CRECIMIENTO, PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS Y EXOPOLISACÁRIDOS DE LA CIANOBACTERIA  Anabaena sp. PCC 7120 EN FUNCIÓN DEL pH Y CO2

Ever Morales, Marisa Rodríguez, Digna García, César Loreto y Eduardo Marco

Ever Morales. Magíster Scientiarum en Biología, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. Doctor en Ciencias Biológicas, Universidad de Santiago de Compostela (USC), España. Profesor Titular, Dpto. de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad del Zulia. Dirección: Departamento de Biología, Edificio A-1, Facultad de Ciencias, LUZ. Grano de Oro, Av. Universidad, Maracaibo, Apdo. 526, Venezuela. e-mail: posgradociencias@LatinMail.com

Marisa Rodríguez. Doctora en Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Madrid, España. Estudiante postdoctoral, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid, España.

Digna García. Doctora en Ciencias Biológicas, USC, España. Estudiante postdoctoral, Departamento de Microbiología, Facultad de Farmacia, USC, España.

Eduardo Marco. Doctor en Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Madrid, España. Profesor Titular, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid, España.

César Loreto. Bachiller en Ciencias. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad del Zulia, Venezuela.

Resumen

El crecimiento, producción de clorofila a, ficocianina, carotenoides y exopolisacáridos (EPS) de la cianobacteria filamentosa Anabaena sp. PCC 7120 fueron analizados en función del pH (5,5-10,5) con o sin soluciones amortiguadoras en cultivos discontinuos y en función del CO2 (0,03 y 5,0%) en cultivos semicontinuos a una tasa de renovación del 10%. El crecimiento de la cianobacteria se analizó por turbidez a 750nm y recuento celular, y la actividad fotosintética mediante uso de un electrodo de O2. Los cultivos, por triplicado, se mantuvieron con aireación constante, a 28±2ºC y con iluminación continua o fotoperíodo, según el experimento. El pH y tampón utilizado influyeron en el crecimiento. El mayor crecimiento y contenido de EPS se alcanzaron, respectivamente, a pH 8,0-9,0 y 10,0. Sin embargo, los cultivos no tamponados resultaron con mayor contenido de clorofila a y ficocianina. El crecimiento, la actividad fotosintética y los carotenoides no variaron con la adición de CO2. Los cultivos semicontinuos con bajo CO2 produjeron los valores mas elevados de clorofila a, ficocianina y exopolisacáridos, con 25,9±1,69, 2010±22,61 y 2286,0±42,76 µg·ml-1, respectivamente. El contenido de ficocianina y de EPS fue de 2,7 y 4 veces superior al obtenido a altos niveles de CO2. El pH y el sistema semicontinuo constituyen herramientas importantes para modular el crecimiento y contenido de pigmentos y de EPS de Anabaena sp. PCC 7120.

Summary

Growth, production of chlorophyll a, phycocyanin, carotenoids and exopolysaccharides (EPS) of the filamentous cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 were analyzed as a function of pH (5.5-10.5) with or without buffers in batch cultures and as a function of CO2 (0.03 and 5%) in semicontinuous cultures with a renewal rate of 10%. The growth of the cyanobacterium was analyzed by turbidity at 750nm and cell count, and the photosynthetic activity by means of an O2 electrode. All cultures were maintained, in triplicate, with constant aeration at 28±2°C and continuous light or photoperiod, according to the experiment. Growth was influenced by the pH and buffer used. The highest growth rate and EPS content were reached at pH 8.0-9.0 and 10.0, respectively. However, non buffered cultures had higher contents of chlorophyll a and phycocyanin. Growth, photosynthetic activity and carotenoids did not vary with the addition of CO2. Semicontinous cultures with low CO2 yielded the highest values of chlorophyll a, phycocyanin and exopolysaccharides, with 25.9±1.69, 2010±22.61 and 2286.0±42.76 µg·ml-1, respectively. Phycocyanin and EPS content was 2.7 and 4 times higher than those obtained at high CO2 levels. The pH and semicontinuous system constitute important tools to modulate the growth and pigment and EPS contents of Anabaena sp. PCC 7120.

