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versión impresa ISSN 0378-1844
INCI v.29 n.10 Caracas oct. 2004
Estrés oxidativo como posible causante de retinopatía en ratas en desarrollo sometidas a hiperoxia
Luz Marina Rojas, Sor Marilú Suárez, Mairín Lemus, Katiuska Benítez, Yleana Ramírez, Makerys Mitchell y Alpidio Boada-Sucre
Luz Marina Rojas. M.Sc. en Microscopía Electrónica Aplicada a las Ciencias Biomédicas, Universidad de Oriente (UDO), Venezuela. Ph.D. en Ciencias Biológicas, Universidad de Montreal, Canada. Profesora, Instituto de Investigaciones en Biomedicina y Ciencias Aplicadas (IIBCA-UDO), Venezuela. Dirección: Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre, IIBCA-UDO, Cerro del Medio, Cumaná, C.P. 6101. Edo. Sucre, Venezuela. e-mail: lmarinarojas@hotmail.com
Sor Marilú Suárez Jiménez. Licenciada en Bioanálisis, UDO, Venezuela. Pasante, IIBCA-UDO, Venezuela.
Mairín Lemus. M.Sc. En Contaminación Ambiental, UDO, Venezuela. Ph.D. en Ciencias Biológicas, Universidad Simón Bolívar, Venezuela. Profesora, Escuela de Ciencias, UDO, Venezuela. e-mail: mlemus@sucre.udo.edu.ve
Katiuska José Benítez Espinoza. Licenciada en Bioanálisis, UDO, Venezuela. Pasante, IIBCA-UDO, Venezuela.
Yleana María Ramírez Figueroa. Licenciada en Biología, UDO, Venezuela. Pasante, IIBCA-UDO, Venezuela. e-mail: yleana@cantv.net
Makerys Adriana Mitchel Cabello. Licenciada en Biología, UDO, Venezuela. Profesora, UDO, Núcleo Anzoátegui, Venezuela. e-mail: makerys@cantv.net
Alpidio A. Boada-Sucre. Licenciado en Biología, UDO, Venezuela. Profesor, Universidad Simón Rodríguez, Venezuela. Estudiante de Doctorado, Universidad Central de Venezuela. e-mail: alboada@hotmail.com
Resumen
Se evaluó el efecto del estrés oxidativo sobre la citoarquitectura retiniana y coroidal y se analizó los niveles de glutatión reducido (GSH) en eritrocitos de ratas sometidas a hiperoxia (80 ±1% O2). Grupos de éstas fueron oxigenados desde el día de su nacimiento (0) hasta el día 6, 9, 12 o 14 de vida, y otras se colocaron en normoxia (controles). En cada uno de estos períodos se determinó la concentración del GSH. La histología de la retina y la coroides se realizó en ratas de 30 días. Las concentraciones de GSH en ratas oxigenadas de 0-6 y 0-9 días, fueron significativamente más bajas que en los controles. No obstante, en los grupos de 0-12 y 0-14 días de hiperoxia mostraron valores similares a los controles, posiblemente como un proceso adaptativo. En la retina y coroides de ratas expuestas de 0-9, 0-12 y 0-14 días, se evidenciaron procesos de vasoconstricción en capilares retinianos y coroideos, así como debilitamiento de las uniones estrechas de los endotelios capilares coroideos, conduciendo a hemorragia. La retina de las ratas sometidas a hiperoxia de 0-12 días, presentó células horizontales vacuolizadas, con mitocondrias alteradas y las envolturas nucleares dilatadas. Estos resultados evidencian los severos daños estructurales que sufren la retina y la coroides cuando son sometidas a altos niveles de hiperoxia.
Summary
The effect of oxidative stress on retinal and choroidal cytoarchitecture was evaluated, and the levels of reduced glutathione (GSH) analyzed, in rats subjected to hyperoxygenation (80 ±1% O2). Groups of rats were oxygenated from birth (day 0) to days 6, 9, 12 or 14 of life, while others were kept under normal O2 (controls). GSH blood concentration was determined in each period. Retinal and choroidal histology was studied in 30 day-old rats. GSH concentration was significantly lower in rats oxygenated on days 0-6 and 0-9 than in controls. However, rats kept under high O2 on days 0-12 and 0-14 showed similar values to the controls, possibly due to an adaptive process. In the retina and choroid of rats exposed to O2 on days 0-9, 0-12 and 0-14, capillary vasoconstriction was observed, as well as tight junction weakening in choroidal capillaries leading to hemorrhage. The retina from rats subjected to hyperoxigenation from 0-12 days showed vacuolized horizontal cells with damaged mitochondria and swollen nuclear envelopes. The results show severe structural damage in the retina and choroid when animals are subjected to high O2 levels.
Resumo
Avaliou-se o efeito do estresse oxidativo sobre a citoarquitetura retiniana e coroidal e analisou-se os níveis de glutation reduzido (GSH) em eritrócitos de ratos submetidos a hiperóxia (80 ±1% O2). Grupos destas foram oxigenados desde o dia do seu nascimento (0) até o dia 6, 9, 12 o 14 de vida, e outras se colocaram em normoxia (controles). Em cada um de estes períodos se determinou a concentração do GSH. A histologia da retina e a coróides se realizou em ratos de 30 dias. As concentrações de GSH em ratos oxigenados de 0-6 e 0-9 dias, foram significativamente mais baixas que nos controles. No entanto, nos grupos de 0-12 e 0-14 dias de hiperóxia mostraram valores similares aos controles, possivelmente como um processo adaptativo. Na retina e coróides de ratos expostos de 0-9, 0-12 e 0-14 dias, se evidenciaram processos de vasoconstrição capilar, assim como debilitação das uniões estreitas dos endotélios capilares coróides, conduzindo a hemorragia. A retina dos ratos submetidos a hiperóxia de 0-12 dias, apresentou células horizontais vacuolizadas, com mitocôndrias alteradas e as envolturas nucleares dilatadas. Os resultados evidenciam os severos danos estruturais que sofrem a retina e a coróides quando os animais são submetidas a altos níveis de oxigenação.
PALABRAS CLAVE / Estrés Oxidativo / Glutatión Reducido / Hiperoxia / Retinopatía /
Recibido: 01/11/2003. Modificado: 31/03/2004. Aceptado: 19/08/2004.
El desarrollo de la red sanguínea del ojo comienza desde la parte central-posterior hacia la periferia y culmina justo antes de nacer el niño (Ben-Sira et al., 1988). Cuando el niño nace prematuro, la retina no ha completado aún su desarrollo y la periferia del ojo carece de vasos sanguíneos. Por razones desconocidas, una vez que el feto es sacado del vientre de la madre y sometido a regímenes de cuidados intensivos, la red sanguínea del ojo detiene su crecimiento y se produce la Retinopatía del Prematuro (ROP; Silverman y Flynn, 1985).
La ROP es una retinopatía proliferativa inducida por isquemia que afecta niños prematuros de bajo peso (Mechoulam y Pierce, 2003). La ROP se inicia con un retardo en el crecimiento vascular retiniano después del nacimiento del prematuro (Smith, 2002) y se caracteriza por dilatación, proliferación y tortuosidad vascular, edema y desprendimiento retiniano, y conversión definitiva de la retina en una masa fibrosa que puede verse como una densa membrana retrolental; habitualmente, el crecimiento del ojo se detiene y puede traer como consecuencia microftalmia y sobrevenir ceguera (Dorland, 1997).
El nivel de antioxidantes en la retina inmadura es relativamente bajo, por lo que los radicales libres de O2 se acumulan en la retina de niños pretérminos y pueden jugar un papel importante en la patogénesis de la ROP (Papp et al., 1999; Keys y Zimmerman, 1999).
