EFECTO DE ENZIMAS FIBROLÍTICAS EXÓGENAS EN LA DEGRADACIÓN IN VITRO DE INGREDIENTES ALIMENTICIOS, Y EN LA PRODUCCIÓN DE LECHE DE VACAS HOLSTEIN

Juan Manuel Pinos-Rodríguez, Sergio González, Germán Mendoza, Juan Carlos García, Luis Miranda, Guadalupe Adriana De La Cruz y Vidal De Lerma

Juan Manuel Pinos Rodríguez. Médico Veterinario Zootecnista, Universidad Veracruzana, México. Maestro y Doctor en Ciencias, Colegio de Postgraduados (CP), Montecillo, México. Profesor Investigador, Universidad Autónoma de San Luis Potosí (UASLP), México. Dirección: Altair 200, Fracc. del Llano. C.P. 78377. San Luis Potosí, S.L.P. México. e-mail: jpinos@uaslp.mx

Sergio S. González Muñoz. M.Sc. y Ph.D., University of Nebraska, EEUU. Profesor Investigador, CP, Montecillo, México.

Germán Mendoza. Ph.D. University of Nebraska, EEUU. Profesor Investigador, CP, Montecillo, México.

Juan Carlos García López. Doctor en Ciencias, CP, Montecillo, México. Profesor Investigador, UASLP, México.

Luis Miranda. Doctor en Ciencias, CP, Montecillo, México. Profesor Investigador. Universidad Autónoma Chapingo, México.

Guadalupe Adriana de la Cruz. Ingeniero Agrónomo Zootecnista, UASLP, México.

Vidal de Lerma. Ingeniero Agrónomo Zootecnista, UASLP, México.

Resumen

Los complejos enzimáticos exógenos se han usado para incrementar la digestibilidad de la fibra contenida en los forrajes; sin embargo, no se conoce su efecto sobre otros ingredientes alimenticios que componen las raciones integrales para rumiantes. Por ello, en un primer experimento se evaluó el efecto de enzimas fibrolíticas en la degradación ruminal in vitro de la materia seca (DIVMS) de ingredientes alimenticios energéticos (granos de maíz y sorgo), fibrosos (cascarilla de soya y ensilado maíz), proteínicos (pasta de soya y semilla de algodón), heno de alfalfa (7, 12, 21 y 28 días de rebrote) y de un concentrado, a las 3, 6, 12, 24, 48 y 72h de incubación. Las enzimas fibrolíticas mejoraron (P<0,10) principalmente la DIVMS de los ingredientes fibrosos. En un segundo experimento se evaluó el efecto de las enzimas fibrolíticas en la producción de leche de vacas Holstein alimentadas con dietas integrales elaboradas con los ingredientes evaluados en el primer experimento. La producción de leche en la semana experimental 3, 4 y 8 (P<0,10), y 5 y 16 (P<0,05) fue incrementada por las enzimas fibrolíticas exógenas.

Summary

Exogenous enzyme complexes are used to increase forage fiber digestibility, but their effect on other foodstuffs included in the total mixed ration for ruminants, is not totally understood. A first experiment was performed to evaluate the effect of fibrolytic enzymes on in vitro dry matter disappearance (IVDMD) of energetic (corn and sorghum grain), proteinic (soybean meal, cotton seed hull and concentrate), fibrous (soybean hulls and corn silage) and alfalfa hay (7, 12, 21 y 28 days from budding) foodstuffs, incubated for 3, 6, 12, 24, 48 and 72h. Enzymes increased (P<0.10) IVDMD of fibrous foodstuffs. In the second experiment, the effect of fibrolytic enzymes on milk production of Holstein cows fed with total mixed rations prepared with the same foodstuffs used in the first experiment, was determined. Milk production for weeks 3, 4, 8 (P<0.10) and 5, 16 (P<0.05) was increased by effect of exogenous fibrolytic enzymes.

