ESTRUCTURA GENÉTICA Y DIVERSIDAD DE LINAJES DE Pyricularia grisea EN LA ZONA ARROCERA VENEZOLANA

Asia Y. Zambrano, Ariadne Vegas, Reinaldo Cardona, Zulay Gutiérrez y Jhonny R. Demey

Asia Y. Zambrano. Doctora en Ciencias Agrícolas, Universidad Central de Venezuela (UCV). Investigador, Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA-CENIAP), Venezuela. Dirección: Apartado 4521. Maracay, 2101. Venezuela. e-mail: azambrano@inia.gob.ve

Ariadne Vegas. Doctora en Ciencias Agrícolas, UCV, Venezuela. Investigador, INIA-CENIAP, Maracay, Venezuela.

Reinaldo Cardona. Master en Fitopatología, Universidad Centro Occidental Lisandro Alvarado, Venezuela. Investigador, INIA-Portuguesa, Venezuela.

Zulay Gutiérrez. Técnico Superior, Instituto Tecnológico Alonso Gamero, Venezuela. Técnico Asociado a la Investigación, INIA-CENIAP, Maracay, Venezuela.

Jhonny R. Demey. Master en Estadística, UCV, Venezuela. Bioestadístico, Centro de Biotecnología, Fundación Instituto de Estudios Avanzados (IDEA), Venezuela. e-mail: jdemey@reacciun.ve

Resumen

Se caracterizó la estructura genética y la diversidad de linajes de Pyricularia grisea, en la zona arrocera venezolana. Se emplearon 448 aislamientos monospóricos de P. grisea provenientes de variedades comerciales, líneas experimentales, variedades foráneas y líneas diferenciadoras internacionales durante las cosechas de los años 1998, 1999 y 2000, en los estados de Barinas, Cojedes, Guárico y Portuguesa. La caracterización se realizó a través de la reacción en cadena de la polimerasa con los iniciadores Pot2-1 y Pot2-2. Fueron identificados siete linajes, identificados como Ven-1, Ven-2, Ven-3, Ven-4, Ven-5, Ven-6 y Ven-7. El estudio de las relaciones genéticas entre los linajes de P. grisea generó tres grupos homogéneos, el primero formado por el linaje Ven-5, el segundo por los linajes Ven-2, Ven-3, Ven-4 y Ven-7, y el tercero por los linajes Ven-1 y Ven-6. La distribución de frecuencias fue de 76,34; 11,16; 5,58; 2,01; 2,23; 1,56; y 1,12% para el Ven-1 al Ven-7, respectivamente. El índice de equidad ajustado por remuestreo identifica al estado Guárico como el "hot spot site".

Summary

The genetic structure and lineage diversity of Pyricularia grisea in the Venezuelan rice zone were characterized using 448 monosporic isolates of P. grisea from commercial varieties, experimental lines, foreign varieties and international differential lines grown in plots during 1998, 1999 and 2000, in the Barinas, Cojedes, Guarico and Portuguesa states. Characterization was made by polymerase chain reaction amplification using primers Pot2-1 and Pot2-2. Seven lineages were identified as Ven-1, Ven-2, Ven-3, Ven-4, Ven-5, Ven-6 and Ven-7. The study of the genetic relations between the lineages of P. grisea generated three homogenous groups, the first formed by Ven-5, the second formed by the lineages Ven-2, Ven-3, Ven-4 and Ven-7, and the third by the lineages Ven-1 and Ven-6. Frequency counts were of 76.34, 11.16, 5.58, 2.01, 2.23, 1.56 and 1.12% for Ven-1 to Ven-7, respectively. The equitability index fit by resampling techniques identifies the State of Guarico as the "hot spot site".

Resumo

Caracterizou-se a estrutura genética e a diversidade de linhagens de Pyricularia grisea, na zona arrozeira venezuelana. Se empregaram 448 isolamentos monospóricos de P. grisea provenientes de variedades comerciais, linhas experimentais, variedades forâneas e linhas diferenciadoras internacionais durante as colheitas dos anos 1998, 1999 e 2000, nos estados de Barinas, Cojedes, Guárico e Portuguesa. A caracterização se realizou a través da reação em cadeia da polimerasa com os iniciadores Pot2-1 e Pot2-2. Foram identificados sete linhagens, identificados como Ven-1, Ven-2, Ven-3, Ven-4, Ven-5, Ven-6 e Ven-7. O estudo das relações genéticas entre as linhagens de P. grisea gerou três grupos homogêneos, o primeiro formado pela linhagem Ven-5, o segundo pelas linhagens Ven-2, Ven-3, