RELACIONES SEROLÓGICAS ENTRE AISLAMIENTOS BACTERIANOS DE LOS GÉNEROS Erwinia, Pectobacterium Y Pantoea

Yonis Hernández y Gustavo Trujillo

Yonis Hernández. Ingeniero Agrónomo y M.Sc. en Agronomía, Universidad Central de Venezuela (UCV). Profesor, Facultad de Agronomía, UCV. Dirección: Instituto de Botánica Agrícola, Facultad de Agronomía, UCV. Apartado Postal 4579, Maracay 2101, Edo. Aragua, Venezuela. e-mail: yonisa@cantv.ve

Gustavo Trujillo. Ingeniero Agrónomo, UCV. Ph.D., Michigan State University, EEUU. Profesor, Facultad de Agronomía, UCV. e-mail: gus202@cantv.net

Resumen

Este estudio fue realizado con el propósito de conocer las relaciones serológicas entre aislamientos pertenecientes a diferentes generos y especies de bacterias. Se utilizaron ocho aislamientos, tres de Pectobacterium chrysanthemi obtenidos de maíz (Zea mays), papa (Solanum tuberosum) y batata (Ipomoea batatas); tres de P. carotovora subsp. carotovora, provenientes uno de cafecito de jardín (Aglaonema commutatum ´María‘) y dos de tomate (Lycopersicon esculentum), con diferencias en el comportamiento fisiológico y patógeno. Los aislamientos restantes, uno fue obtenido de lechosa (Carica papaya) y el otro de Alocasia macrorrhiza. Los antisueros se obtuvieron inyectando conejos de 2,5 meses de edad en forma intravenosa con células formalizadas. Los antisueros fueron probados con antígenos homólogos y heterólogos como los utilizados en la presente investigación y con otros de los géneros Pseudomonas y Xanthomonas y de contaminantes bacterianos comunes. Los antisueros mostraron buenos títulos y resultaron ser muy específicos. Se establecieron seis serotipos diferentes. El primero (A) conformado por los aislamientos de P. chrysanthemi provenientes de papa y batata y el de P. carotovora subsp. carotovora de cafecito de jardín. El aislamiento de P. chrysanthemi proveniente de maíz constituyó un serotipo diferente (B). Los dos aislamientos de P. carotovora subsp. carotovora provenientes de tomate, así como los de Erwinia sp. de lechosa y P. agglomerans de Alocasia macrorrhiza, fueron colocados en diferentes serotipos que se denominaron C, D, E y F respectivamente.

Summary

This study was carried out in order to find the serological relationships between different isolates from different bacterial genera and species. Eight isolates were used, three of them from Pectobacterium chrysanthemi obtained from corn (Zea mays), potato (Solanum tuberosum) and sweet potato (Ipomoea batatas); three of Pectobacterium carotovora subsp. carotovora, one coming from garden coffee (Aglaonema commutatum ‘María`) and the other two from tomato (Lycopersicon esculentum), differing in some physiological tests and pathogenicity. Two other isolates were of Erwinia sp. from papaya (Carica papaya) and Pantoea agglomerans from Alocasia macrorrhiza. Antisera were obtained by intravenous injection of formalized cells in rabbits 2.5 months old. The antisera produced were tested with the homologous and heterologous antigens used in this research, others from the genera Pseudomonas and Xanthomona, and isolates of common contaminating bacteria. The antisera showed good titer and were quite specific. Six serological serotypes were cleary separated. The first one (A) for two isolates of P. chrysanthemi, coming from potato and sweet potato and the P. carotovora subsp. carotovora of garden coffee. The isolate from corn also P. chrysanthemi formed a different serotype (B). The other isolates, two of P. carotovora subsp. carotovora from tomato, Erwinia sp. from papaya and P. agglomerans from Alocasia macrorrhiza were placed each one in a different serotype: C, D, E and F respectively.

Resumo

Este estudo foi realizado com o propósito de conhecer as relações serológicas entre isolamentos pertencentes a diferentes gêneros e espécies de bactérias. Utilizaram-se oito isolamentos, três de Pectobacterium chrysanthemi obtidos de milho (Zea mays), batata (Solanum tuberosum) e batata doce (Ipomoea batatas); três de P. carotovora subsp. carotovora, provenientes um de "Cafecito de Jardin" (Aglaonema commutatum ´María`) e dois de tomate (Lycopersicon esculentum), com diferenças no comportamento fisiológico e patógeno. Os isolamentos restantes, um foi obtido de mamão (Carica papaya) e o outro de Alocasia macrorrhiza. Os anti-soros se obtiveram injetando coelhos de 2,5 meses de idade em forma intravenosa com células formalizadas. Os anti-soros foram provados com antígenos homólogos e heterólogos como os utilizados na presente investigação e com outros dos gêneros Pseudomonas e Xanthomonas e de contaminantes bacterianos comuns. Os anti-soros mostraram bons títulos e resultaram ser muito específicos. Se estabeleceram seis serotipos diferentes. O primeiro (A) conformado pelos isolamentos de P. chrysanthemi provenientes de batata e batata doce e o de P. carotovora subsp. carotovora de "cafecito de jardin". O isolamento de P. chrysanthemi proveniente de milho constituiu um serotipo diferente (B). Os dois isolamentos de P. carotovora subsp. carotovora provenientes de tomate, assim como os de Erwinia sp. de mamão e P. agglomerans de Alocasia macrorrhiza, foram colocados em diferentes serotipos que se denominaram C, D, E y F respectivamente.

Palabras clave / Erwinia / Pantoea / Pectobacterium / Serotipo /

Recibido: 21/01/2004. Modificado: 06/07/2004. Aceptado: 22/07/2004.

Introducción

El género Erwinia, dividido ahora en Erwinia, Pectobacterium, Pantoea y Brenneria, e inicialmente denominado así en honor de Erwin Smith, fue el primero propuesto para bacterias patógenas de plantas con forma de bastón, móviles por flagelos perítricos y anaeróbicos facultativos (Young et al, 1992).

Noval (1991) señala que mientras algunos miembros del género Erwinia se limitan a vivir sobre las superficies vegetales o a ejercer un papel secundario en diversas infecciones, otros, verdaderos patógenos, desencadenan enfermedades de gran interés para la agricultura, como es el caso del tizón del fuego de las rosáceas, cuyo agente productor (Erwinia amylovora) merece destacarse por las medidas de lucha adoptadas en su contra, reflejo de su importancia, y también por la curiosidad histórica de constituir el punto de partida de la bacteriología vegetal. En este género figuran también organismos de menor renombre histórico, pero más devastadores e importantes por el daño que ocasionan a los cultivos y a los productos hortícolas, tales como las erwinias que producen pudriciones blandas, donde se destacan principalmente E. carotovora y E. chrysanthemi (ahora Pectobacterium carotovora subsp. carotovora y P. chrysanthemi), cuya importancia se incrementa por el amplio rango de hospedantes y su distribución mundial, así como sus mecanismos de sobrevivencia y dispersión (Perombelon y Kelman, 1980).

En Venezuela (Trujillo, 1996) este género ha venido adquiriendo importancia en los últimos años, sobre todo el grupo causante de pudriciones blandas. Integrantes del género Erwinia han sido señalados en cultivos y plantas ornamentales, entre ellos Dieffenbachia sp. (Ochoa et al., 1987), tomate (Lycopersicon esculentum L. Mill; Custodio et al., 1993), batata (Ipomoea batatas L. Lam; Varela et al., 1993), papa (Solanum tuberosum L.; Faría et al., 1993), maíz (Zea mays L.; Hernández et al., 1994), lechosa (Carica papaya L.; Soto, 1994), mango (Mangifera indica; Guevara et al., 1980), zanahoria (Daucus carota; Rodríguez et al., 2002), patilla (Citrullus lanatus; Carvajal y Corrales, 1993), plátano (Musa AAB; Ordosgoitti et al., 1974), yuca (Manihot esculenta Crantz; Guevara et al., 1992), cafecito de jardín (Aglaonema commutatum; Hernández y Trujillo, 1993a).

Como se evidencia en la cantidad de cultivos atacados por integrantes del género antes denominado como Erwinia, cobra importancia establecer en el país nuevos métodos de identificación o diagnóstico, ya que el método convencional que contempla el aislamiento del patógeno, y su caracterización fisiológica y bioquímica, consume mucho tiempo y reactivos, siendo estos últimos cada vez más difícil de conseguir y con costos crecientes en el tiempo.

