Evaluación de la actividad antioxidante de extractos de flavonoides de cáscara de naranja en el aceite de soja desodorizado

 

Mario José Moreno Álvarez, Douglas Rafael Belén Camacho, María Paola Sánchez, 

Miguel Viloria Matos y David García

Mario José Moreno Álvarez. Licenciado en Biología, Universidad de los Andes (ULA), Venezuela. Magíster en Enseñanza de la Biología, Universidad Pedagógoca Libertador, (UPEL), Maracay, Venezuela. Profesor, Universidad Simón Rodríguez (USR), Venezuela. Dirección: Laboratorio de Biomoléculas, Universidad Simón Rodríguez, Canoabo, estado Carabobo Venezuela. email: morenoalvarez@cantv.net

Douglas Rafael Belén Camacho. Ingeniero en Alimentos, USR, Venezuela. Investigador, Laboratorio de Biomoléculas, USR, Canoabo, Venezuela. Profesor, USR, Venezuela. e-mail: biomoleculasdrbc@hotmail.com

María Paola Sánchez. Estudiante graduado de Ingeniería de Alimentos, USR, Canoabo, Venezuela.

Miguel Viloria Matos. Estudiante graduado de Ingeniería de Alimentos, USR, Canoabo, Venezuela.

David García. Ingeniero en Alimentos, USR, Venezuela. Investigador, Laboratorio de Biomoléculas, USR, Canoabo, Venezuela.

 

Resumen

Se evaluó la actividad antioxidante de los extractos acuosos y orgánicos provenientes de la cáscara de naranjas. Las cáscaras se procesaron para producir harinas y extraer los flavonoides mediante solventes orgánicos empleando relaciones harina/solvente de 1/2; 1/1,33 y 1/1; los extractos finales fueron secados a presión reducida en un rotaevaporador a 60ºC hasta sequedad. Los productos secos fueron dosificados a muestras de aceite de soja desodorizado en proporciones de 0,01; 0,05 y 0,10%. Las muestras fueron luego colocadas en una estufa de aire a 60 ±1ºC y a intervalos de 24h se les determinó el índice de peróxidos hasta alcanzar un valor máximo de 100meq de O₂/kg. El extracto de mayor capacidad antioxidante fue el acuoso en proporción 0,10% (P<0,05).

Summeary

The antioxidant activity of aqueous and organic flavonoid extracts from orange peels was evaluated. Orange peels were transformed into flour and flavonoids were extracted employing flour/solvent ratios of 1/2, 1/1.33 and 1/1. Final extracts were dried at reduced pressure in a rotaevaporator at 60ºC. Dry products were dosed to deodorized soybean oil in the proportions 0.01, 0.05 and 0.10%. Then, the samples were placed in an air stove at 60 ±1ºC and every 24h peroxide was determined until a maximum value of 100meq O₂/kg. The largest antioxidant activity was found with the 0.10% aqueous extract (P<0.05).

Resumo

Avaliou-se a atividade antioxidante dos extratos aquosos e orgânicos provenientes da casca de laranjas. As cascas se processaram para produzir farinhas e extrair os flavonóides mediante solventes orgânicos empregando relações farinha/solvente de 1/2; 1/1,33 e 1/1; os extratos finais foram secados a pressão reduzida em um rota-evaporador a 60ºC até sequidão. Os produtos secos foram dosificados a amostras de azeite de soja desodorizado em proporções de 0,01; 0,05 e 0,10%. As amostras foram logo colocadas em uma estufa de ar a 60 ±1ºC e a intervalos de 24h, determinou-se nestas o índice de peróxidos até alcançar um valor máximo de 100 meq de O2/kg. O extrato de maior capacidade antioxidante foi o aquoso em proporção 0,10% (P<0,05).

PALABRAS CLAVE / Aceites / Antioxidantes / Flavonoides / Naranja / Soja /

Recibido: 25/02/2004. Modificado: 03/08/2004. Aceptado: 11/08/2004.

 

Introducción

En Venezuela la naranja (Citrus sinensis L.) es la fruta cítrica que posee mayor popularidad por la industrialización de su jugo (Henríquez, 1995). Cerca del 50% de la biomasa existente es aprovechada, mientras que el otro 50%, constituido por cáscaras y semillas, queda subutilizado (Cerezal et al., 1994; Moreno-Álvarez et al., 1994; Cerezal y Piñera, 1996). De las proyecciones elaboradas por Castro y Suárez (2002) para 2010 se prevé una producción nacional de naranjas de 907840TM. La producción de desecho y flavelo, los que son ricos en aceites esenciales, carotenoides, y compuestos fenólicos, se estima en 67882TM y 7006TM, respectivamente, (Bocco et al., 1998; Martínez-Valverde et al., 2000).