Resumo

Os complexos enzimáticos exógenos tem se usado para incrementar a digestibilidade da fibra contida nas forragens; no entanto, não se conhece seu efeito sobre outros ingredientes alimentícios que compõem as rações integrais para ruminantes. Por isto, num primeiro experimento se avaliou o efeito de enzimas fibrolíticas na degradação ruminal in vitro da matéria seca (DIVMS) de ingredientes alimentícios energéticos (grãos de milho e sorgo), fibrosos (farelo de soja e milho ensilado), proteínicos (pasta de soja e semente de algodão), feno de alfalfa (7, 12, 21 e 28 dias de rebrote) e de um concentrado, ás 3, 6, 12, 24, 48 e 72 hrs de incubação. As enzimas fibrolíticas melhoraram (P<0,10) principalmente a DIVMS dos ingredientes fibrosos. Num segundo experimento se avaliou o efeito das enzimas fibrolíticas na produção de leite de vacas Holstein alimentadas com dietas integrais elaboradas com os ingredientes avaliados no primeiro experimento. A produção de leite na semana experimental 3, 4 e 8 (P<0,10), e 5 e 16 (P<0,05) foi incrementada pelas enzimas fibrolíticas exógenas.

PALABRAS CLAVE / Alimentos / Degradación in vitro / Enzimas Fibrolíticas / Producción de Leche / Vacas Lecheras /

Recibido: 03/05/2004. Modificado: 13/10/2005. Aceptado: 17/10/2005.

 

Introducción

Los resultados de algunas investigaciones sugieren que enzimas fibrolíticas exógenas mejoran la degradación del alimento en el rumen (Pinos-Rodríguez et al., 2002b) y en el tubo digestivo (Gwayumba y Christensen, 1997; Hristov et al., 1998; Beauchemin et al., 1999b), debido a un sinergismo con las enzimas de los microorganismos ruminales (Morgavi et al., 2000; Morgavi et al., 2001). Los factores más importantes que pueden afectar la acción de las enzimas están relacionados con la dosis y tipo de enzima (Kung et al., 2000), característica del sustrato (Pinos-Rodríguez et al., 2002a) y etapa fisiológica del animal (Frumholtz y Beauchemin, 2001). Los complejos enzimáticos con actividad preferentemente xilanolítica tienen mejores efectos biológicos y productivos cuando los rumiantes reciben dietas altas en granos y cuando las enzimas son mezcladas con el concentrado (Beauchemin et al., 1999a). Es probable que este tipo de enzimas tenga un efecto mayor en las fracciones de fibra de los ingredientes alimenticios de los concentrados, que en las fracciones de fibra de los forrajes, lo que aumentaría la liberación de carbohidratos simples en el rumen (Yang et al., 1999) y por tanto la energía disponible para producción de leche sería mayor (Lewis et al., 1999; Frumholtz y Beauchemin, 2001). El incremento en la tasa de digestión en la fibra detergente neutra (FDN) equivalente al 10%, permite aumentos de 30% en la energía neta para lactación y de 20% en la producción de leche (Johnston, 2000).

El objetivo de la presente investigación fue evaluar el efecto de enzimas fibrolíticas en la degradación in vitro de algunos ingredientes alimenticios y forrajes usados en la alimentación de rumiantes y en la producción de leche en vacas Holstein.