Resumo

O crescimento, produção de clorofila a, ficocianina, carotenóides e exopolisacáridos (EPS) da cianobacteria filamentosa Anabaena sp. PCC 7120 foram em função do pH (5,5-10,5) com ou sem soluções amortecedoras em cultivos descontínuos e em função do CO2 (0,03 e 5,0%) em cultivos semicontínuos a uma taxa de renovação do 10%. O crescimento da cianobactéria se analisou por turbidez a 750nm e contagem celular, e a atividade fotossintética mediante uso de um eletrodo de O2. Os cultivos, por triplicado, se mantiveram com ventilação constante, a 28±2ºC e com iluminação contínua ou fotoperíodo, segundo o experimento. O pH e tapa utilizada influíram no crescimento. O maior crescimento e conteúdo de EPS se alcançaram, respectivamente, a pH 8,0-9,0 e 10,0. Porém, os cultivos não tapados resultaram com maior conteúdo de clorofila a e ficocianina. O crescimento, a atividade fotossintética e os carotenóides não variaram com a adição de CO2. Os cultivos semicontínuos com baixo CO2 produziram os valores mais elevados de clorofila a, ficocianina e exopolisacáridos, com 25,9±1,69, 2010±22,61 e 2286,0±42,76 µg·ml-1, respectivamente. O conteúdo de ficocianina e de EPS foi de 2,7 e 4 vezes superior ao obtido a altos níveis de CO2. O pH e o sistema semicontínuo constituem ferramentas importantes para modular o crescimento e conteúdo de pigmentos e EPS de Anabaena sp. PCC 7120.

PALABRAS CLAVES / Anabaena / Carotenoides / Cianobacteria / Clorofila / Exopolisacárido / Ficocianina / pH /

Recibido: 07/01/2002. Modificado: 30/05/2002. Aceptado: 07/06/2002

Introducción

Las cianobacterias constituyen un grupo de microorganismos fotosintéticos con características morfológicas y fisiológicas capaces de responder a cambios extremos de irradiación, limitación de nutrientes, salinidad y pH, (Whitton, 1992). Representan una fuente potencial de ficobiliproteinas, carotenoides y clorofila de interés económico (Romero y Echeverría, 1999; Apt y Behrens, 1999).

Bajo ciertas condiciones de cultivos pueden ser productoras de exopolisacáridos (EPS; Matsunaga et al., 1996). Por ejemplo, en Gloeotrichia natans, utilizada como biofertilizante, se ha descrito un incremento de EPS y de su crecimiento cuando es cultivada a 38ºC, pH 8 y sin la adición de carbono inorgánico (Querijero et al., 1990) al sistema de cultivo. Sin embargo, el suministro de CO2 en algunas cianobacterias produce un incremento de biomasa y en ambientes acuáticos depende de muchos parámetros que incluyen la lenta velocidad de difusión del CO2 en el agua, pH, turbulencia y densidades celulares (Tandeau y Houmard, 1993). Se han descrito cepas mutantes de cianobacterias con elevados requerimientos de CO2 para estudios fisiológicos del mecanismo de concentración de carbono inorgánico. Estas cepas han sido comparadas con estirpes silvestres capaces de crecer a un bajo nivel de CO2 de 0,03% presente en el aire (Reinhold et al., 1991).

El crecimiento y contenido de pigmentos en cianobacterias también puede ser influido por el pH. En una cepa marina de Synechocystis se reportó un aumento de la densidad celular a pH 7, 25°C y a una salinidad del 1% (Sakamoto et al., 1996).

La mayoría de los estudios realizados con la cianobacteria Anabaena PCC 7120 se han orientado hacia la biología molecular de ficobilisomas, purificación de RNA polimerasa y diferenciación de heterocistos (Schneider et al., 1987; Buikeman y Haselkorn, 1991). En cuanto a estudios fisiológicos se ha descrito el efecto nocivo de condiciones ácidas del medio sobre el crecimiento y el pH intracelular (Giraldez et al., 1997). Sin embargo, hay poca información sobre cultivos de Anabaena en función de diversos parámetros de cultivo. En este trabajo se reporta su posible potencial en la producción de cultivos de Anabaena sp. PCC 7120 para la producción de pigmentos y de exopolisacáridos en función del pH, CO2 en cultivos discontinuos y semicontinuos.