Entre los metabolitos secundarios presentes en la cáscara de los cítricos se encuentran los flavonoides, los cuales constituyen el grupo más importante dentro de los compuestos fenólicos porque son considerados micronutrientes en la dieta animal. Estos compuestos abundan en la naturaleza, son de bajo peso molecular y comparten el esqueleto común de difenilpiranos, dos anillos bencénicos unidos a través de un anillo pirona.

La estructura molecular de los flavonoides consiste en un esqueleto de 15 átomos de carbono (C15). La biosíntesis de esta unidad C6C3C6, deriva de dos rutas separadas. Los anillos A provienen de la condensación de dos unidades malonil coenzima A y acetil coenzima A. La otra ruta forma el anillo B y los átomos de carbono 2, 3 y 4, y deriva del ácido cinámico. El primer intermediario estable es la chalcona. Los pasos subsecuentes conducen a la formación de varios flavonoides, los cuales controlan los patrones de hidroxilación, los niveles de oxidación, las posiciones de O-metilación y la glicosilación (Mabry et al., 1970; Albornoz, 1980).

La estabilidad durante los procesos de extracción y purificación es debida a la alta resonancia que le confieren los anillos bencénicos; los flavonoides presentan una alta estabilidad molecular, soportando bajas y altas temperaturas, hasta de 300ºC. Pueden ser extraídos inicialmente con solventes orgánicos sin perder sus propiedades estructurales, y son muy estables al calor y a las reacciones de oxidación, resistiendo la mayoría de los tratamientos térmicos que se emplean en la manufactura de los alimentos enlatados (Badúi, 1996).

Las flavanonas, flavonas y flavonoles son los flavonoides presentes en los cítricos. Aunque las flavonas y los flavonoles se han encontrado en bajas concentraciones en comparación con las flavononas, han mostrado ser potentes antioxidantes, secuestradores de radicales libres o agentes que contribuyen a la acción anticancerígena y cardioprotectora, entre otras. Estos compuestos tienen aplicación en la estabilización de los alimentos debido a su habilidad de protegerlos contra la peroxidación. Dadas estas propiedades que pueden aportar dichos compuestos, se plantea la alternativa de utilizarlos como antioxidantes naturales en grasas y aceites. Por su actividad antioxidante y sus excelentes funciones biológicas, algunos autores los refieren como sustitutos de los antioxidantes sintéticos existentes, pudiendo aportar beneficios tecnológicos, científicos, nutricionales y medicinales (Kale y Adsule, 1995; Harbone y Williams, 2000; Martínez-Valverde et al., 2000). La propiedad antioxidante de algunos flavonoides es determinada por la estructura o-dihidroxi en el anillo B, el 2,3 doble enlace en conjunción con la función 4-oxo y la presencia de ambos grupos hidroxilados en posición 3 y 5.

Las flavononas son las responsables de los sabores amargos en los cítricos, siendo la naringina y la neohesperidina los componentes mayoritarios. Además, ciertos glicósidos flavanónicos amargos o insípidos pueden transformarse por la apertura del anillo en chalcona, que por hidrogenación posterior se trasforma en dihidrochalcona, compuesto de poder edulcorante igual o superior a la sacarina (Markham, 1982).

Entre los flavonoides destacan por su importancia los flavonoles, que se encuentran en muchos productos como cebollas y miel (quercetina), fresa (kaempferina) y uvas (miricetina). Son conocidos por su capacidad de actuar como antioxidantes, capturar radicales de O2, superóxidos y radicales hidroxilos, crear complejos con los iones metálicos e inhibir la oxidación de la vitamina C en algunos alimentos. Las agliconas de dichos flavonoles parecen ser más activas que sus glicósidos (Yan-Hwa et al., 2000).

Gámez-Meza et al. (1993) estudiaron la actividad antioxidante de los compuestos fenólicos extraídos de desechos de uvas Thompson en el aceite de oliva, usando mezclas de 95:5 (v/v) etanol/agua. La actividad fue medida por dos métodos diferentes, el método Rancimat y el método de estufa en conjunto con determinación del índice de peróxido. Estos extractos fueron comparados con antioxidantes comerciales como el terbutil hidroxi quinona (TBC) y el butilhidroxianisol (BHA). Se emplearon distintas concentraciones de los extractos, y las concentraciones de 0,3 y 0,5% de fenoles totales exhibieron una actividad comparable con el TBHQ y superaron la actividad del BHA.

Carrasquero et al. (1998) evaluaron la actividad antioxidante de diferentes extractos de la semilla de pomelo en polvo, disueltos en una mezcla de aceite de soja y girasol. La oxidación se llevó acabo en un equipo AOM a temperaturas de 98,7, 75 y 65,5ºC. Los resultados indicaron el efecto antioxidante de los extractos de la semilla de pomelo a 98,7 y 75ºC, posiblemente debido a su efecto bloqueador de compuestos hidroxilos del tocoferol.

