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Revista de la Facultad de Ciencias Veterinarias

versión impresa ISSN 0258-6576

Rev. Fac. Cienc. Vet. vol.56 no.2 Maracay jul. 2015

 

Evaluación de la eficacia de la CEPA MAF1309® de Metarhizium anisopliae en el control biológico de garrapatas adultas de Rhipicephalus microplus en Tunja, Colombia

Martín O. Pulido-Medellín*,1, Roger I. Rodríguez-Vivas**, Diego J. García-Corredor*, Adriana M. Díaz-Anaya*  y Roy J. Andrade-Becerra*

*Programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. Correo-E: mopm1@hotmail.com

**Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Autónoma de Yucatán, México.

RESUMEN

La garrapata del ganado Rhipicephalus microplus constituye el ectoparásito de mayor importancia en las ganaderías de regiones tropicales y subtropicales, al producir pérdidas directas por reducción de la producción de carne, leche y deterioro de las pieles así como a la transmisión de agentes patógenos para el ganado bovino tales como Babesia bovis, Babesia bigemina y Anaplasma marginale. El tratamiento químico ha sido efectivo para el control de las garrapatas; sin embargo,  su uso excesivo ha propiciado la selección de individuos resistentes y por tal motivo, se hace necesario el desarrollo de nuevas alternativas de control, tales como el uso de hongos entomopatógenos. El objetivo del presente estudio fue evaluar la eficacia in vitro de M. anisopliae para el control de la fase adulta de R. microplus, en Tunja, Colombia. Se usó la prueba de inmersión de adultas para evaluar la eficacia de la cepa MaF1309® de M. anisopliae a las siguientes concentraciones: 1x104, 1x106 y 1x108 conidias/mL. Se observó que en las garrapatas tratadas a una concentración de 1x108 conidias/mL se alcanzó el 100% de mortalidad a los 14 d postratamiento (PT), mientras que las concentraciones 1x106 y 1x104 conidias/mL alcanzaron el 100% de mortalidad a los días 16 y 20 PT, respectivamente. La mortalidad fue directamente proporcional a la concentración empleada del hongo, siendo las garrapatas tratadas con concentraciones mayores aquellas que alcanzaron una mortalidad en menor tiempo. Estos resultados in vitro son considerados el inicio de información de tipo local proyectados al diseño de programas de control para el departamento de Boyacá.  

(Palabras clave: Control biológico; hongos entomopatógenos; Rhipicephalus microplus; Metarhizium anisopliae)

Evaluation of efficacy of MaF1309® strain of Metarhizium anisopliae in biological control of adult ticks Rhipicephalus microplus in Tunja, Colombia

ABSTRACT

The livestock tick Rhipicephalus microplus is a high importance ectoparasite in cattle raised at tropical and sub-tropical regions producing direct losses since reduce meat and milk production and cause leather injury besides transmission of pathogenic agents such as Babesia bovis, Babesia bigemina y Anaplasma marginale. The chemical treatment has been effective to control tick  however the excessive use has selected resistant individuals; for that reason is important to develop new alternatives such as entomopathogen fungi to keep controlled those individuals. The objective of this research was to evaluate in vitro efficacy of M. anisopliae to control adult stage of R. microplus in Tunja, Colombia. The immersion test was used to evaluate efficacy of MaF1309® strain of M. anisopliae at concentrations of 1x104, 1x106 y 1x108 conidia/mL. The group of ticks treated with 1x108 conidia had 100% of mortality 14 post-treatment days (PT), otherwise 1x106 y 1x104 conidia/mL concentrations have 100% of mortality at 16 and 20 PT days, respectively. Mortality was directly proportional to fungus concentration used, the ticks treated with high concentrations reach high mortality in less time. Those in vitro results start in local information projected to design control programs for the department of Boyacá.