La serología constituye una herramienta de gran potencial de uso en laboratorios locales, ya que permite una identificación rápida y precisa de cualquier patógeno. No obstante, su aplicación está supeditada al estudio de los antisueros a usar en cada caso, la determinación de su especificidad y el establecimiento de sus relaciones serológicas con otros aislamientos bacterianos, de tal manera que su uso sea lo más acertado posible (Schaad, 1979; Rodríguez, 1989).

Se han preparado antígenos del género Erwinia contra células vivas y células muertas con calor, inmunógenos purificados y no purificados, los cuales han sido usados para la diferenciación o identificación de todas las especies del género excepto para E. ananas, E. cipripedii, E. mallotivora, E. rhapontici y E. Uredovora, y se han determinado serogrupos para E. carotovora (De Boer et al., 1979) y E. chrysanthemi (Samson y Nassan-Agha, 1978; Yakrus y Schaad, 1979).

En esta investigación se planteó como objetivo el establecer las relaciones serológicas entre ocho aislamientos de los géneros Erwinia, Pectobacterium y Pantoea de tal manera que se puedan utilizar los antisueros para diagnóstico y otros estudios epidemiológicos. Información preliminar de esta investigación ha sido presentada (Hernández y Trujillo, 1997).

Materiales y Métodos

Aislamientos utilizados

Se utilizaron ocho aislamientos bacterianos pertenecientes a los géneros Erwinia, Pectobacterium y Pantoea: tres aislamientos de P. carotovora subsp. carotovora, dos de los cuales fueron obtenidos de tomate (Lycopersicon esculentum Mill) y que se diferenciaban (Pcca y Pccf, respectivamente) en algunas características fisiológicas y de patogenicidad (Custodio et al., 1993) y otro (Pccc) proveniente de cafecito de jardín (Aglaonema commutatum ‘María’; Hernández y Trujillo, 1993a); tres aislamientos de E. chrysanthemi obtenidos uno (Pcb) de batata (Ipomoea batatas L. (Lam)), otro (Pcp) de papa (Solanum tuberosum; Faría et al., 1993) y otro (Pcm) de maíz (Zea mays; Hernández et al., 1994); un aislamiento de Pantoea agglomerans (P.a.) proveniente de ocumo bravo (Alocasia macrorrhiza cv. Variegata; Garrido et al., 1993) y un aislamiento de Erwinia sp. (E.l.) obtenido de lechosa (Carica papaya; Soto et al., 1993).

Obtención de antisueros

Para tal fin, se utilizaron conejas de 2,5 meses de edad, las cuales fueron inyectadas con células bacterianas formalizadas de los aislamientos señalados anteriormente según metodología de Trujillo y Saettler (1981).

Formalización de células bacterianas

Las bacterias señaladas fueron sembradas en placas que contenían medio agar nutritivo (AN). Se sembraron 6 placas por aislamiento bacteriano. Los cultivos sembrados se incubaron en condiciones de laboratorio (temperatura promedio 24ºC) por 48h y posteriormente fueron removidas del medio con formol salino, dejando la suspensión en condiciones de laboratorio por 48h, de tal manera que las células murieran pero se mantuviese intacto el flagelo.

Seguidamente las células fueron centrifugadas dos veces a 3500rpm por 15min en una centrífuga CRU-500 y resuspendidas en solución salina. Se verificó la esterilidad de la solución sembrando una ansada de la misma en placas con agar nutritivo. Se ajustó la concentración de las suspensiones bacterianas a una lectura de absorbancia de 0,224 a l=490nm, medida en un espectrofotómetro Spectronic 21. Las suspensiones (3ml) fueron conservadas a 0ºC en botellas serológicas hasta su utilización.

Inmunización de las conejas

Antes del proceso de inmunización se obtuvo suero normal sangrando los conejos en la vena marginal de la oreja izquierda, para determinar por pruebas de aglutinación en tubos si los conejos que se iban a inmunizar poseían anticuerpos para los antígenos a utilizar. Una vez determinado lo anterior, se procedió a la inmunización de los conejos, aplicándo inyecciones intravenosas a intervalos de tres días y en dosis crecientes de 0,1ml el primer día; 0,3ml a los 3 días; 0,5ml a los 6 días; 1,0ml a los 9 días hasta 2,0ml a los 12 días. Las inyecciones fueron en la vena marginal de la oreja derecha (Trujillo y Saettler, 1981). A los 8 días después de la última inyección, se realizó el sangrado para la obtención del antisuero.

Los antisueros fueron sometidos a varias pruebas, entre ellas: títulos por aglutinación en tubos y por doble difusión en agar, confrontación de los antisueros con antígenos heterólogos en pruebas de aglutinación en tubos y por doble difusión en agar.

Pruebas en aglutinación en tubos

Se determinaron títulos de los antisueros con sus antígenos homólogos y heterólogos (correspondientes a las bacterias usadas en el estudio) con células vivas (antígenos totales) y células sometidas a calor húmedo por 30 min a 100ºC (antígenos termoestables) para los diferentes antígenos.

Pruebas de doble difusión en agar

Se establecieron títulos de los antisueros con sus respectivos homólogos y antígenos heterólogos utilizando antígenos totales y antígenos termoestables. Se usó agar purificado al 0,7%, 10ml de solución 1% (peso/volumen) de Orange G, 30ml de solución de 10mg/ml de azida de sodio (NaN₃) y buffer salino hasta 1000ml. El medio fue esterilizado y vaciado a razón de 20ml por placa desechable de 90mm diam. En cada placa se montaron 4 pruebas serológicas, realizando para ello un orificio o celdilla central de aproximadamente 7mm diam. y seis celdillas laterales de igual diámetro y separadas a una distancia de 5mm de la celdilla central. En la celdilla central se colocó el antígeno y en las laterales las diluciones del antisuero.

Se realizaron pruebas de especificidad de los antisueros, confrontándolos con bacterias pertenecientes a los géneros Erwinia, Pectobacterium, Pantoea, Xanthomonas, Pseudomonas, y con contaminantes bacterianos comunes en el laboratorio; en este caso se usaron antígenos totales y termoestables.

Cada prueba serológica en doble difusión en agar fue realizada por duplicado e incubada en condiciones de laboratorio (temperatura promedio 24ºC). Las observaciones fueron tomadas diariamente hasta una semana después de iniciada la prueba. Se observó la formación o no de bandas y el número y tipo de bandas formadas en el agar.

Resultados y Discusión

Pruebas de aglutinación en tubos

En las Tablas I y II aparecen los títulos obtenidos en las pruebas de aglutinación en tubos de las bacterias en estudio, al ser confrontadas con células vivas y tratadas con calor de sus antígenos homólogos y heterólogos. Se observa que los antisueros obtenidos poseen títulos altos con sus antígenos homólogos, lo que evidencia que los aislamientos bacterianos utilizados para inmunizar a los conejos tenían una alta capacidad inmunogénica. Asimismo, los títulos fueron mayores con células vivas de sus antígenos homólogos que con células sometidas a calor. No obstante, el antisuero obtenido para P. agglomerans presentó títulos más altos con células tratadas con calor.

En la Tabla II se presentan los resultados de la confrontación de los antisueros con células tratadas con calor (también llamados antígenos termoestables o antígenos "O") de antígenos homólogos y heterólogos. Se observa que los antisueros contra Pccc y Pcb tienen un comportamiento similar, ya que los títulos obtenidos con sus respectivos homólogos y heterólogos (reacciones cruzadas) son iguales al ser utilizados indistintamente entre ellos. También se comportaron en forma similar con la bacteria Pcp. Estos resultados evidencian un comportamiento parecido entre las tres bacterias (Pccc, Pcb y Pcp).

Pccc y Pcb tienen la misma carga antigénica (sometida a calor) la cual posee antígenos comunes con Pcp. De igual manera todos los antígenos sometidos a calor de Pcp están presentes en Pccc y Pcb, constituyendo por lo tanto Pccc, Pcb y Pcp un serotipo aparte y bastante diferenciado del resto que se denominará serotipo A.

Los integrantes del serotipo A, respecto a sus antígenos sometidos a calor, no guardan ninguna relación con las bacterias Pcm, Pcca, Pccf, E.l. y P.a., lo que se evidencia en los títulos tan bajos obtenidos, o en ausencia de reacción al confrontar los antisueros de Pccc, Pcb y Pcp con las bacterias mencionadas.

En la Tabla II también se aprecia que los antisueros a Pccf, E.l. y P.a., al reaccionar con sus respectivos homólogos y heterólogos, presentan títulos muy bajos con estos últimos, y en algunos casos no se observa reacción. Esto denota su especificidad y aplicabilidad en labores de diagnóstico y en estudios epidemiológicos; Pccf, E.l. y P.a. constituyen cada una, en relación a sus antígenos termoestables, un serotipo diferente que se denominarán D, E y F, respectivamente.

Por otra parte, los antígenos termoestables de la bacteria Pcm son compartidos por Pcca, ya que el antisuero para la primera bacteria presenta un título similar con su homólogo y con Pcca. Sin embargo, lo mismo no ocurre con el antisuero de Pcca en relación a los antígenos termoestables de Ecm. En virtud de que estos resultados son contradictorios, es recomendable repetir los experimentos para confirmar su autenticidad.

Cuando se confrontan los antisueros obtenidos con células vivas (no tratadas) con los antígenos homólogos y heterólogos (Tabla II), se confirman los resultados ya mencionados con antígenos tratados (sometidos a calor húmedo) y en este caso se tiene una visión más general, teniendo en consideración el hecho de que en las células vivas están presentes todos los antígenos de los aislamientos bacterianos estudiados (los antígenos O, resistentes al calor y también llamados antígenos somáticos; los antígenos H o flagelares o; los provenientes de las regiones externas; los susceptibles al calor húmedo; etc.).

La primera consideración sobre los resultados de la Tabla II es la confirmación de la existencia del denominado serotipo A en relación a los antígenos O resistentes al calor, el cual se mantiene en la misma forma, constituido por Pccc, Pcb y Pcp, formando un serotipo bastante compacto. Con relación a los antígenos no resistentes al calor, se observa que Pcp tiene antígenos comunes con Pcca y Pccf y también con Pcm y E.l., pero en una proporción mucho menor. No obstante, estos últimos resultados no son equiparables con las estrechas relaciones existentes entre Pccc, Pcb y Pcp y sus antígenos termoestables.

Resulta curioso el comportamiento del antisuero a Pcb, el cual posee un título de 1:8192 con células de Pcp sometidas a calor y de tan solo 1:2048 con antígenos totales. Esto posiblemente se deba a la presencia de antígenos de superficie presentes en células vivas del género Erwinia (Mushin et al., 1959) los cuales actúan como blanqueadores de la unión antígeno-anticuerpo.

Pccc mantiene prácticamente el mismo comportamiento con antígenos termoestables y antígenos totales en todos los aislamientos estudiados, y Pcb muestra antígenos no termoestables comunes con Pcm y E.l. Por otra parte, Pcm, Pccc, Pccf y P.a. no muestran reacción de sus antisueros con los antígenos totales del serotipo A, pero si muestran entre ellos algunos antígenos comunes que, de acuerdo a los títulos obtenidos, parecen tener poca importancia y son fácilmente visualizados si siempre se utiliza como control el homólogo respectivo, sobre todo si se van a emplear en diagnóstico o en evaluaciones epidemiológicas.

Lo señalado corresponde a todos los grupos de bacterias, los cuales poseen antígenos comunes debido a su composición química, pero también existen antígenos específicos para cada uno de los aislamientos. Tunstall y Gowland (1975), detectaron en el género Pseudomonas, tres antígenos diferentes asociados con la pared celular. Uno de ellos, no resistente al calor, era común a todas las Pseudomonas y que consistía del mucopéptido de la pared celular, formado por carbohidratos y polipéptidos; otro antígeno también común a las Pseudomonas, compuesto de polisacáridos y lipopolisacáridos, situado después del primero; y un antígeno altamente específico con un alto peso molecular, que formaba una especie de envoltura alrededor de la célula, compuesto de proteína o lipoproteína.

En el género Xanthomonas, Elrod y Braun (1947) señalan la existencia de un mucopolisacárido responsable de reacciones cruzadas entre aislamientos de ese género, pero cuando ese material es eliminado, las reacciones se hacen más específicas.