Los radicales libres son especies que contienen un número impar de electrones, volviéndose estos químicamente reactivos (Ashton, 1966; Riley y Slater, 1969; Slater y Riley, 1970). Dañan el ADN mitocondrial y también atacan a las proteínas, transformándolas y destruyendo las membranas celulares (Collins, 1996). La formación de radicales libres está probablemente influenciada tanto por altos niveles de O2 arterial, como por la presión parcial de CO2, pH, luz brillante y la baja disponibilidad de varios antioxidantes en la retina inmadura (Ben-Sira et al., 1988).
En la retinopatía inducida por el O2 (OIR), la hipoxia relativa que tiene lugar después de los eventos hiperóxicos podría inducir la formación desorganizada de nuevos vasos sanguíneos (neovascularización), que son el origen de las consecuencias más severas de estos desórdenes retinianos (Alon et al., 1995; Nomura et al., 1995; Héber et al., 1996; Lutty y McLeod, 2003; Zhang et al., 2003).
En la ROP, la exposición de los vasos sanguíneos retinianos a altos niveles de O2 parece conducir al cese de su crecimiento. Se ha postulado que el estado indiferenciado de los vasos producidos, incluyendo la inadecuada capacidad para barrer los bioproductos tóxicos de O2, los vuelve a ellos mismos vulnerables a la hiperoxia (D'Amore, 1994; Lutty y McLeod, 2003).
Existe una alta similitud entre las células de la retina humana y los glóbulos rojos en lo que respecta a la estructura de su membrana (cadenas muy largas de ácidos grasos poliinsaturados, susceptibles a la oxidación), su metabolismo (alta demanda de glucosa y O2) y sus mecanismos antioxidantes (Puertas et al., 1993; De La Paz et al., 1996). Los glóbulos rojos, aunque están expuestos frecuentemente a un estado de estrés oxidativo intracelular, se encuentran bien equipados para manejar esta condición, a través de las actividades combinadas de las enzimas superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y el sistema de defensa dependiente del glutatión, por lo que son capaces de protegerse ellos mismos contra los productos derivados del O2 (Srivastava y Beutler, 1968; Stern, 1985; Winterbourn y Stern, 1987). Por consiguiente, el estado oxidativo de los glóbulos rojos puede ser usado como un índice biológico del daño oxidativo retiniano (Prashar et al., 1993; Thornalley et al., 1996).
Estudios in vivo e in vitro han demostrado que los eritrocitos de animales adultos pueden proteger otros tejidos contra el daño inducido por las especies reactivas de O2. La acción de la CAT y el sistema de reciclaje del glutatión son considerados el factor clave de este mecanismo protectivo (Heffner y Repine, 1989).
Papp et al. (1999) realizaron un estudio con 50 pacientes de diferentes edades (6 semanas a 6 años) que padecían de ROP para determinar el estado del glutatión en los glóbulos rojos de dichos pacientes, y observaron una caída del glutatión reducido (GSH) junto con un aumento del glutatión oxidado (GSSG), dando así una alta relación GSSG/GSH. Ello les permitió señalar que dicha relación constituye un parámetro confiable de estrés oxidativo importante en estos pacientes. Según Keys y Zimmerman (1999), el GSH protege los ácidos grasos poliinsaturados de los segmentos externos de los bastones contra la peroxidación lipídica.
El glutatión es el antioxidante intracelular más importante; se encuentra presente principalmente en forma reducida (GSH) y a una concentración mucho más baja en su forma oxidada (GSSG; Srivastava y Beutler, 1968). En condiciones normales existe una alta proporción GSH/GSSG, necesaria para una protección celular efectiva (Cadenas y Davies, 2000). El agotamiento del GSH conduce a muerte celular y ha sido documentado en muchas condiciones degenerativas; su estado intracelular parece ser un indicador sensible de la salud general de las células y de su habilidad para resistir las demandas tóxicas (Parris, 1997).