Materiales y Métodos

Experimento 1

El experimento se realizó en el Instituto de Investigación de Zonas Desérticas de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí, México. Los ingredientes utilizados como sustrato fueron cascarilla de soya, maíz en grano, ensilado de maíz, semilla de algodón, pasta de soya, sorgo en grano y un concentrado comercial para vacas lecheras, elaborado principalmente con dichos ingredientes por Semilla y Forrajes el Milagro, S.A. de C.V. San Luis Potosí, México. De acuerdo con la clasificación internacional (NRC, 2001) los ingredientes fueron agrupados en energéticos (sorgo y maíz en grano), proteínicos (semilla de algodón, pasta de soya y concentrado) y fibrosos (cascarilla de soya y maíz ensilado). También se evaluó el efecto de las enzimas fibrolíticas en heno de alfalfa de 7, 14, 21 y 28 días de rebrote, para obtener forraje con calidad nutritiva distinta. El forraje fue cortado, secado a la intemperie y molido a un tamaño de 1mm. En los ingredientes y el heno de alfalfa (Tabla I) se determinó materia seca (MS), proteína cruda (PC) (AOAC, 1990), fibra detergente neutro (FDN) y ácido (FDA; Van Soest, et al., 1991). Para cuantificar la actividad de las enzimas fibrolíticas exógenas en la degradación in vitro de la MS (DIVMS) de los sustratos, se usó la primera fase de la técnica de Tilley y Terry (1963). El líquido fue recolectado de tres novillos Angus con cánulas ruminales y alimentados con paja de sorgo (50%), heno de alfalfa (40%) y concentrado (10%), agua y minerales ad libitum. El líquido ruminal se diluyó (4:1) con saliva artificial de McDougall (1948) de pH 6.8. De esa solución, 30ml fueron transferidos a tubos de ensayo de 100ml de capacidad equipados con tapones y agujas hipodérmicas. Los tubos contenían 300mg de las muestras secadas (60ºC durante 48h) y molidas (malla 1mm) con y sin 3mg de un extracto enzimático glucosilado con actividad xilanolítica (100Ug-1) de Aspergillus niger y Trichoderma viridae (Fibrozyme, Alltech Inc., Nicholasville, KY, EEUU). Los tubos fueron colocados en baño María a 39ºC e incubados durante 3, 6, 12, 24, 48 y 72h. La degradación se detuvo mediante congelación a 4ºC. Después, los tubos se descongelaron a temperatura ambiente para filtrar su contenido a través de papel Whatman 541, con la ayuda de una bomba de vacío. El residuo fue secado a 55ºC y pesado en una balanza analítica. Con los tiempos de incubación se calculó la tasa de degradación de la fracción potencialmente digestible (Kd; %/h) de la MS (Mertens, 1977). El experimento completo se realizó dos veces, con una diferencia de dos semanas entre cada uno, para utilizar la interacción experimento (tratamiento) como criterio de error en el modelo (Pinos-Rodríguez et al., 2002c) de acuerdo a un diseño de bloques generalizado completamente al azar; arreglo de tratamientos factorial 2´7 para el factor enzima (2) e ingrediente (7); 2´3 para los factores enzima (2) y tipo de ingrediente (3); y 2´4 para el factor enzima (2) y tiempo de rebrote de la alfalfa (4). Todos los datos se analizaron utilizando el procedimiento GLM de SAS (1990), La comparación de las medias de los factores principales y sus interacciones se realizaron con el procedimiento LSMEANS de SAS (1990).

Experimento 2

Este experimento se realizó en el rancho "El Barroso", localizado en la estación Jaral de Berrio, municipio de San Felipe, Guanajuato, México. Se utilizaron 40 vacas Holstein multíparas (6 a 79 días en leche) asignadas aleatoriamente a dos grupos de 20 vacas cada uno: sin o con enzimas (Fibrozyme, Alltech Inc., Nicholasville, KY, EEUU). El producto enzimático es la combinación de extractos de la fermentación de A. Níger y T. viridae y fermentos solubles protegidos por técnicas de glucosilación, con una actividad xilanásica de 100U·g-1. Las enzimas fibrolíticas fueron adicionadas en el concentrado al momento de su elaboración (1,3kg·t-1). Las vacas fueron alimentadas ad libitum con dietas integrales a las 7:00 y 16:00h. Se tomaron muestras de las dietas integrales para determinarles el contenido de MS, PC (AOAC, 1990), FDN y FDA (Van Soest et al., 1991; Tabla II). La producción de leche se midió semanalmente durante 120 días y se le determinó su porcentaje de grasa (AOAC 1990), con lo que se calculó la producción de leche corregida a 3,7% de grasa. El consumo de MS no pudo ser medido, debido a dificultades de pesado con el carro mezclador. También se calificó la condición corporal (escala 1 a 5) de las vacas. Los datos fueron analizados como un diseño completamente al azar, con medidas repetidas (SAS, 1990). El análisis de varianza se realizó utilizando el procedimiento GLM (SAS, 1990). La producción de leche al inicio del experimento fue utilizada como una covariable en el modelo (P<0,001). La comparación de medias y su ajuste por la covariable se realizó utilizando el procedimiento LSMEANS (SAS, 1990).