Materiales y Métodos

Microorganismo

La cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120 fue obtenida de la colección de cianobacterias del Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias de la Universidad Autónoma de Madrid, España. Esta cepa es mantenida en medio de cultivo BG-11 (Rippka, 1988) con buffer HEPES 20mM a un pH inicial de 7,8 y en medio ALGAL (Fábregas et al., 1984) sin solución amortiguadora.

Influencia del pH

La influencia del pH fue evaluada en cultivos discontinuos a bajos niveles de CO2. Se realizaron dos series de experimentos con la finalidad de analizar exhaustivamente el efecto del pH sobre el crecimiento.

En la primera serie, se utilizó el medio de cultivo BG-11 con una concentración de N03Na de 17mM (Rippka, 1988) y los siguientes amortiguadores: MES (2-[N-morpholino] ethane sulphonic acid) a pH 5,5 y 6,0; HEPES (N-2-hydroxyethyl piperazine-N´-2-ethane sulphonic) a pH 8,0; TRICINA (N-Tris [hydroxymethyl]-methyl glycine) a pH 9,0 y CAPS (Cyclohexylamino propanesulphonic acid) a pH 10,0 y 10,5).

En la segunda serie, la cianobacteria se hizo crecer en medio de cultivo ALGAL a una concentración equivalente de N03Na de 8mM (Fábregas et al., 1984) utilizando una solución amortiguadora de Tris-HCl (Tris [hydroxymethyl] amino methane-HCl) a pH 6,0; 7,0; 8,0 y 9,0. Los controles correspondieron a cultivos no ajustados y sin uso de amortiguadores y a cultivos a pH 8,0 y 9,0 ajustados solamente con HCl o NaOH 0,5N.

Todas las soluciones amortiguadoras en ambas series de experimentos se utilizaron a una concentración final de 25mM en el medio de cultivo. A fin de mantener la estabilidad del pH, se procedió a su ajuste dos veces diariamente. Para cada tratamiento se realizaron tres réplicas con un volumen de 250ml cada una. En la primera serie se utilizó iluminación continua de 110 µE m-2s-1, y en la segunda serie iluminación con un fotoperíodo 12:12h y a una intensidad luminosa de 156 µE m-2s-1.

En la primera serie el crecimiento se determinó diariamente mediante turbidez a 750nm en un espectrofotómetro Hitachi U-2000. En la segunda serie, cada tres días se colectó 0,5 ml de los cultivos, se centrifugó y la biomasa se homogenizó para fragmentar los filamentos. La densidad celular fue determinada mediante recuento en una cámara de Neubauer.

Efecto de bajos y altos niveles de CO2

El estudio del efecto del CO2 se realizó en cultivos semicontinuos. Los cultivos a bajos niveles sólo contenían el CO2 al 0,03% presente en el aire (Tindall et al., 1978; Aizawa y Miyachi, 1986), mientras que los cultivos crecidos en altos niveles se mantuvieron con un 5% de CO2. La estabilidad de la mezcla aire/CO2 se consiguió utilizando un rotámero. Ambos cultivos eran gaseados con aire a un flujo constante por una bomba de membrana. El aire, antes de entrar a los cultivos, se filtraba usando filtros con un tamaño de poro de 0,45 µm.

Todos los cultivos se realizaron por triplicado en matraces a un volumen de 250ml y fueron iniciados con un inóculo de la cianobacteria en fase exponencial, a una densidad óptica medida a 750nm (O.D750) de 0,08, correspondiente a una densidad celular de 4,9x106 cel.ml-1. Los matraces se mantuvieron en una cámara de cultivo a 28±2°C con iluminación continua procedente de una batería de tubos fluorescentes de luz blanca y a una intensidad luminosa de 110 µE m-2 s-1. El sistema semicontinuo se inició una vez que los cultivos alcanzaron el quinto día del experimento con una tasa de renovación diaria del 10% (v/v). Para ello, fueron retirados 25ml de cultivo y renovados con el mismo volumen de medio fresco durante 10 días.