Dentro de los aceites comerciales, el aceite de soja Glycine max (L.) Merril se utiliza industrialmente para la elaboración de margarinas, aceites de mesa, mayonesa, y muchos otros productos. Este aceite contiene una alta concentración de ácido linoléico y linolénico, los cuales poseen un elevado índice de yodo, y son susceptibles a las reacciones de oxidación, que al igual que en otros aceites vegetales ocasionan pérdidas en la calidad nutricional y organoléptica. Para prevenirlo, la industria de aceites y grasas utiliza antioxidantes sintéticos, tales como el BHT y el TBHQ (Gámez-Meza et al., 1993; Badúi, 1996; García et al., 2003); sin embargo, el uso de estas sustancias en alimentos es cuestionada debido a los efectos secundarios adversos para la salud que han sido relacionados con su consumo (Hanssen y Marsden, 1986; Badúi, 1996; Martínez-Valverde et al., 2000). Ante esta situación, reviste interés la búsqueda de nuevas alternativas en productos naturales que resulten menos perjudiciales.

Dadas las características antioxidantes de los flavonoides, este estudio plantea el acondicionamiento del aceite de soja G. max (L.) Merril con extractos de flavonoides provenientes de la cáscara de naranja Citrus sinensis (L.) var. Valencia como posible sustituto de agentes antioxidantes no naturales.

Materiales y Métodos

Etapas preliminares

Se recolectó un lote de 80kg de naranjas Citrus sinensis (L.) var. Valencia mediante muestreo dirigido y utilizando los criterios establecidos por Moreno-Álvarez et al. (1999), en el parcelamiento campesino Araguita II, ubicado en el sector Agua de Obispo, municipio Montalbán, estado Carabobo, Venezuela, perteneciente a la cosecha de febrero 2002. Las muestras se trasladaron en un saco de 80kg hasta las instalaciones del Laboratorio de Biomoléculas. El aceite de soja Glicyne max (L.) Merril desodorizado fue donado por la empresa Mavesa Alimentos, ubicada en la Zona Industrial Norte, Valencia, estado Carabobo, Venezuela. La cantidad recibida fue de 20 litros, perteneciente a la producción de febrero 2002; se trasladó en un envase de plástico herméticamente cerrado y protegido de la luz, hasta el Laboratorio.

Caracterización físico-química de las materias primas

Del lote original se tomó una muestra de 30 frutas para la determinación de humedad a las cáscaras según norma COVENIN (1979). En el jugo extraído se evaluaron sólidos solubles, expresados como ºBrix, mediante refractómetro marca Baush & Lamb modelo Abbe 3L, según COVENIN (1983), acidez iónica mediante un pHmetro marca Hanna Instruments modelo pHep®, y acidez titulable según COVENIN (1977). A una muestra de 250ml de aceite de soja desodorizado y libre de antioxidantes sintéticos, se le determinó índice de peróxido, índice de yodo, índice de saponificación e índice de acidez, mediante los métodos COVENIN (1978b, 1982, 1978a y 1980, respectivamente).

Obtención de la harina integral de cáscaras de naranja

Las naranjas recolectadas se sumergieron en agua corriente y se frotaron manualmente con la finalidad de eliminar residuos de polvo y materia orgánica que pudiese estar adherida a las cáscaras. Se cortaron las naranjas con un cuchillo de acero inoxidable para luego extraer el jugo mediante un extractor manual, lo cual arrojó como residuos, en conjunto, cáscaras, membranas carpelares y semillas. Los residuos fueron dispuestos sobre mallas de acero inoxidable con aberturas de 1x1mm para garantizar el aireado total de toda la superficie de las cáscaras, y se secaron bajo luz solar hasta alcanzar una humedad de 6,65%. Los residuos parcialmente secos se sometieron a una molienda manual con un molino Modelo Corona. Se realizaron los análisis de humedad a la harina integral de cáscaras de naranja según COVENIN (1979). La harina obtenida de la molienda se procesó a través de un tamiz marca Sacro de apertura 0,25mm en un tamizador MLW, para la obtención de una harina granulométricamente uniforme. La harina integral de cáscaras de naranja fue empacada en una bolsa de polietileno color negro sellada herméticamente y posteriormente almacenada a temperatura ambiente en la oscuridad.