Trabajos recientes (Lachapelle et al., 1999; Dembinska et al., 2001; 2002; Benítez, 2003; Suárez, 2004) han demostrado que las ratas Sprague-Dawley recién nacidas, expuestas durante los primeros 14 días de vida a un ambiente hiperóxico desarrollan anomalías retinianas. A nivel estructural estas anomalías se manifiestan como una disminución del grosor de la capa plexiforme externa (CPE) y del número de células horizontales (NCH), y a nivel funcional como una disminución de la amplitud de la onda b del electroretinograma (ERG) bajo condiciones escotópicas (ausencia de luz) y fotópicas (presencia de luz). Dembinska et al. (2001), demostraron que existe una correlación entre la duración de la exposición al O2 y la disminución en la amplitud del ERG escotópico, así como en el decrecimiento del grosor de la CPE y el NCH. Dichos autores señalan que la severidad de los daños depende en gran parte del estado de madurez de la retina al momento de comenzar la hiperoxia y demuestran que el daño es mayor si la hiperoxia comienza la segunda semana de vida de la rata que si transcurre durante la primera semana.
Benítez (2003) y Suárez (2004), utilizando un modelo experimental muy similar al de Dembinska et al. (2001; 2002), encontraron resultados análogos a los de este grupo en lo que respecta a una disminución dependiente del O2 en la amplitud de la onda b del ERG escotópico, el grosor de la CPE y del NCH.
Tomando en cuenta que la concentración de GSH en sangre es un índice apropiado de toxicidad por O2 en situaciones donde los prematuros son sometidos a altas concentraciones de este gas, este estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto del estrés oxidativo sobre la ultraestructura retiniana y su relación a los niveles de GSH en sangre de ratas Sprague-Dawley en desarrollo sometidas a hiperoxia.
Materiales y Métodos
Para este estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley procedentes del Bioterio del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).
Inducción de la retinopatía causada por hiperoxia
Las ratas recién nacidas fueron colocadas en incubadoras. Desde el día de su nacimiento, las ratas fueron expuestas diariamente a hiperoxia (80 ±1% O2) con tres interrupciones de 30 min al día, con 21% O2, según el protocolo sugerido por Lachapelle et al. (1999). El nivel de O2 en la incubadora fue mantenido a 80 ±1% utilizando un analizador de O2 (7820 O2 Monitoring System) el cual fue conectado a la incubadora y calibrado diariamente.
Los ejemplares tratados fueron sometidos a diferentes regímenes de hiperoxia, desde el día de su nacimiento al día 6, 9, 12 y 14 de vida, es decir, en los días 0-6, 0-9, 0-12 y 0-14. Después de cada uno de estos períodos de hiperoxigenación, algunas ratas fueron sacrificadas para la realización de los análisis bioquímicos y otras se mantuvieron en un ambiente normóxico (21% O2) hasta los 30 días de edad, para el estudio histológico. Para evitar las complicaciones pulmonares que con frecuencia son reportadas en las ratas adultas expuestas a la hiperoxia (Lachapelle et al., 1999), las madres fueron alternadas cada día con las madres de los individuos controles. De esta manera, estos controles, los cuales estaban en un ambiente normóxico, recibían madres de las ratas expuestas al O2.
Determinación de la concentración de glutatión reducido (GSH)
Se estudiaron cinco animales por cada régimen de hiperoxia. La determinación de la concentración de GSH fue llevada a cabo de acuerdo a la técnica de Beutler et al. (1963), para lo cual se prepararon 2 soluciones:
a) Solución precipitante: 1,67g de ácido metafosfórico glacial (mezcla de HPO3 y NaPO3); 0,2g de EDTA y 30g de NaCl en 100ml de agua destilada.
b) Reactivo DTNB: 5,5' dithiobis (2-ácido nitrobenzoico) al 0,4% en buffer fosfato, pH 7,5.