En los cultivos semicontinuos, los pigmentos y EPS se analizaron durante la fase de estabilización; que se caracteriza por muy baja variación de los valores de turbidez y clorofila a en los cultivos.

Determinación de pigmentos

Para la extracción de clorofila a y carotenoides se centrifugó de 1ml de cultivo. El sedimento fue resuspendido en 1ml de metanol y mantenido en oscuridad durante 24h a 4ºC, para luego medir la clorofila a en el sobrenadante a 665nm y la concentración determinada según Marker (1972). El contenido de carotenoides fue analizado en la misma extracción a 480nm aplicando la ecuación de Britton (1985).

La extracción de ficocianina se realizó mediante el método del choque osmótico modificado de Wyman y Fay (1986), previa adición de glicerol. El sobrenadante obtenido después del proceso se analizó a 652, 615 y 562nm en un espectrofotómetro. La concentración de ficocianina fue determinada según la ecuación de Bennett y Bogorad (1973) y el contenido de todos los pigmentos expresado en µg ml-1.

Los EPS totales fueron analizados a partir del sobrenadante de cada cultivo y según el método de carbohidratos totales (µg ml-1), según una curva estándar usando glucosa (0-150 µg ml-1) y de acuerdo a Kochert (1978).

Determinación de la actividad fotosintética

La actividad fotosintética se evaluó en cultivos de 8 y 10 días de iniciados. A partir de cada réplica, se tomaron 2ml del cultivo y se colocaron en la cámara termostatizada del electrodo de oxígeno tipo Clark, acoplado a un registrador Linseis L6512. Cada medida correspondió a un registro del O2 liberado durante 3 min. La actividad fotosintética en µmol min-1 se estableció como el desprendimiento de O2 en condiciones de iluminación saturante de 300 µE m-2 s-1 y con luz blanca fría (Giraldez et al., 1997).

Análisis estadístico

Los valores de pigmentos, EPS y actividad fotosintética en fase estacionaria fueron comparados mediante análisis de varianza de una vía (StaMost for windows versión 3.0). Se empleó la prueba de rangos múltiples de Scheffé a un nivel de significancia del 95%

.

Figure 1. Influencia del pH en el crecimiento de la cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120.

Figure 2. Densidad celular y tasa de crecimiento (µ) en la cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120 en función del pH.

Resultados

Influencia del pH

Los resultados obtenidos en las dos series de cultivos indicaron que la cianobacteria es capaz de mantener un crecimiento sostenido entre un pH de 6,0 y 10,0 con un óptimo a pH 8,0 (Figure 1). A este pH se produjo la mayor densidad celular con 126,40±56,47 x106cel ml-1 y se obtuvo en los cultivos no tamponados y ajustados a pH 8,0, con diferencia significativa (p<0,05) respecto a los diferentes pH (Figure 2). Por ejemplo, estos cultivos incrementaron su densidad celular en 3,25 veces respecto a las obtenidas a pH 6,0 con 38,87±16,67x106 cel ml-1. Así mismo, se estableció un orden decreciente de crecimiento en función del pH de 8>9>7>6>10, seguido tanto por turbidez como mediante recuento celular.

Cuando la cianobacteria se hizo crecer a pH 5,5, se produjo lisis de los filamentos en el término de dos días y a pH 10,5 tampoco logró mantener un crecimiento sostenido a tres días de iniciado el cultivo. Los cultivos realizados con medio ALGAL también exhibieron un crecimiento significativo a partir de pH 6,0 con un incremento de la tasa de crecimiento con el pH. Es decir, en los cultivos con amortiguadores y con pH ajustados, la tasa de crecimiento se incrementó desde 0,099 div.d-1 a pH 6,0 hasta 0, 23 div.d-1 a pH 9,0. En el control no ajustado y sin amortiguador se alcanzó la tasa más elevada, de 0,28 div. d-1 (Figure 2).