Obtención de los extractos de flavonoides

Para la obtención de los extractos de flavonoides se empleó la metodología descrita por Mabry et al., (1970). Se ensayaron tres extracciones con relaciones peso de harina/volumen de solvente de 1:2; 1:1,33 y 1:1, los cuales se sometieron a un proceso de separación de flavonoides basado en los principios de solubilidad diferencial con diferentes solventes orgánicos, desarrollada por Mabry et al., (1970) y modificado por Moreno-Álvarez et al. (1984, 1990). Se pesaron 5; 7,5 y 10g de harina integral de naranja por triplicado. Luego se realizaron extracciones individuales con un volumen fijo de 10ml de metanol al 85% v/v y se almacenaron por 48h en la oscuridad. Los extractos metanólicos fueron filtrados al vacío en un filtro Pirex 350 C de placa porosa y se efectuaron continuos lavados con metanol al 85% v/v utilizando un volumen de 30ml. Posteriormente, a los extractos metanólicos obtenidos se les añadió éter de petróleo concentrado en una proporción v/v de 1:1 y se sometieron a agitación en un embudo de decantación hasta la aparición de dos fases bien definidas. La fase acuosa (Ac₁) obtenida fue sometida de nuevo a extracción con acetato de etilo concentrado en una proporción v/v de 1:1 y nuevamente a agitación en un embudo de decantación hasta la aparición de dos fases igualmente bien definidas; una acuosa (Ac₂) y una orgánica (Org₂). Después de su separación se tomaron pequeñas cantidades de ambos extractos para ser evaluados individualmente por ensayos cualitativos de reconocimiento de flavonoides mediante los test de Shinoda y álcali, considerándose como positiva la aparición de un color amarillo-naranja, rojo, rojo-azulado o violeta (Domínguez, 1979). Más tarde cada uno de los extractos se concentró en un rotaevaporador a presión reducida a 60 ±1ºC hasta un secado total de los extractos. El balón de vidrio del evaporador empleado para la destilación fue pesado previamente con el propósito de definir el peso final del producto de fondo, proveniente de la destilación de los extractos.

Cada uno de los productos de fondo presentaron características de laca y coloración verde-ámbar de los cuales se obtuvieron extractos acuosos de flavonoides de las proporciones p/v de 1:2 (2,00 ±0,01g), 1:1,33 (3,80 ±0,01g) y 1:1 (3,05 ±0,01g); extractos orgánicos de flavonoides de las proporciones p/v de 1:2 (0,65 ±0,01g), 1:1,33 (1,26 ±0,01g) y 1:1 (0,65 ±0,01g). Dichas cantidades fueron resuspendidas en 100,00 ±0,01g de aceite de soya, y de estas resuspensiones se tomaron por triplicado cantidades que representaran las concentraciones de extracto de flavonoides de 0,01; 0,05 y 0,10% para la posterior evaluación de la actividad antioxidante.

Evaluación de la actividad antioxidante de los extractos

La actividad antioxidante se evalúo mediante el método Schaal (Mehlenbacher, 1979), el cual se basa en colocar muestras de aceite bajo condiciones intensivas de temperatura constante en una estufa. Se pesaron muestras de 250g de aceite de soja en vasos de precipitados de 500ml, a los cuales le fueron adicionados cantidades independientes de los extractos orgánicos y acuosos resuspendidos en aceite, empleando concentraciones de 0,01; 0,05 y 0,10% y una muestra control a la cual no le fue adicionado extracto. Todas las muestras fueron sometidas a la prueba de estabilidad a la estufa (Mermmert modelo UM400) a una temperatura constante de 60 ±1°C. Seguidamente a cada una de las muestras acondicionadas con extractos de flavonoides y al control, se les determinó el índice de peróxido por triplicado cada 24h, partiendo de un tiempo cero (0), al momento de comenzar el ensayo de la estufa, hasta que las muestras o control alcanzaran un valor de peróxido de 100,00meq O₂/kg. Los resultados obtenidos son promedios de tres repeticiones ±ds.

Análisis estadístico

El diseño estadístico empleado fue de bloques al azar, donde los bloques (filas) representan las tres proporciones p/v de 1:2; 1:1,33 y 1:1 (relación harina/solvente) obtenidos de las cáscaras de naranja y los tratamientos (columnas) están representados por las concentraciones de extractos de flavonoides, de 0,01, 0,05 y 0,10% en el aceite de soja, con tres repeticiones. Se utilizó un modelo lineal aditivo para un diseño de bloques al azar gijk= µ + ti + bj + eijk; para determinar diferencias significativas entre los tratamientos se aplicó la prueba de comparación de medias (Sheffe, P<0,05; SAS, 1992).

Resultados y Discusión

Caracterización físico-química de las materias primas

En la Tabla I se presentan los resultados de la caracterización fisicoquímica del jugo, cáscaras (desechos) y la harina integral obtenida a partir de la molienda de las cáscaras, membranas carpelares y semillas de naranjas. El índice de madurez obtenido mediante la relación ºBrix/índice de acidez fue de 19,5 que es mayor al de 13,8 reportado en esta misma variedad por Moreno-Álvarez et al. (1999). Un valor tan alto de índice de madurez representa un grado óptimo de maduración, así como también una adecuada relación del contenido de pigmentos fenólicos presentes en las cáscaras. Las muestras fueron seleccionadas sin rastro aparente de clorofila ya que estos metabolitos son característicos de los frutos inmaduros (Badúi, 1996). El valor de humedad inicial de la cáscara de 65,50% es similar al obtenido por Moreno-Álvarez et al. (1999).

