaba entre 3 y 4 semanas. Estos resultados se corresponden con los encontrados en este ensayo, aún cuando estas disminuciones no son tan marcadas. En cuanto a los resultados reportados por  Carabaño et al. (1997); Carabaño, 1999 y Carabaño et al. (2001), en los cuales utilizaron 200 mg/kg, se observó un comportamiento similar, aún cuando ellos reportan tener diferencias significativas entre las  concentraciones utilizadas (100, 200, 300 y 350 mg/kg) lo cual no ocurrió durante este ensayo, a pesar de que las dosis fueron bastante diferentes. Esto posiblemente se atribuye a que los efectos de las aflatoxinas no dependen de un solo factor, sino de la interrelación de varios de ellos, entre los cuales se mencionan: dosis ingerida, tiempo de exposición, edad, especies y el estado nutricional (Hoerr, 1991).

Para concluir, se puede evidenciar que niveles de 20 mg/kg de AFB1 pareciesen hacer al duodeno más susceptible a la infección con E. acervulina, debido a la mayor presencia de formas parasitarias, mientras que el posible efecto erosivo sobre el epitelio duodenal del nivel de 200 mg/kg de AFB1 parece disminuir la patogenicidad de E. acervulina. Tanto la AFB₁ como la E. acervulina afectan negativamente la ganancia de peso de las aves en forma individual, pero no existe interacción entre ellos.

 Agradecimientos

 A la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Central de Venezuela y todo el personal que colaboró en la elaboración de esta investigación. A Fravi C.A., Laboratorios Reveex de Venezuela, Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA) y FUNDACITE Aragua.

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