Con respecto al género Erwinia, Elrod (1941) señala la incapacidad para diferenciar entre aislamientos de E. carotovora, E. atroseptica y E. aroidea (ahora Pectobacterium carotovora subsp. carotovora y P. carotovora subsp. atroseptica) con antisueros a células vivas e igual tipo de antígeno, y sugiere que las reacciones cruzadas pueden ser el resultado de antígenos flagelares comunes presentes en la preparación de células completas utilizadas para la inmunización. Resultados similares fueron reportados por Lazar (1972) en igual tipo de pruebas y antígenos totales, señalando que los organismos incluídos para ese momento en el género Erwinia parecían formar un grupo estrechamente relacionado serológicamente. Aunque el autor no lo menciona, esto se debe a la presencia de antígenos comunes entre esas bacterias. En contraste, Samson (1973), al usar antígenos somáticos (más específicos) y antisueros contra este tipo de antígeno, señala que E. carotovora var. chrysanthemi (ahora P. chrysanthemi) es serológicamente distinta de E. carotovora subsp. carotovora y E. carotovora subsp. atroseptica.

En el presente estudio, a través de pruebas de aglutinación en tubos, fue imposible diferenciar con antígenos termoestables o con antígenos totales a las bacterias Pccc y Pcb.

Pruebas de doble difusión en agar

En las Tablas III y IV se indican los resultados de los títulos obtenidos en pruebas de doble difusión en agar para los antisueros bajo estudio, usando como antígenos células sometidas a calor y células vivas, respectivamente. En este caso, los títulos de los antisueros bajaron considerablemente con respecto a los obtenidos en pruebas de aglutinación en tubos. Estos resultados son comúnmente encontrados en este tipo de prueba y han sido señalados por varios investigadores (Trujillo y Saettler, 1981; Hernández y Trujillo, 1993b; Muñoz, 1996).

Los resultados obtenidos en esta prueba corroboran con mayor fuerza los obtenidos en pruebas de aglutinación en tubos con antígenos termoestables y antígenos totales, donde queda el serotipo A conformado por Pccc, Pcb y Pcp, así como los serotipos B, C, D, E y F, conformados por Pcm., Pcca, Pccf, E.l. y P.a., respectivamente. También queda evidenciado que aunque Pcb y Pcp poseen antígenos comunes a otros aislamientos, éstos no están en suficiente cantidad como para obtener una reacción visible en pruebas de doble difusión en agar. Este mismo razonamiento es válido para Pcm, Pcca, Pccf, E.l. y P.a. Igualmente se confirma que la reacción de los antígenos termoestables de Pcca con el antisuero a Pcm en pruebas de aglutinación en tubos, es dudosa y deberá ratificarse ya que no se observa reacción en doble difusión en agar con diluciones del antisuero, y sólo se observa reacción cuando se utiliza el antisuero sin diluir, siendo la reacción diferente a la del homólogo.

Por otra parte, el aislamiento Pcp presentó como título con los antisueros a Pccc y Pcb en pruebas de aglutinación en tubos de 1:4096 y 1:2048, respectivamente, con antígenos totales; sin embargo, en pruebas de doble difusión en agar no se observó reacción. Esto se puede explicar porque los antígenos que difunden con mayor facilidad en el agar son antígenos solubles que en su mayoría resultan de la ruptura celular al someter a las bacterias al calor. En este caso el agar funciona retringiendo el movimiento de los elementos particulados de mayor tamaño (Shepard, 1972).

Resalta también el comportamiento del antisuero obtenido a E.l., que en pruebas de aglutinación en tubos presentó títulos más altos con antígenos totales que con antígenos sometidos a calor, mientras que en pruebas de doble difusión en agar sucedió lo contrario, es decir, los títulos fueron mayores con antígenos termoestables que con antígenos totales. Este hecho es curioso y en la literatura no se encontró explicación al respecto. Sin embargo, sería conveniente tratar previamente los antígenos totales con sodio dodecil sulfato o vaciar las placas con algún agente disociante para determinar si este hecho se debe a poca difusión en el agar por parte de los agentes reaccionantes.