(Key words: Biological control; entomogenous fungi; Rhipicephalus microplus; Metarhizium anisopliae)  

Recibido: 09/02/15 - Aprobado: 04/11/15

INTRODUCCIÓN

En zonas tropicales y subtropicales del mundo las garrapatas transmiten microorganismos patógenos (protozoos, rickettsias, espiroquetas y virus) a  humanos y animales [1]. La garrapata común del ganado Rhipicephalus microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) [2], es sin duda el artrópodo que parasita con mayor frecuencia al ganado bovino en Australia, parte de África, así como centro y Sudamérica incluyendo a Colombia [3-6]. Este ectoparásito afecta aproximadamente el 80% de la población bovina de las regiones señaladas, encontrándose en un amplio rango de altitud y temperatura que va desde el nivel del mar hasta los 2700 m.s.n.m. y a temperaturas que oscilan entre 15°C y 34°C [3].

Debido a su hábito hematófago, R. microplus produce daños directos al ganado al consumir sangre, reducir la ganancia de peso, producir daños a la piel por acción de las picaduras, debilitamiento, estrés, así como la disminución de la producción de leche y menor eficiencia reproductiva del hato [7, 8]. Asimismo, puede transmitir agentes patógenos como Babesia bovis, Babesia bigemina y Anaplasma marginale [9]; considerados de alto impacto, al originar altos índices de morbilidad y mortalidad en los animales afectados [4, 5].

En Colombia se calcula que las pérdidas asociadas con las garrapatas y moscas para la ganadería ascienden a 76.713 millones de pesos anuales [3].  El control de las garrapatas en la ganadería bovina se basa principalmente en el uso de productos químicos comerciales tales como los organofosforados, amidinas, piretroides sintéticos y lactonas macrocíclicas.

El control biológico mediante el uso de hongos entomopatógenos ha demostrado ser una alternativa promisoria y económicamente prometedora para el control de garrapatas en los bovinos [8,10,11].  El hongo Metarhizium anisopliae es uno de los organismos que mayor potencial tiene para el control de diferentes estadios de R. microplus. Este hongo invade activamente la garrapata a través de su cutícula y produce su daño patológico al presionarla mecánicamente (apresorios) y degradarla por la acción de enzimas hidrolíticas tales como proteasas, quitinasas y lipasas [12, 13]. En Colombia, López et al. [14], evaluaron la capacidad biocontroladora de ocho cepas de M. anisopliae sobre R. microplus en condiciones de laboratorio y campo. En condiciones de laboratorio, se encontró que la cepa 137bm causó el efecto más significativo al disminuir la oviposición de las garrapatas  hasta en un 96% y viabilidad de los huevos en más del 98%. En ensayos de campo se logró reducir la infestación de garrapatas en un 75% en vacas y un 86% en praderas. Se observó que la eficacia del hongo es variable dependiendo de la cepa estudiada, la concentración y la fase de desarrollo de la garrapata. Por tal motivo es necesario evaluar cepas de distintos orígenes para seleccionar las de mejor potencial biológico para el control de R. microplus; por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar la eficacia, en condiciones in vitro, de la cepa MaF1309 del hongo M. anisopliae para el control de la fase adulta de R. microplus.   

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio

El presente estudio se realizó en el laboratorio de Parasitología de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, en la ciudad de Tunja, Boyacá, Colombia, ubicada en las coordenadas 5° 32’ 7’’ N, 73° 22’ 04’’ O.  La temperatura promedio anual es de 13°C con una altitud de 2690 m.s.n.m. y una precipitación de 645 mm al año [15].

Cepa de M. anisopliae y condiciones de cultivo

Para el estudio se usó la cepa comercial MaF1309® del hongo M. anisopliae.  El hongo se obtuvo de un producto comercial puro, que fue cultivado en medio agar dextrosa Sabouraud [16], enriquecido con 1% de extracto de levadura y mezclado con 500 ppm de cloranfenicol. El cultivo se incubó por tres semanas a 25±1°C con una humedad relativa del 70% [17]. Las conidias se obtuvieron mediante el raspado de la superficie del medio de cultivo y suspendidas en agua destilada estéril con 0,1% v/v [18]. Mediante el uso de hematocitómetro de Neubauer se determinó la concentración de conidias por mL, y posteriormente se cuantificaron ajustando las concentraciones empleadas para este estudio: 1x104, 1x106 y 1x108 conidias/mL.    