El uso de diferentes soluciones amortiguadoras indicó diferencias en el crecimiento de la cianobacteria. El Tris-HCl produjo un efecto letal a pH 8,0; 9,0 y 10,0 (datos no mostrados). HEPES y TRICINA, utilizados a pH 8,0 y 9,0 no resultaron nocivos para la cianobacteria (Figure 1). Sin embargo, el descenso del crecimiento a un 60% en los cultivos a pH 10,0, parece atribuirse al CAPS. Los cultivos sin amortiguadores de pH y solamente ajustados con ácido o base tampoco ejercieron efecto nocivo sobre el crecimiento.

El contenido de ficocianina indicó dependencia del pH, con los valores más elevados entre 8,0 y 9,0 (Tabla I). En la segunda serie de experimentos (Tabla II) se encontró la mayor producción del pigmento en el control, con 153,25±22,65 µg ml-1, con diferencia significativa (p<0,05) respecto a los valores obtenidos con los otros tratamientos. El control mantuvo un pH entre 8,5 y 9,0. De igual manera, el incremento de la densidad celular de la cianobacteria con el pH estimuló la producción de ficocianina por unidad de volumen hasta pH 8.

En la primera serie de cultivos, crecidos con medio BG-11, se produjeron los mayores valores de clorofila a, con 24,6±0,14 y 22,19±0,02 µg ml-1 a pH 9,0 y 8,0, respectivamente, con diferencia significativa (p<0,05). Los carotenoides también se acumularon en fase estacionaria a pH entre 8,0 y 9,0, con diferencia significativa (p<0,05) respecto al obtenido a pH 10,0 (Tabla I). En cambio, en la segunda serie de cultivos crecidos con medio ALGAL, se obtuvo el máximo valor de clorofila a de 16,32±2,18 µg ml-1 en los cultivos control; los cuales alcanzaron un pH entre 9,0 y 9,5. Este valor es significativamente diferente (p<0,05) a los obtenidos a pH 7, 8 y 9. El contenido más alto de carotenoides se obtuvo a pH 7 con 4,74±0,78 µg,ml-1 con diferencia significativa (p<0,05) en relación a los obtenidos a pH 8 y 9. Los cultivos a diferentes pH con medio BG11 presentaron un mayor contenido de ficocianina y clorofila, respecto a los crecidos con medio ALGAL.

Los cultivos semicontinuos de Anabaena PCC 7120 con altos y bajos niveles de CO2 presentaron el mismo patrón de crecimiento. Es decir, no hubo diferencia significativa entre los dos tratamientos. A pesar de que los cultivos con bajos niveles de CO2, incrementaron el pH desde 7,8 hasta 10, mientras que los mantenidos a alto CO2 el pH varió entre 7,8 y 7,4 durante el experimento (Figura 3).

Figura 3. Crecimiento y variación del pH en cultivos semicontinuos de la cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120 con bajo y alto niveles de CO2.

En los cultivos con bajo CO2 se produjo el máximo valor de clorofila a, de 25,9±1,69 µg ml-1, con diferencia significativa (p<0,05) respecto a los cultivos con alto CO2. Así mismo, el mayor crecimiento observado en los cultivos con bajo CO2 también se comprobó cuando se evaluó el contenido de clorofila a en función de la edad del cultivo, con diferencia significativa (p<0,05; Figura 4.

Figura 4. Evolución del contenido de clorofila a en cultivos semicontinuos de la cianobacteria Anabaena PCC 7120, con bajo y alto niveles de CO2.

Sin embargo, no hubo diferencia significativa en cuanto a la actividad fotosintética (Tabla III). Esto significa que la adición CO2 no contribuyó con el incremento de la fotosíntesis. Los valores de carotenoides tampoco variaron con la adición de CO2.

Los cultivos no enriquecidos con CO2 también produjeron el máximo contenido de ficocianina y de EPS, con diferencia altamente significativa (p<0.05). Estos valores fueron 2,7 y 4 veces superiores respectivamente, al obtenido a altos niveles de CO2. El elevado contenido de EPS en los cultivos semicontinuos coincidió con el incremento gradual del pH hasta 10. Así mismo, en los cultivos discontinuos a pH 9 y 10 se encontraron los mayores contenidos de EPS, aunque el crecimiento de la cianobacteria a pH 10 fue bajo.