Resultados y Discusión

Experimento 1

La degradación in vitro de la MS (DIVMS) de los ingredientes a las 3 y 72h fue más alta para la pasta de soya, el alimento concentrado y el maíz grano (P<0,05), seguidos de la cascarilla de soya, del sorgo en grano y del ensilado de maíz; la DIVMS de la semilla de algodón fue la más baja (Tabla III). La mayor DIVMS de la pasta de soya puede atribuirse a la distribución de sus fracciones de proteína. Según NRC (2001) la pasta de soya tiene un alto porcentaje de fracción A y B1 en su proteína, las cuales son altamente solubles y degradables en rumen, aunado a los porcentajes relativamente bajos de FDN y FDA. Por el contrario, la menor DIVMS de la semilla de algodón pudo deberse a su alto porcentaje de FDN y FDA (Tabla I), y de la fracción C de su proteína (NRC, 2001). El valor más bajo de Kd fue para la semilla de algodón, aunque sólo el maíz en grano y el sorgo fueron significativamente mayores.

La proteína de los alimentos es dividida en tres fracciones: A, B y C. La fracción A se refiere al nitrógeno no proteínico y considera al amonio, péptidos y aminoácidos, que por su alta solubilidad ruminal, son rápidamente convertidos en amoniaco dentro del rumen. La fracción B se refiere a la proteína verdadera, y la cual, además, es subdividida en tres (B1, B2 y B3), con base a su tasa de degradación ruminal. La subfracción B1 es la proteína rápidamente degradable en rumen. La subfracción B2 es la proteína que parte es degradada en rumen y parte en intestino delgado, y que su tasa de degradación dependerá de la tasa de digestión y de pasaje. La subfracción B3 es la proteína que es lentamente degradable en rumen, y gran parte de ella es utilizable en intestino delgado. La fracción C se refiere a la proteína indigestible o ligada a lignina, taninos o a productos Maillard, razón por la cual son altamente resistentes a la degradación ruminal y enzimas digestivas (Sniffen et al., 1992).

Las enzimas aumentaron (P<0,10) la DIVMS de los ingredientes sólo a las 3h de incubación, pero después la digestión y Kd no cambiaron (Tabla III). Los resultados de otros estudios in vitro sugieren que el poder degradativo de la enzimas fibrolíticas exógenas es mayor en las primeras 12h de incubación (Tricarico et al., 1998; Kung et al., 2000), ya que posteriormente comienzan a ser degradadas por las proteasas ruminales (Pinos-Rodríguez et al., 2002a) y alrededor de las 24h, la curva de degradación alcanza a formar una meseta (Yang et al., 1999). Lo anterior coincide con otros estudios in vitro donde con incubaciones a las 48h las enzimas no modificaron la degradabilidad de la FDN de algunos forrajes (Sheperd y Kung, 1996; Mandebvu et al., 1999).

Las enzimas incrementaron la DIVMS de ingredientes energéticos, fibrosos y proteínicos a las 3h (P<0,05) y 48h (P<0,10) pero el mayor efecto se encontró en los ingredientes fibrosos (Tabla IV), lo que corresponde con la actividad xilanolítica de estas enzimas exógenas. A las 6, 12, 24 y 72h de incubación la DIVMS, así como el Kd de los ingredientes energéticos, fibrosos y proteínicos con o sin enzimas no fueron diferentes (P>0,10). En dietas integrales con alta proporción de concentrado, aunque el contenido de fibra sea bajo, las enzimas fibrolíticas exógenas contribuyen a incrementar la degradación de los componentes de la pared celular en los forrajes y en los ingredientes del concentrado (Krause et al., 1998).