En general, en los serotipos A y F se cumplió que el título en doble difusión en agar, con antígenos totales, fue mayor que con antígenos termoestables (Figuras 1a-f). Esto es lo que normalmente se ha señalado con antisueros obtenidos con bacterias del género Xanthomonas (Trujillo y Saettler, 1981; Hernández y Trujillo, 1993b), Pseudomonas (Hernández, 1989; Muñoz, 1996) y Erwinia (Soto, 1994; Muñoz, 1996).

De Boer et al. (1979) encontraron con E. carotovora (ahora P. carotovora) que el tratamiento con calor para desnaturalizar antígenos de superficie se tradujo en títulos bajos de los antisueros. Iguales resultados fueron obtenidos con células de Proteus ruttgeri tratadas con calor (Penner et al., 1974). De Boer et al. (1979) señalan que aunque el tratamiento con calor no parece destruir los antígenos O, puede causar disociación en subunidades no antigénicas. Esto no se cumplió para los serotipos B (a Pcm), C (a Pcca), D (Pccf) y E (E.l.). En estos grupos, B y C presentaron el mismo título tanto con antígenos termoestables como con antígenos totales, mientras que E dio mayor título con antígenos termoestables y D sólo reaccionó con sus antígenos totales cuando se utilizó el antisuero puro sin diluir.

Al analizar las pruebas de especificidad para los antisueros obtenidos (Tabla V) se aprecia que los antisueros a Pccc, Pcb, Pcp y Pcm resultan más específicos al ser confrontados con antígenos sometidos a calor, y que Pccf, E.l. y P.a son altamente específicos. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Lucas y Grogan (1969), quienes reportaron que cuando los antígenos de Pseudomonas lachrymans fueron calentados por una hora a 100ºC la mayoría de los antígenos termoestables comunes desaparecieron, facilitando la observación de las líneas de precipitación producidas por antígenos específicos termoestables. Guillorit y Samson (1993) señalaron igualmente que las reacciones cruzadas que ocurren con células bacterianas completas desaparecen cuando se emplean preparaciones de lipopolisacáridos (LPS) o antígenos O (bacterias sometidas a calor).

En la Figura 2 se evidencia nuevamente el serotipo A, en este caso ratificado por las reacciones de identidad total, que se forma entre Pccc, Pcb y Pcp con cualquiera de los tres antisueros. Aunque Pcca reacciona con antígenos termoestables de Pccc, Pcb y Pcm, las líneas de precipitación formadas son fácilmente diferenciables a las del antígeno homólogo. Igual sucede con los antisueros de Pcm que reacciona con Pcca y la Pseudomonas sp. aislada de sorgo y Pccf que también reacciona con esta última bacteria.

Con antígenos totales (Tabla V), la reacción fue la esperada para el serotipo A, donde todos reaccionaron entre si (con reacción de identidad total) y con Pcm, pero en este caso la reacción fue fácilmente diferenciable a la del homólogo. Iguales resultados ocurrieron con los antisueros a Pcca, E.l. y P.a., que reaccionan con Pccc, Pcb y Pcp, pero en forma diferencial a la reacción con sus respectivos homólogos. El antisuero a Pccf solamente reacciona con su homólogo, lo que denota alta especificidad de sus antígenos totales y el hecho que constituye un serotipo aparte, completamente diferente del resto.

También se observó relación serológica con otros géneros de bacterias como es el caso de Pcb que reaccionó con Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (ahora X. vesicatoria) y E.l. con la Pseudomonas sp. de sorgo. Sin embargo, estas reacciones fueron muy débiles y fácilmente diferenciables de las de sus respectivos homólogos. En la literatura se señala la existencia de antígenos comunes entre géneros de bacterias, sobre todo cuando se utilizan células completas como antígenos (Trujillo y Saettler, 1981; Hernández y Trujillo, 1993b).