Los resultados de la caracterización físico-química del aceite de soja desodorizado se presentan en la Tabla II. Los valores obtenidos están comprendidos dentro de las especificaciones señalados por el Codex Alimentarius (1981) en lo que respecta al estándar de las características esenciales de identidad para este tipo de aceite. En términos generales, el índice de yodo obtenido permite inferir un alto grado de insaturaciones. En cuanto a los valores de acidez y peróxido, éstos reflejan una buena calidad del aceite y un bajo grado de rancidez o deterioro.

Obtención de los extractos de flavonoides

Como producto del proceso de separación de flavonoides se obtuvo un extracto acuoso y otro orgánico, ambos de naturaleza polar, los cuales fueron confirmados positivamente mediante las pruebas de Shinoda y alcali. La elección de experimentar con ambos extractos fue sustentada por el hecho previamente determinado de que estas fracciones contienen los flavonoides más polares y estructuras glucosídicas (Mabry et al., 1970 y Moreno-Álvarez et al. 1990; Borges et al., 2001) que pueden producir cambios en los potenciales de oxido-reducción o quelación de ciertos minerales esenciales presentes en el medio, además de ser los compuestos con mejor potencial antioxidante. En tal sentido se presume que en el extracto acuoso están presentes compuestos altamente hidroxilados como diglicósidos, triglicosidos y flavonoides sulfatados, y en el extracto orgánico compuestos poco hidroxilados como monoglicósidos, flavonoides sulfatados y cumarinas. Marcano y Hasegawa (1991) señalaron que las agliconas de los flavonoides altamente hidroxiladas son solubles en alcohol (etanol, metanol y n-butanol), mientras que las poco hidroxiladas lo son en solventes como éter etílico, acetato de etilo y acetona.

En estudio de Bocco et al. (1998) fueron identificados los compuestos fenólicos presentes en los extractos metanólicos de cítricos, obteniendo dos clases principales de compuestos: flavononas y flavonas, siendo las flavononas las más abundantes, presentándose usualmente como digliconas; de estas se encontraron tres pares de compuestos en su forma glicoxilada: la hespiridina, naringina y eriocitrina; y en un segundo grupo de glicósidos o azúcares como la neohespiridosa y rutinosa. De las flavonas se presentaron dos grupos, uno formado por flavonas glicoxiladas (luteolina; apigenina y diosmina) y otro constituido por flavonas polimetoxiladas, siendo reportadas como las menos polares.

Martínez-Valverde et al. (2000) estudiaron sistemas lipofílicos para determinar los criterios estructurales de los flavonoides que determinen la estabilidad de las dispersiones de ácidos grasos, lípidos y aceites frente a la oxidación, y han descrito el modo específico de cómo estos compuestos fenólicos pueden inhibir la oxidación, dándose en tres formas diferentes: quelando ciertos minerales como el Cu a través de la estructura orto-dihidroxifenílica, capturando radicales alcoxi y peroxi, al actuar como donantes de H y regenerando el a-tocoferol mediante la reducción del radical a-tocoferoxyl. Los radicales peroxyl formados mediante la reacción de un antioxidante fenólico con un radical lipídico son estabilizados mediante la localización de electrones desapareados alrededor del anillo aromático, el cual le confiere alta estabilidad química.

Evaluación de la actividad antioxidante de los extractos de flavonoides

En la Tabla III se presenta la evaluación del índice de peróxido para las muestras de aceite de soja desodorizado acondicionado con extractos obtenidos de la cáscara de naranja. En general, la actividad antioxidante de los extractos fue determinada por el incremento del índice de peróxido en el tiempo, siendo comparados a un control sin antioxidantes. Se evidenciaron diferencias significativas entre los tratamientos (P<0,05), determinándose que los extractos acuosos al 0,10%, independientemente de la relación harina/solvente, presentaron los menores valores de peróxido al finalizar el ensayo. Esta misma tendencia se observó en la proporción de 1:1,33 del extracto orgánico a la concentración de 0,10%.

Para la representación gráfica de los valores de peróxido en el tiempo de los extractos evaluados se realizó un ajuste exponencial de las medias tabuladas y se graficaron los valores obtenidos para los extractos acuosos que presentaron mayor actividad antioxidante. En la Figura 1a se presenta la variación del índice de peróxido en función del tiempo para el aceite de soja desodorizado acondicionado con extractos acuosos de flavonoides a concentraciones de 0,01; 0,05 y 0,10% obtenidos de la proporción p/v de 1:1 (harina/solvente) y el control. En la figura se incluye también los modelos matemáticos propuestos que describen el comportamiento de cada una de las curvas.