 

La DIVMS del heno de alfalfa de 7, 14 y 21 días de rebrote incubadas a las 3, 6, 12 y 24h, aunque no son diferentes entre si (P<0,5), fue mayor que la DIVMS del heno de alfalfa de 28 días de rebrote. El Kd y la DIVMS del heno de alfalfa de 7, 14, 21 y 28 días de rebrote incubadas a las 48 y 72h no fueron estadísticamente diferentes (Tabla V). El incremento en la madurez de los forrajes está relacionado con el incremento de pared celular, lo cual reduce su digestibilidad (Galyean y Goetsch, 1993). El Kd y la DIVMS del heno de alfalfa de 7, 14, 21 y 28 días de rebrote, con o sin enzimas, no fueron diferentes (P>0,10). En estudios realizados por Pinos-Rodríguez et al. (2001), la degradación de la MS del heno de alfalfa se incrementó significativamente por enzimas fibrolíticas, aunque la dosis de la enzima exógena fue 20 veces mayor (20mg enzima/100mg sustrato) a la usada en el presente estudio (1mg enzima/100mg sustrato). Pinos (1999) también evaluó seis niveles de enzimas fibrolíticas exógenas (0, 5, 10, 20, 40 y 80mg enzima/100mg sustrato) en la degradación in vitro de la FDN de heno de alfalfa y encontró que al aumentar la dosis de la enzima se incrementó linealmente la degradación (P<0,0001), sin llegar al punto de saturación. La recomendación del fabricante de la enzima fibrolítica exógena es utilizar 15g/vaca/d. Según NRC (2001) una vaca que produce 35kg de leche con 3,5% de grasa y 3,0% de proteína, debe consumir aproximadamente 24kg de MS. De acuerdo con esta relación dosis de enzima y consumo de MS, corresponden 0,625mg enzima/100mg sustrato, el cual es un nivel enzimático menor que el usado en el presente estudio (1mg enzima/100mg sustrato).

Experimento 2

Las enzimas fibrolíticas exógenas incrementaron la producción de leche total y corregida a 3,7% de grasa en las semanas 5 y 16 (P<0,05) y en las semanas 3, 4 y 8 (P<0,10) de la fase experimental (Figura 1), aunque en la semana 13 las vacas que recibieron la enzima produjeron menos leche (P<0,05) que el grupo testigo. La producción de leche promedio y corregida por 3,7% de grasa (Tabla VI) no fue estadísticamente diferente en las vacas alimentadas sin o con enzimas (26,6 y 28,2kg/día/vaca, respectivamente). Esta diferencia numérica, no significativa, por efecto de las enzimas fibrolíticas en el promedio de producción de leche total y corregida, representaría incrementos del 5,6% y 5,7%. No se encontraron diferencias significativas en la condición corporal y en el porcentaje de grasa de la leche en ambos grupos de vacas. Estos hallazgos coinciden con los de Dawson y Tricarico (1999), quienes observaron que 15g/día/vaca de enzimas fibrolíticas exógenas glucosiladas incrementaron la producción de leche entre 0,8 a 2,8kg/día, posiblemente debido al mayor consumo de MS y mayor eficiencia en los procesos digestivos y de fermentación en el rumen. Una limitación importante de nuestro estudio fue no medir el consumo de MS de las vacas.

Las enzimas fibrolíticas exógenas aumentan la liberación de carbohidratos simples en el rumen (Yang et al., 1999), como resultado de la mayor tasa de digestión de la FDN de los alimentos (Feng et al., 1996; Lewis et al., 1996), y por tanto hay más energía disponible para la vaca. Este mecanismo enzimático es el responsable de los incrementos en algunas variables productivas en vacas lecheras (Lewis et al., 1999), incluso con estrés calórico (Frumholtz y Beauchemin, 2001).

Conclusiones

Las enzimas fibrolíticas exógenas mejoran la degradación in vitro de la MS de ingredientes alimenticios fibrosos en las primeras horas de incubación, aunque sin efecto positivo sobre la degradación in vitro del heno de alfalfa. Al parecer las enzimas exógenas con actividad de tipo xilanolítica tienen mayor efecto en la fibra de los ingredientes alimenticios que en la de los forrajes. Las enzimas exógenas incrementaron la producción de leche en las semanas experimentales 3, 4, 5, 8 y 16, indicando que mientras más temprana sea la lactancia de la vaca, y mayor sea la producción y demanda de energía, estos aditivos tendrán mayores efectos positivos en la producción de leche.

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