Recolección de hembras adultas de R. microplus

En el municipio de Moniquirá, Boyacá, Colombia, se colectaron garrapatas adultas repletas de R. microplus de al menos 30 bovinos. Las garrapatas fueron transferidas a cápsulas de Petri para ser transportadas en condiciones de ambiente al laboratorio de parasitología de la escuela de Medicina Veterinaria y Zootecnia en la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia (FMVZ-UPTC). Las garrapatas fueron pesadas en una balanza analítica y luego lavadas con agua destilada y cloro a una concentración de 0,3%. El promedio de garrapatas por tratamiento fue de 218±1,4 mg. Para evaluar la eficacia del hongo M. anisopliae se utilizó la prueba de inmersión de adultas, de acuerdo con la metodología descrita por Drummond [19].

Bioensayo

Doscientas cuarenta garrapatas adultas de R. microplus fueron empleadas para el ensayo. Se realizó un diseño experimental completamente al azar con 20 garrapatas por tratamiento y tres repeticiones, siendo cada garrapata inoculada como una unidad experimental y evaluándose los siguientes  tratamientos:  Tratamiento 1: Tratado con la cepa  M. anisopliae a una concentración de  1x104 conidias/mL. Tratamiento 2: Tratado con la cepa M. anisopliae a una concentración de 1x106 conidias/mL. Tratamiento 3: Tratado con la cepa M. anisopliae a una concentración de 1x108 conidias/mL. Tratamiento 4: Grupo control, que consistió en usar agua destilada como placebo.

Las garrapatas de cada grupo fueron sumergidas durante un minuto en 1,5 mL en sus correspondientes tratamientos y depositadas posteriormente en microplacas de 24 pozos para ser incubadas a una temperatura de 28° C y 90% de humedad durante 20 d. Las garrapatas fueron examinadas individualmente al microscopio para la detección de crecimiento fungal. Cada 48 h postratamiento, se registró la mortalidad de las garrapatas a través de observaciones al estereoscopio durante 20 d. Las garrapatas fueron consideradas muertas, cuando no mostraron movimiento alguno al ser estimuladas y presentaban micelios emergiendo a través de la cutícula.

Para estimar el porcentaje de mortalidad se usó la siguiente fórmula descrita por Soberanes et al. [20]:

Asimismo, se obtuvo el porcentaje de eficacia de M. anisopliae mediante la fórmula descrita por Bittencourt et al. [21]:  

Para determinar el índice de eficiencia reproductiva, las garrapatas de cada grupo se pesaron al inicio del experimento. A los 15 d postratamiento, se recolectó la masa de huevos y de manera individual se pesaron. Para calcular el índice de oviposición y el porcentaje de inhibición de la oviposición se emplearon las siguientes fórmulas [22]:  

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza (One-way ANOVA), para comparar el porcentaje de mortalidad y el índice de eficiencia reproductiva con la aplicación de los tratamientos de la cepa MaF1309® (1x104, 1x106 y 1x108 conidias/mL) y un grupo control. En aquellos casos que se presentó diferencia se aplicó la prueba de Tukey, usando el software IBM SPSS para Windows versión 19.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los hongos entomopatógenos constituyen una alternativa biológica para el control de insectos, siendo M. anisopliae el más utilizado como biopesticida para el control de garrapatas [23]. En el presente estudio se logró evidenciar la eficacia de la cepa MaF1309® de M. anisopliae sobre la fase adulta de R. microplus en la población estudiada. Se observó que a mayor concentración del hongo se alcanza mayor mortalidad de garrapatas en menor tiempo. Esto coincide con los resultados obtenidos por  Arguedas et al. [24] y Fernández et al. [25], quienes encontraron que la mortalidad fue directamente proporcional a la concentración empleada del hongo.