Se mezclaron 0,2ml de sangre con 1,8ml de agua destilada, se adicionó 3ml de solución precipitante, se dejó en reposo por un tiempo de 5min y se filtró. Posteriormente a 2ml del filtrado se le añadió 8ml de buffer fosfato y 1ml del reactivo DTNB, y se midieron inmediatamente en el espectrofotómetro. Se preparó un blanco de reactivo con 8ml de buffer fosfato, 2ml de la solución precipitante diluida (2 a 3 partes de agua destilada) y 1ml del reactivo DTNB. La densidad óptica fue medida a 412nm en un espectrofotómetro. La estandarización del método se realizó con glutatión (GSH; Sigma).
Histología de la retina y la coroides
Para los estudios histológicos se utilizaron cuatro animales por cada régimen de hiperoxia. Inmediatamente después del sacrificio, por inhalación de gases de cloroformo, se colocó un punto de sutura en la parte nasal del ojo. El ojo fue enucleado y fijado completo durante 1h en glutaraldehido 3%, en tampón fosfato 0,1mol a pH 7,4. Luego se hizo una incisión a nivel de la ora serrata y la retina, aún inmersa en glutaraldehído y pegada a la coroides, fue seccionada, seleccionándose para este estudio el sector central. Las muestras de retina fueron embebidas en Epón de acuerdo a la técnica reportada por Rojas et al. (1997). Para el análisis ultraestructural, se hicieron cortes finos de 70nm que fueron contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo.
Análisis de datos
Los resultados de los análisis bioquímicos fueron estudiados mediante un ANOVA simple; aplicándose la prueba de Duncan a posteriori. Los datos fueron presentados como la media ±error estándar.
Resultados
Estrés oxidativo
Los resultados de la concentración de GSH en glóbulos rojos de ratas controles y sometidas a diferentes períodos de hiperoxia post-natal, se muestran en la Figura 1. La concentración de GSH en las ratas sometidas de 0-6 y de 0-9 días de hiperoxia fue visiblemente inferior a la del control. El análisis de varianza aplicado a estos resultados mostró diferencias altamente significativas (P<0,001) entre el grupo control y los grupos de ratas sometidas a 6 y 9 días de hiperoxia.
Aunque la concentración promedio del GSH en las ratas expuestas a hiperoxia de 0-12 días fue ligeramente menor (Figura 1), ésta no mostró diferencias significativas en comparación con el grupo control (P>0,05). Por el contrario, las ratas sometidas a hiperoxia de 0-14 días presentaron valores superiores al control. El análisis de varianza aplicado a estos resultados indica que existen diferencias significativas entre el grupo control y los oxigenados de 0-14 días (P<0,05).
De manera general, se puede apreciar un aumento directamente proporcional de los niveles de la concentración de GSH entre los distintos grupos de ratas que fueron expuestos a los diferentes períodos de hiperoxia. Al comparar estos valores de GSH en los grupos de ratas sometidas a los diferentes regímenes de hiperoxia, se pudo observar diferencias altamente significativas (P<0,001) entre ellos. La prueba a posteriori Duncan aplicada a estos resultados, indica que los niveles más bajos de GSH fueron observados entre el grupo de ratas sometidas a hiperoxia de 0-6 y 0-9 días de vida, mientras que los niveles más elevados se observaron a los 14 días.
Histopatología retiniana y coroidal
Las células horizontales (CH) se encuentran en la parte externa de la capa nuclear interna (CNI), próximas a la capa plexiforme externa (CPE) y en muchas ocasiones se notaron asociadas a capilares (Figura 2a).
En la retina de las ratas sometidas a hiperoxia de 0-12 días se observó la presencia de células horizontales vacuolizadas, con mitocondrias alteradas (hinchadas y sin crestas) y con sus envolturas nucleares dilatadas (Figura 2b).
En los capilares de la CPE de la retina de ratas sometidas a hiperoxia de 0-6 días se apreció un endotelio en buen estado, con mitocondrias no alteradas y uniones estrechas bien constituidas (Figura 3a). En contraste, en la Figura 3b se puede apreciar la pérdida de la integridad de una unión estrecha entre dos células endoteliales en un capilar coroidal de una rata sometida a hiperoxia de 0-9 días de vida.
La red capilar de la retina presentó evidencias de vasoconstricción a nivel de la CPE en el grupo de ratas sometidas a hiperoxia de 0-9 días, observándose además células horizontales alteradas (Figura 4).
En la coroides, al igual que en la retina se percibieron claros signos de vasoconstricción, observándose capilares con sus células endoteliales modificadas, mostrando grandes proyecciones hacia la luz (Figura 5a), mientras que otros mostraron una cantidad grande e inusual de proyecciones delgadas con aspecto de peine (Figura 5b). Por otra parte, se observaron signos de hemorragia con diversidad de células sanguíneas donde predominaban los eritrocitos, además de observarse células plasmáticas (Figura 6).
Discusión
El análisis de la concentración de glutatión reducido (GSH) y de la patología retiniana y coroidal, mostró que el estrés oxidativo genera severos daños tanto en la retina como en la coroides de las ratas sometidas a diferentes regímenes de hiperoxia.
La concentración de GSH en los glóbulos rojos de las ratas sometidas de 0-6 días de hiperoxia presentó una gran disminución con respecto al control (68%). De manera similar, ocurrió con el grupo de ratas oxigenadas de 0-9 días, donde las concentraciones de GSH cayeron en un 54%. A diferencia de los regímenes de hiperoxia anteriores, las ratas sometidas a hiperoxia de 0-12 días mostraron una ligera declinación en sus niveles de GSH (13%) con respecto al control. Sin embargo, en las expuestas de 0-14 días, las concentraciones de GSH superaron las del control en un 34%.
La disminución del GSH en los eritrocitos de las ratas sometidas a hiperoxia de 0-6 y de 0-9 días de vida pudo ser debida a que la gran cantidad de oxígeno administrado durante ese tiempo condujo a una sobreproducción de especies reactivas de O2 (radicales libres), lo que probablemente desarrolló un estrés oxidativo. Sin embargo, durante ese período no se observaron alteraciones significativas en la ultraestructura de la retina (Papp et al., 1999). Posiblemente durante los primeros 9 días se activen mecanismos de defensa que provocan una disminución de los niveles de GSH y esto pudiera ser resultado de la activación de enzimas tales como la glutatión peroxidasa (Clahsen et al., 1992).
Cuando las ratas fueron sometidas a una hiperoxia mas prolongada (0-12 días), los niveles de la concentración de GSH tienden a ser nivelados con respecto al control de la misma edad, llegando inclusive a superar los niveles de concentración en el tratamiento de 14 días de hiperoxia continua. Se infiere que bajo condiciones de altos niveles de hiperoxia (80%) la concentración de GSH en las ratas es capaz de descender a valores bajos pero que, sin embargo, también es capaz de recuperarse y alcanzar niveles más altos que los normales, posiblemente como un mecanismo de defensa o un proceso adaptativo del organismo y probablemente ocurran efectos a otro nivel metabólico. Clahsen et al. (1992), trabajando con bebes recién nacidos, demostraron que los eritrocitos de estos niños eran capaces de restablecer las concentraciones del GSH durante el estrés oxidativo in vitro utilizando H2O2. Estos investigadores encontraron un agotamiento rápido del GSH con acumulación concomitante de GSSG, seguido por una recuperación de GSH y la caída de la concentración de GSSG al valor inicial.
Papp et al. (1999), examinaron el estado del glutatión en glóbulos rojos de pacientes de 6 semanas a 6 años de edad, nacidos prematuramente y separados en tres grupos: un grupo con ROP activa, otro con problemas de visión causados por una ROP precedente y los controles. En sus estudios in vivo encontraron que los infantes con la ROP activa mostraban los niveles más bajos de GSH y, al mismo tiempo, los niveles más altos de GSSG y, por lo tanto, una elevada proporción GSSG/GSH. Según estos investigadores el agotamiento del suministro de GSH es debido, parcialmente, a un reciclaje insuficiente del mismo, lo que conlleva al desarrollo de la ROP en estos infantes. En tales condiciones, los glóbulos rojos, y también los glóbulos blancos, son particularmente susceptibles a un estrés agudo.