En la Tabla VI se muestra el número de bandas que se forman al confrontar los antisueros obtenidos con células sometidas a calor y células vivas de sus antígenos homólogos y heterólogos. Se observa heterogeneidad en las reacciones. Para los antisueros a Pcp y Pcca se cumplió que el número de bandas formadas fue mayor con células vivas (antígenos totales) que son células sometidas a calor (antígenos termoestables), lo que concuerda con lo observado por otros (Trujillo y Saettler, 1981; Hernández y Trujillo, 1993b; Soto, 1994). La explicación de este comportamiento puede estar en el hecho ya mencionado, de que con células vivas el número de antígenos involucrados en la reacción es mayor, lo que se traduce en la formación de un número mayor de bandas. Sin embargo, esto no se cumplió para los antisueros a Pccc, Pcm, Pccf, E.l. y P.a., donde el número de bandas formadas con su homólogo fue mayor con antígenos termoestables que con antígenos totales. En este caso pudiese estar sucediendo que el calor permite una mejor disociación de algunos antígenos los cuales, dependiendo de su tamaño, tienen una difusión diferencial en el agar, lo que podría traer como consecuencia la formación de varias bandas de precipitación. De Boer et al. (1987) no encontraron en P. chrysanthemi diferencias en el número de bandas cuando utilizaron suspensiones tratadas y no tratadas con calor, las que produjeron bandas de precipitación similares.

Entre los integrantes del serotipo A (Pccc, Pcb y Pcp) el antisuero a Pccc, al reaccionar con antígenos sometidos a calor de la bacteria Pcp, forma un número mayor de bandas que con su homólogo e igual sucede con la reacción cruzada (antisuero a Pcp con la bacteria Pccc). Lazar (1972) encontró que algunos aislamientos de Erwinia, particularmente entre pectobacterias (P. carotovora), reaccionaron más fuertemente con antisueros de aislamientos de otras especies que con la bacteria homóloga, resultados que son análogos a los obtenidos en este trabajo.

En forma general, es posible señalar que las relaciones serológicas más estrechas, tanto en pruebas de aglutinación en tubos como en pruebas de doble difusión en agar, se presentaron en lo que se denominó serotipo A, conformado por una P. carotovora subsp. carotovora (Pccc) y dos aislamientos de P. chrysanthemi obtenidos de dos hospedantes diferentes (Pcb y Pcp). Lazar (1972) encontró bandas de precipitación comunes entre aislamientos de P. chrysanthemi, P. carotovora y P. carotovora subsp. atroseptica, usando como antígenos extractos bacteriales de origen desconocido. Igualmente, Yakrus y Schaad (1979) reportaron que un aislamiento denominado A.7 de P. carotovora, presentó antígenos de bandas débiles de precipitación al usar antisueros obtenidos de complejos de proteínas de membrana de varios aislamientos de P. chrysanthemi.

Con relación a P. chrysanthemi, diferentes autores plantean que en esta especie existen varios subgrupos serológicos. Yakrus y Schaad (1979) agruparon 27 aislamientos de P. chrysanthemi en 4 serovares diferentes, y Dickey et al. (1984) ubicaron en 4 serovares a 315 aislamientos de esa especie y de diferentes hospedantes.

En la presente investigación se determinó que, de los tres aislamientos de P. chrysanthemi utilizados (Pcb, Pcp y Pcm), Pcb y Pcp están estrechamente relacionados, mientras que Pcm constituye claramente un serotipo diferente. Esto concuerda con los resultados obtenidos por Albornoz y Rivera (1980) y Dickey et al. (1987), quienes no encontraron relación serológica entre aislamientos provenientes de maíz y los obtenidos de otros hospedantes, considerando a los de maíz como un serotipo diferente.

En lo que respecta a P. carotovora subsp. carotovora, ya se discutió la estrecha relación serológica del Pccc con aislamientos de P. chrysanthemi (serotipo A), mientras que Pcca y Pccf claramente conforman serotipos diferentes entre si. Schaad (1974) señaló la carencia de relaciones serológicas entre seis aislamientos de P. carotovora, y De Boer et al. (1979) establecieron 18 serogrupos para esta especie. En este estudio sólo se incluyeron 3 aislamientos, donde Pcca y Pccf provienen de un mismo hospedante (frutos de tomate) cultivado en sitios distintos. En estudios previos se determinó que estos dos últimos aislamientos diferían en patogenicidad y en algunas pruebas fisiológicas (Custodio et al., 1993), corroborando estos resultados la variabilidad serológica de la especie.

Existe una clara diferenciación serológica entre los aislamientos de E.l. y P.a., y entre los aislamientos de P. carotovora y P. chrysanthemi particularmente cuando se utilizan antígenos termoestables.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo parcialmente financiado por FONACIT, proyectos S1-2001000998 y S1-2001001009.

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