Discusión

Anabaena sp. PCC 7120 fue capaz de crecer en un rango de pH entre 6 y 10, con un óptimo a 8. Estos resultados demuestran la preferencia general de las cianobacterias por ambientes alcalinos (Moreno et al., 1995). Sin embargo, las microalgas son capaces de crecer a pH extremos, desde 9-11 como en Phaeodactylum tricornutum y Skeletonema costatum (Morales, 1997; Morten y Myklestad, 2000) hasta a pH 1,0, como en diversas cepas de Chlorella (Dorling et al., 1997).

En un aislado del mismo género Anabaena, también se encontró el mejor crecimiento entre pH 9 y 10, con una disminución del mismo a valores de pH£6 (Vincent y Sylvester, 1979). En este sentido, Giraldez et al. (1997) encontraron en cultivos de Anabaena sp. PCC 7120 a pH<6,5 una inhibición de la fotosíntesis del 60% con respecto a los mantenidos a pH 7,5; debido posiblemente a su incapacidad de mantener un pH intracelular constante en relación al externo; con lo cual se induce un desequilibrio en las actividades metabólicas relacionado con la división celular, la fotosíntesis neta y la esporulación en distintas especies de Anabaena (Reddy, 1984).

El tipo de amortiguador utilizado también influyó en los cultivos. Por ejemplo, se encontró una disminución del crecimiento y de la síntesis de pigmentos con el CAPS a pH 10,0. Asimismo, con Tris-HCl a pH 8,0 y 9,0 se produjo lisis celular. Aunque a pH 6,0 y 7,0 el efecto inhibitorio o tóxico no fue evidente. Los tampones Tris y Fosfato han sido descritos como tóxicos para algunas cianobacterias (Rippka, 1988). Por ejemplo, el efecto de catorce tipos de amortiguadores entre pH 5 y 8,3 en cultivos de Aphanotece halophytica en medio hipersalino demostró que el amortiguador Glicil-Glicina y MES contribuyeron a optimizar el crecimiento, mientras que el CAPS, ADA y el Tris-Hemisulfato causaron inhibición, lo cual corrobora que el tipo de amortiguador influye en el crecimiento de las cianobacterias (Tindall et al., 1978).

En nuestro caso, se determinó que el amortiguador puede estar involucrado directamente con el efecto tóxico exhibido a pH 8 y 9 si se compara con los controles no tamponados; en los cuales se observaron las mayores densidades celulares. Incluso en los controles no ajustados, es decir sin uso de amortiguadores, el pH se estabiliza a valores de pH entre 9 y 10 sin ningún efecto nocivo. Estos resultados indican que no es necesario el uso de amortiguadores para el crecimiento de esta cianobacteria.

La síntesis de ficocianina parece estar regulada por el pH en mayor medida que la de clorofila a y de carotenoides bajo las condiciones evaluadas en este estudio. El uso de cultivos sin amortiguadores y no ajustados a pH determinados, sugieren una mejor técnica para estimular la producción de ficocianina.

En cultivos de Gloeotrichia natans no enriquecidos con CO2 a pH 9, la proteína total de la ficocianina alcanzaba un 14% mientras que a pH 7 disminuía a un 5%, por lo que se ha considerado que el pH esta relacionado con la síntesis de este pigmento (Querijero et al., 1990).

Anabaena sp. PCC 7120 exhibió el mismo patrón de crecimiento a ambos niveles de CO2. Estos resultados sugieren que la concentración de carbono inorgánico existente en el aire y en el medio de cultivo es suficiente para su crecimiento, además de que el pH alcanzado con el suministro de CO2 no llega a ser el optimo para su crecimiento, ni para la producción de clorofila a y ficocianina.

En cultivos de Gloeotrichia natans tampoco se logró un incremento del crecimiento con CO2 al 1,5% (Querijero et al., 1990), mientras que en cepas silvestres de Synechococcus expuestas a bajo (0,03%) y alto (5%) CO2 en función de la concentración externa de NaHCO3 tampoco se registró diferencia en la actividad fotosintética (Martínez et al., 1997). De igual manera, en cultivos de las microalgas marinas, Nannochloropsis gaditana y Nannochloropsis maculata crecidas con bajo CO2 al 0,03% y alto CO2 al 1%, no se encontró diferencia significativa en cuanto a la producción final de biomasa (Huertas et al., 2000).