En el Cuadro 1, se presenta el porcentaje de mortalidad de garrapatas adultas de R. microplus expuestas a distintas concentraciones de M. anisopliae. Se observa que las garrapatas tratadas con la cepa MaF1309® a una concentración de 1x108 conidias/mL alcanzaron el 100% de mortalidad a los 14 d PT, mientras que la concentración de 1x106 conidias/mL a los 16 d y la concentración de 1x104 conidias/mL a los 20 d.  

Las garrapatas presentaron el 50% de fungosis a los 10, 18 y 22 d con los tratamientos 1x108 conidias/mL, 1x106 conidias/mL y 1x104 conidias/mL, respectivamente. La concentración 1x108 conidias/mL mostró mayor micosis (100% al día 18 PT) que los tratamientos con 1x106 y 1x104 conidias/mL (p<0,001). Con respecto a la eficiencia reproductiva de garrapatas adultas de R. microplus, se encontró que las concentraciones 1x104, 1x106 y 1x108  tuvieron una reducción de 90%, 91% y 68%, respectivamente, donde a mayor concentración del hongo menor eficiencia reproductiva de las garrapatas (p<0,045) (Figura 1). El mismo comportamiento se presentó cuando se evaluó el porcentaje de eclosión de larvas con valores de 76%, 56% y 32%, a las concentraciones del hongo de 1x104 conidias/mL, 1x106 conidias/mL y 1x108 conidias/mL, respectivamente.  

En el presente estudio se logró una mortalidad de 100% de garrapatas adultas a los 14 d PT. En estudios previos se demostró que el hongo M. anisopliae es altamente efectivo para el control de B. microplus. Frazzon et al. [26], utilizaron 12 cepas de M. anisopliae (E6S1, E6S2, E9, RJc, RJd, AL, MT, CG144, M5, CG343, CG423 y CG491), de las cuales las cepas E6S1, E6S2, E9 y CG491 presentaron 50% de mortalidad a los 5 d postinfección y fue hasta la segunda semana luego de haber sido expuestas las garrapatas a una segunda inmersión cuando presentaron mortalidad del 100% con las cepas E6S1, E6S2, E9, RJc, RJd, AL, MT, CG144, y CG491, a la dilución de 1x107; sin embargo, las cepas M5 y CG423 tuvieron baja eficacia. Kirkland et al. [27], en un experimento con garrapatas adultas de Amblyomma maculatum y Amblyomma americanum utilizando la cepa ATCC20500, observaron 60% y 15% de mortalidad a la dilución de 1x108 conidias/mL a 28 d post-infección, mientras que Fernández et al. [25] utilizando dos grupos de garrapatas (resistentes y susceptibles), encontraron que la cepa ESC1 de M. anisopliae a la dilución de 1x108 conidias/mL fue altamente efectiva para ambos grupos a los 20 d post-infección obteniendo 100% de mortalidad. Asimismo, Gindin et al. [28], utilizaron la cepa Ma7 de M. anisopliae, obteniendo de 80% a 100% de mortalidad a los 7 d post-infección, en garrapatas adultas de R. annulatus. Estos estudios coinciden con el presente, respecto a la eficacia del hongo entomopatógeno M. anisopliae, pero varía dependiendo de la cepa y la concentración utilizada. Según Frazzon et al. [26] y Kirkland et al. [27], esta diferencia en la eficacia depende principalmente de la capacidad de la cepa del hongo para penetrar la cutícula de la garrapata, usando una combinación de mecanismos enzimáticos (proteasas, quitinasas) y físicos (mecanismos de presión). 