Resultados similares a los de Papp et al. (1999), fueron reportados por Moison et al. (1997) al analizar pacientes con enfermedad crónica de pulmón y 31% de incidencia de ROP. Comparando con el control, encontraron que la concentración de GSH en los glóbulos rojos había disminuido significativamente cuando los pacientes fueron examinados a los 28 días de edad, después de una prolongada hiperoxia.
Clahsen et al. (1992) concluyeron que el reciclaje efectivo del GSH tiene un rol especial de proteger no solamente los glóbulos rojos, sino también los tejidos inmaduros prematuros del daño peroxidativo. Puertas et al. (1993) reportaron que en la retina humana funciona un sistema antioxidante dependiente del GSH y concluyeron que dicho sistema de defensa es de importancia primaria en ese tejido. El agotamiento del GSH conduce a muerte celular y esto ha sido reportado en muchas condiciones degenerativas (Parris, 1997).
Pinazo-Durán et al. (1995) y Montoliu et al. (1996) sugirieron que el globo ocular, y de una manera particular la retina y el nervio óptico, son especialmente vulnerables al ataque oxidativo y que los radicales libres desempeñan un papel crucial en la patogénesis de las vitreoretinopatías.
El análisis ultraestructural mostró que las células horizontales (CH) se encuentran vacuolizadas y con mitocondrias hinchadas. Estos resultados se encuentran en relación inversa con lo encontrado en los análisis de la concentración del GSH, donde el mayor estrés oxidativo fue observado en las ratas sometidas a hiperoxia entre los 0-6 y 0-9 días de vida y, además, donde las concentraciones de este importante componente del sistema antioxidante, son cercanas o superiores a los controles en los tratamientos de 0-12 y 0-14 días. Pareciera entonces que ocurriera un daño severo a nivel de la química de la retina en los primeros días de hiperoxia, lo cual no se ve reflejado cuando se analiza la estructura retiniana de estas ratas a los 30 días de edad.
Varios trabajos (Lachapelle et al., 1999; Dembinska et al., 2001; 2002; Benítez, 2003; Suárez, 2004) han mostrado que en ratas Sprague-Dawley recién nacidas expuestas a diferentes regímenes de hiperoxia se aprecia una disminución dependiente del O2 en el número de células horizontales.
La coroides, un tejido muy vascularizado entre la retina y la esclerótica, da el aporte sanguíneo a las capas más externas de la retina, mientras que la parte interna es irrigada por una red capilar a nivel de la CPE y capa de células ganglionares (CCG) (Guyton y Hall, 1997).
La histología capilar muestra procesos de vasoconstricción en la red capilar de la retina y la coroides de las ratas sometidas a hiperoxia de 0-9, 0-12 y de 0-14 días de vida. Algunos capilares mostraron células endoteliales con grandes proyecciones hacia la luz y otros con muchas y delgadas proyecciones dando un aspecto de peine. En presencia de alta hiperoxia estos vasos tienden a cerrarse posiblemente como un mecanismo de protección para evitar la intoxicación (Flower y Blake, 1981). La retina de la rata es altamente inmadura al nacimiento. Esta extrema inmadurez hace que la retina sea muy susceptible a los daños directos del O2. Ricci (1990) de igual manera observó procesos de vasoconstricción en la coroides de ratas sometidas a hiperoxia (80% O2) desde los 7 a los 10 días de nacidas. Pierce et al. (2000) al investigar el papel del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en la patogénesis de la primera fase de la ROP encontró que la hiperoxia produjo una baja regulación de la expresión del VEGF, lo que causó pérdida de la vasculatura ya desarrollada, procesos de vasoconstricción e interrupción del crecimiento normal de los vasos sanguíneos retinianos.