Se evidencia una conducta similar del control y las tres curvas que representan las concentraciones de extractos de flavonoides hasta las 132h. A partir de las 144h se observa un comportamiento individual con tendencia al incremento del peróxido. Entre las 144 y 168h la curva de la concentración del 0,01% (1) sobrepasó a la del control (2); se infiere entonces que a la concentración del 0,01% los compuestos fenólicos presentes actuaron como pro-oxidantes, efecto que usualmente se produce cuando las concentraciones de los compuestos son muy bajas, por lo que su acción antioxidante es limitada, o muy elevada, y su interacción con el O² es prolongada, incrementando productos de oxidación y favoreciendo la formación de peróxidos (Baduy, 1996).

A las 168h se aprecia igualmente que las curvas 3 y 4, que representan las concentraciones del 0,05 y 0,10% respectivamente, comenzaron a presentar una conducta desigual entre ellas, observándose una diferencia marcada a medida que transcurría el tiempo, donde la curva 3 tuvo un acercamiento a la curva del control, mientras que la curva 4 tendió a alejarse de la curva control. A las 264h, tiempo final de ensayo, las curvas que representan al control y a las concentraciones de extracto de flavonoides de 0,01 y 0,05%, (curvas 1, 2 y 3) sobrepasaron los 100meq O₂/kg, valor máximo establecido para el ensayo (Badúi, 1996), mientras que la curva que representa al 0,10% de flavonoides (4) aun no había alcanzado este valor de peróxido. Estudios previos han demostrado que la actividad antioxidante de estos flavonoides esta asociada a su estructura química, destacándose la presencia de la configuración 3'-4'-ortodihidroxy en el anillo B o la presencia del grupo 4-carbonilo en el anillo C (Martínez-Valverde et al., 2000). Además, esta actividad antioxidante de los extractos de flavonoides pudo haberse incrementado debido a que al haber una mayor cantidad de harina integral de cáscaras de naranja diluido en el solvente, hay una mayor obtención de compuestos fenólicos polares en los extractos acuosos finales (Padrón y Moreno Álvarez, 1996). Otros investigadores han descrito la influencia de la concentración, la composición polar de las mezclas y el papel sinergístico de algunos flavonoides minoritarios que influyen en la actividad antioxidante (Benavente-García et al., 1997). En los presentes resultados se evidenció que cada una de las concentraciones presentaron diferencias significativas en el tiempo (P<0,05) lo que indica la existencia de un proceso oxidativo del aceite. Realizada la comparación de medias (Sheffe P<0,05) se determinó que determinadas concentraciones presentaron mayor grado de oxidación en el tiempo, lo que evidencia que la cinética de oxidación fue mas lenta para unas concentraciones de extracto de flavonoides que para otras.

En la Figura 1b se observa un comportamiento exponencial para las diferentes concentraciones de extracto acuoso de flavonoides y el control en la proporción 1:2 y se incluyen las ecuaciones correspondientes. Los índices de peróxido determinados a cada una de las concentraciones, muestran una conducta similar hasta las 48h; a partir de este tiempo en adelante se denota un comportamiento individual. El control (curva 2) presentó un proceso de oxidación más acelerado hasta que, a las 204h, la concentración del 0,01% (curva 1) sobrepasó al control. De acuerdo con este comportamiento se puede inferir que los flavonoides presentes en este extracto actuaron como pro-oxidantes, siendo éste un tipo de acción que se produce cuando las concentraciones de los antioxidantes son insuficientes en el medio oxidante en el que se encuentren (Badúi, 1996).

Al comparar las gráficas del efecto del extracto acuoso de las proporciones 1:1 y 1:2 (Figuras 1a y b) se observa que una vez finalizado el tiempo de ensayo (264h) las concentraciones de extracto de flavonoides al 0,05 y 0,10% actuaron como antioxidantes, siendo la concentración de 0,05% la que demostró un proceso de oxidación más acelerado entre ellas, encontrándose más próxima al control, mientras que la concentración de 0,10% presentó los valores más bajos de peróxido.

En la Figura 1c se muestran las curvas obtenidas con extracto acuoso en proporción 1:1.33. En este caso se evidencia un comportamiento similar para las tres concentraciones hasta las 168h, y un comportamiento antioxidante muy reducido si se comparan con la curva del control (curva 1). Al 0,05% (curva 4) hubo mayor efecto antioxidante en comparación al 0,01 y 0,10%. De estos resultados se deduce que a concentraciones intermedias, tales compuestos presentan características antioxidantes independientes de las proporciones de harina/solvente. A las 264h, las curvas 1 y 2 (control y 0,01%) sobrepasan 100meq O₂/kg. En cambio para 0,05 y 0,10% los valores de peróxido fueron inferiores a los 100meqO₂/kg.