En el presente estudio se puede resaltar, que todas las concentraciones evaluadas obtuvieron casi 100% de mortalidad a los 20 d PT; no obstante, la concentración 1x108 conidias/mL mostró los mejores resultados en el control de hembras adultas de R. microplus, hallazgo que coincide con Ojeda-Chi et al. [29] quienes usaron la cepa Ma14 a concentración de 1x108 conidias/mL y encontraron un 100% de mortalidad al día 14 PT. Asimismo, esta concentración del hongo mostró mayores signos de micosis (100% al día 18 PT), en comparación con las menores concentraciones (p<0,001), situación situación similar a la de otros estudios al evaluar esta misma concentración con las cepas Ma14 [29] y E6S1 [13].

De igual forma, se evaluó el índice de eficiencia reproductiva en garrapatas adultas de R. microplus tratadas con la cepa MaF1309 de M. anisopliae, y se encontró que las tres concentraciones tuvieron una reducción entre 68 a 91%, siendo mayor el efecto cuando la concentración del hongo fue mayor (p<0,045). Perinotto et al. [30] observaron efectos negativos de este hongo en los parámetros reproductivos de R. microplus resultando en una reducción del peso en los huevos y el porcentaje de eclosión de larvas. Bittencourt et al. [31] encontraron que dos cepas (E9 y 319) de M. anisopliae redujeron la eficiencia reproductiva de garrapata B. microplus. Gindin et al. [28] trabajando con B. annulatus encontraron que una cepa de M. anisopliae reduce la oviposición de 7 a 8% y Hornbostel et al. [32] obtuvieron una reducción en la oviposición de 33% a 50%, cuando se utilizó una cepa de M. anisopliae para el control de Ixodes scapularis. Perinotto et al. [33] observaron que en los huevos tratados con M. anisopliae disminuyó entre el 50,5 y 57,3% la eclosión, con un aislamiento de la cepa Ma959 y una concentración de 1x108 conidias/mL. Estos hallazgos demuestran que la cepa estudiada a una concentración de 1x108 conidias/mL-1 reduce la capacidad reproductiva de las garrapatas, tal como lo demostraron Webster et al. [34] luego de aplicar una formulación del hongo a una concentración de 1x108 conidias mL en animales con R. microplus, el resultado fue evidenciado en una reducción significativa en la producción y eclosión de los huevos. En la Figura 2, se evidencia que al evaluar el porcentaje de eclosión de larvas, se encontró que la concentración de 1x108 conidias/mL produce la menor eclosión de larvas (32%).  

Los resultados de este estudio demostraron que la cepa MaF1309® de M. anisopliae es eficaz para el control de R. microplus en condiciones in vitro, siendo la concentración de 1x108 conidias/mL la que presentó mejores resultados. Este hongo representa una buena alternativa para el control de R. microplus, ya que se ha demostrado que no produce efectos adversos al medio ambiente y reduce los impactos ecológicos, ambientales y sanitarios que se producen al aplicar productos químicos de manera indiscriminada para el control de garrapatas [8, 35]. Estos resultados deberán ser validados en condiciones in vivo, ya que donde existen otros factores por evaluar tales como el hospedero y el ambiente.

CONCLUSIONES

La cepa MaF1309® de M. anisopliae es eficaz para el control de R. microplus en condiciones in vitro para este estudio, siendo la concentración de 1x108 conidias/mL la que produce mayor mortalidad de adultas, mayor fungosis y reduce en mayor proporción la ovoposición y la eclosión de larvas de R. microplus.

DECLARACION DE CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran expresamente que no hubo conflicto de intereses durante el desarrollo de este trabajo. 

APORTE DE LOS AUTORES AL TRABAJO

MOPM: diseño del trabajo; muestreo de campo, pruebas de laboratorio, escritura del artículo. RIRV: Asesoría  pruebas de laboratorio, redacción del artículo. DJGC y AMDA: muestreo de campo, pruebas de laboratorio, escritura del artículo. RJAB: pruebas de laboratorio; escritura del artículo.

NOTA:

1 A quien debe dirigirse la correspondencia (To whom correspondence should be addressed)

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