En la ROP, aparte de la vasoconstricción, la exposición de los vasos retinianos a altos niveles de O2 parece conducir al cese de su crecimiento. Se ha postulado que el estado indiferenciado de los vasos producidos, incluyendo la inadecuada capacidad para barrer los bioproductos tóxicos de O2, los vuelve a ellos mismos vulnerables a la hiperoxia (D'Amore, 1994).
Ultraestructuralmente, los pericitos que conforman los capilares de la coroides de las ratas sometidas de 0-14 días de hiperoxia mostraron signos degenerativos, presentando mitocondrias hinchadas y sin crestas. Además, las células aledañas a los capilares de la coroides mostraron procesos de vacuolización. Esta última fue observada aún en los tratamientos de 0-9 días de hiperoxia. Esto concuerda con el trabajo realizado por Penn et al. (1992), quienes al oxigenar ratas con 80% O2 por 14 días pudieron encontrar, a sólo 2 días de normoxia, la presencia de mitocondrias hinchadas. Estos autores también observaron vacuolización en los tejidos circundantes a los capilares. Cadenas y Davies (2000), por su parte, expresaron que los radicales libres generados por las mitocondrias o por otros sitios dentro o fuera de las células, causan daño a componentes mitocondriales e inician los procesos degenerativos. Las mitocondrias son estructuras que suministran la energía celular involucrada en los procesos oxidativos, son sumamente sensibles a los radicales libres y sus modificaciones morfológicas reflejan estados patológicos celulares (Magno y Joris, 1996).
Las células endoteliales se comunican por medio de uniones estrechas, las cuales constituyen la barrera hematorretiniana interna (Waltman, 1983). En este estudio se observó un debilitamiento de las uniones estrechas en los capilares de la coroides de ratas oxigenadas de 0-9 días. Penn et al. (1992), notaron que en los capilares retinianos de ratas oxigenadas de 0-14 días, las células endoteliales adyacentes no mostraban uniones estrechas. Según Burns et al. (1986) la pérdida de la integridad de estas uniones estrechas no es debida a la inmadurez de los vasos, puesto que, en las ratas estas uniones están formadas tempranamente por células precursoras de aspecto fusiforme.
Un debilitamiento en las uniones estrechas del endotelio capilar puede conducir a una hemorragia en la retina. En este estudio se observaron eritrocitos y células plasmáticas extravasadas, sugiriendo que se estuvo en presencia de una hemorragia. Penn et al. (1992), en sus análisis de la ROP causada por la hiperoxia en ratas, pudieron notar que éstas exhibieron grandes hemorragias retinianas a nivel de la red capilar extendida a lo largo de toda la capa nuclear externa hasta el espacio subretiniano (entre la coroides y la retina). Sin embargo, no encontraron indicación de que la hemorragia pudo haberse producido en la coroides, ya que la membrana de Bruch estaba intacta.
Conclusiones
Las ratas recién nacidas mostraron los niveles significativamente bajos de GSH en los glóbulos rojos tras ser sometidas a hiperoxia de 0-6 y 0-9 días de vida. Sin embargo, la histología retiniana a los 30 días no presentó cambios estructurales importantes. Por otra parte, las ratas tratadas con hiperoxia de 0-12 y de 0-14 días revelaron niveles de GSH normales o superiores al control, pero el daño estructural de la retina fue severo. Estos hallazgos sugieren que los primeros 6 y 9 días de oxigenación fueron los más críticos, ya que provocaron un daño bioquímico importante en las membranas de los glóbulos rojos y, posiblemente, un daño irreversible en las membranas de las células retinianas.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a Gilma Hernández, José Luis Prin, Ángel Antón, María Romero, Milagro Moreno y Antonio Gómez por su asistencia en el laboratorio. Este estudio fue financiado por el Fondo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (FONACIT), el Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente y el Instituto de Investigaciones en Biomedicina y Ciencias Aplicadas de la Universidad de Oriente (IIBCA-UDO).
REFERENCIAS
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