Para el caso de esta cepa de Anabaena, pareciera manifestarse un efecto de compensación en los cultivos a bajo CO2, posiblemente debido a un aumento de la afinidad por el CO2 y de la actividad de la anhidrasa carbónica, tal como ha sido descrito en Anabaena variabilis y Chlorella vulgaris; en las cuales hubo un aumento de la fotosíntesis debido a una mayor afinidad por el CO2 cuando fueron transferidas de cultivos con alto CO2 a cultivos con bajo CO2 (Aizawa y Miyachi, 1986).

Sin embargo, en otras cianobacterias, tales como Synechococcus sp. y Aphanothece halophytica, el suministro de CO2 al 0,5 y 3%, respectivamente, incrementó el crecimiento (Phlips et al., 1989; Tindall et al., 1978). Asimismo, el suministro de CO2 al 2% proporcionado por una mezcla de KHCO3 y K2CO3 como fuente de C02, es una técnica para estimular el crecimiento y síntesis de clorofila y carotenoides en las microalgas Chlorella vulgaris, Scenedesmus obliquus y en las cianobacterias Spirulina platensis, Nostoc A509 y Stigonema A80 (Tripathi et al., 2001). Por otra parte, se ha logrado la producción de cepas mutantes de Synechococcus sp. PCC 7942 dependientes de esta fuente de carbono y que requieren de altos niveles de CO2 para su crecimiento (Martínez et al., 1997).

En los cultivos discontinuos a pH elevados, la producción de EPS se mantuvo alta, a pesar de que la cianobacteria disminuye drásticamente su crecimiento a pH 10. El máximo contenido de EPS a bajos niveles de CO2 (Tabla III) es comparable al producido por cultivos autotróficos de Anabaena cylindrica 10C, el cual fue de 2360 µg ml-1, cuando se hizo crecer con el medio BG11, pero sin nitrógeno y con diferentes fuentes de carbono (Lama et al., 1996). Sin embargo, hasta el presente no se tiene información sobre la influencia que ejerce el pH en la producción de EPS en cianobacterias. Para el caso de Lactobacillus rhamnosus C83, sí se ha demostrado que la síntesis de EPS es dependiente del pH. A valores de pH entre 6,2 y 7,2 se optimizó su producción y a pH 5,2 se redujo significativamente (Gamar et al., 1998).

El aporte de suficiente nitrógeno al cultivo parece también contribuir a la producción de EPS, como se ha descrito en Aphanocapsa halophytica (Allen y Hutchinson, 1980; Sudo et al., 1995) y Anacystis nidulans cultivada con nitrato (Sangar y Dugan, 1972). En las cianobacterias Cyanothece sp. 16Som2 (De Philippis et al., 1993), Cyanothece sp. BH68 (Reddy et al.,1996) y Cyanospira capsulata ATCC 43194 (De Philippis et al., 1996) se ha reportado que la deficiencia de nitrógeno induce también la síntesis de EPS. En la diatomea Navicula subinflata, la elevada producción de EPS durante la fase estacionaria también está asociada a la limitación de nitrógeno y de silicato (Bhosle et al., 1995).

En el presente estudio, la cianobacteria se hizo crecer en medio de cultivo BG-11, caracterizado por un elevado contenido de NO3Na de 17mM (Rippka, 1988); con lo cual la elevada producción de EPS no fue debida a una deficiencia de nitrógeno.

Los resultados obtenidos sugieren que la influencia del pH en el crecimiento de Anabaena PCC 7120 es mayor que la del CO2. Además, permite incrementar la producción de ficocianina, clorofila y EPS en cultivos con suficiencia en nitrógeno, a bajos niveles de CO2 y sin el uso de soluciones amortiguadoras. La manipulación de las condiciones de cultivo de esta cianobacteria con potencial biotecnológico constituye una herramienta útil para incrementar la producción de pigmentos y EPS.

AGRADECIMIENTOS

El estudio fue parcialmente financiado por el Proyecto CONICIT S1-2000000786.

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