En el caso de los extractos orgánicos preparados a distintas proporciones (relación harina/solvente de 1:2; 1:1,33 y 1:1 p/v), la variación del índice de peróxido en el tiempo, independientemente de la concentración, mostró actividad pro-oxidante (Tabla III). Ésta no se observó en la concentración 0,10% para la relación 1:1,33 harina/solvente, en la cual se evidencia actividad antioxidante.

Conclusiones

Los extractos acuosos a una concentración 0,10% independientemente de la relación harina/solvente presentaron la mayor capacidad antioxidante a las 264h. Los extractos orgánicos presentaron actividad pro-oxidante independientemente de la relación harina/solvente, a excepción del extracto orgánico al 0,10% en la relación harina solvente 1:1,33. Se concluye que las cáscaras de naranjas pueden ser utilizadas como materia prima en la obtención de extractos químicos naturales de naturaleza antioxidante, y que pueden ser utilizados por la industria aceitera nacional por la sustitución de los antioxidantes artificiales, que en algunos de los casos no son beneficiosos para la salud del consumidor. Por otro lado, permitirá aumentar el valor agregado a un desperdicio logrando el aprovechamiento integral de este rubro. Los resultados obtenidos en este estudio indican que los fla-vonoides presentes en las cáscaras de naranja Valencia pueden ser utilizados como extractos crudos sin necesidad de purificaciones parciales o totales, para conseguir aumentar la vida útil del aceite de soja.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue financiada por el Programa Proyecto Emergentes Pem-2001002271 de FONACIT-UNESR. La empresa Mavesa Alimentos donó el aceite de soja utilizado en esta investigación.

Referencias

1. Albornoz A (1980) Productos naturales, sustancias y drogas extraídas de las plantas. Facultad de Ciencias. Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela. 616 pp.        [ Links ]

2. Badúi S (1996) Química de los alimentos. 3ª ed. Logman-Alhambra. México DF, México. 645 pp.        [ Links ]

3. Benavente-García O, Castillo, O, Marín J, Ortuño A, Del Río J (1977) Uses and properties of citrus flavonoids. J. Agric. Food Chem. 45: 4505-4512.        [ Links ]

4. Bocco A, Cuvelier M, Richard H, Berset C (1998) Antioxidant activity and phenolic composition of citrus peel and seed extracts. J. Agric. Food Chem. 46: 2123-2129.        [ Links ]

5. Borges N, Moreno-Alvarez MJ, Oyón R, Hernández J (2001) Exploración preliminar de flavonoides foliares en Tithonia diversifolia (Hemsl.) Gray (Compositae) y su evaluación antimicrobiana. Rev. Unellez Cienc. Tecnol. 19: 64-72.        [ Links ]

6.Castro R, Suárez L (2002) Recuperación de colorantes a partir de desechos agroindustriales de naranja (Citrus sinensis L.) Variedad Valencia, a nivel piloto. Tesis. Universidad Simón Rodríguez. Canoabo, Venezuela. 92 pp.        [ Links ]

7. Carrasquero A, Salazar M, Navas PB (1998) Antioxidant Activity of grapefruit seed extracts in vegetable oils. J. Sci. Food Agric. 77: 463-467.        [ Links ]

8. Cerezal P, Marrero T, Piñera RM (1994) Fuentes de carotenoides a partir de residuos de naranja. Estudio preliminar. Memorias IV Conferencia Internacional sobre Ciencia y Tecnología de los Alimentos. La Habana, Cuba. p. 28.        [ Links ]

9. Cerezal P, Piñera R (1996) Carotenoids in Citrus fruit: general aspects, abstention from processing wastes and applications. Alimentaria (España) 277: 19-32.        [ Links ]

10. Codex Alimentarius (1981) Norma para el Aceite de Soja Comestible. Codex Stan 10-1981. 9 p.        [ Links ]

11. COVENIN (1977) Norma 1151. Alimentos para Animales. Determinación de Acidez Titulable e Iónica. Comisión Venezolana de Normas Industriales. Caracas, Venezuela. 7 pp.        [ Links ]

12. COVENIN (1978a) Norma 323. Aceites y Grasa Vegetales. Determinación de Índice de Saponificación. Comisión Venezolana de Normas Industriales. Caracas, Venezuela. 4 pp.        [ Links ]

13. COVENIN (1978b) Norma 508. Aceites y Grasa Vegetales. Determinación de Índice de Peróxidos. Comisión Venezolana de Normas Industriales. Caracas, Venezuela. 4 pp.        [ Links ]

14. COVENIN (1979) Norma 1156. Alimentos para animales y Determinación de Humedad. Comisión Venezolana de Normas Industriales. Caracas, Venezuela. 6 pp.        [ Links ]

15. COVENIN (1980) Norma 325. Aceites y Grasa Vegetales. Determinación de Índice de la Acidez. Comisión Venezolana de Normas Industriales. Caracas, Venezuela. 4 pp.        [ Links ]

16. COVENIN (1982) Norma 324. Aceites y Grasa Vegetales. Determinación de Índice de Iodo por el Método de Wijs. Comisión Venezolana de Normas Industriales. Caracas, Venezuela. 7 pp.        [ Links ]

17. COVENIN (1983) Norma 924. Frutas y Productos Derivados. Determinación de Sólidos Solubles por Refractometría. Comisión Venezolana de Normas Industriales. Caracas, Venezuela. 14 pp.        [ Links ]

18. Domínguez X (1979) Métodos de investigación fotoquímica. Limusa. Mexico. pp 81-90.        [ Links ]

19. Gámez-Meza M, Noriega-Rodríguez J, Medina-Juárez P, Ortega-García V, Cázares-Casanova S, Angulo-Guerrero M (1993) Antioxidant activity in soybean oil of extracts from Thompson grape bagasse. JAOCS 70: 483-487.        [ Links ]

20. García D, Viloria-Matos A, Belén DR, Moreno-Álvarez MJ (2003) Características físico-químicas y composición de ácidos grasos del aceite crudo extraído de residuos de mora (Rubus glaucus Benth). Grasas y aceites (España) 54: 259-263.        [ Links ]

21. Hannsen M, Marsden J (1986) E para aditivos: guía completa de números E. Edaf. Madrid, España. 226 pp.        [ Links ]

22. Harborne JB, Williams C (2000) The Flavonoids, Advances in Research since 1992. Phytochem. 55: 481-504.        [ Links ]

23. Henríquez M (1995) Análisis de algunos componentes en el mercado de la naranja (Citrus sinensis L.). Trabajo de Ascenso. Universidad Simón Rodríguez. Canoabo, Venezuela. 94 pp.        [ Links ]

24. Kale PN, Adsule PG (1995) Citrus. En Salunkhe DK, Kadam, SS (Eds.) Handbook of Fruits Science and Technology; Production, Composition, Storage and Processing. Dekker. Nueva York, EEUU. pp. 39-65.        [ Links ]

25. Mabry T, Markham K, Thomas B (1970) The systematic identification on flavonoids. Springer. Nueva York, EEUU. 354 pp.        [ Links ]

26. Marcano D, Hasegawa M (1991) Fitoquímica orgánica. Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela. 451 pp.        [ Links ]

27. Markham K (1982) Techniques of flavonoids identification. Academic Press. Nueva York, EEUU. pp 2-39.        [ Links ]

28. Martínez-Valverde I, Periago MJ, Ríos G (2000) Significado nutricional de los compuestos fenólicos de la dieta. Arch. Latin. Nutric. 50: 5-18.        [ Links ]

29. Mehlenbacher VC (1979) Análisis de grasas y aceites. URMO. Bilbao, España. 213 pp.        [ Links ]

30. Moreno-Álvarez MJ, Hurtado J, Silva JF, Fariñas MR (1984) Evidencias químicas poblacionales de Espeletia schultzii Wedd (Compositae) basado en sus flavonoides. VII Congreso Venezolano de Botánica. Caracas, Venezuela. p. 23.        [ Links ]

31. Moreno-Álvarez MJ, Hurtado J, Silva JF, Fariñas MR, Azócar A (1990) Algunas evidencias poblacionales de formación de híbridos entre Espeletia batata Cuatr. y E. schultzii Wedd en el altiandino venezolano. Ecotrópicos 3: 57-66.        [ Links ]

32. Moreno-Álvarez MJ, Gómez C, Mendoza J, Belén D (1994) Determinación de carotenoides totales en desechos industriales de cáscara de naranja Citrus sinensis var. Valencia en el Occidente de Carabobo, Venezuela. Memorias IV Conferencia Internacional sobre Ciencia y Tecnología de los Alimentos. La Habana, Cuba p. 39.        [ Links ]

33. Moreno-Álvarez, MJ, Gómez C, Mendoza J, Belén D (1999) Carotenoides totales en cáscara de naranja Citrus sinensis L. var. Valencia. Rev. Unellez Cien Tec.17: 92-99.        [ Links ]

34. Padrón C, Moreno-Álvarez MJ (1999) Extracción de colorantes en la cáscara de naranja (Citrus sinensisi L. var. Valencia) por métodos no convencionales y su utilización para fortificar color en naranjadas. Rev. Unellez. Cien Tec.17: 125-140.        [ Links ]

35. SAS (1992) User’s guide. SAS Statgraphics. Version 6.0. Statistical Analysis System Institute. Cary, NC, EEUU. 99 pp.        [ Links ]

36. Yan-Hwa C, Hsia-Fen H, Chao-Lin C (2000) Flavonoids content of several vegetables and their antioxidant activity. J. Sci. Food Agric. 80: 561-566.        [ Links ]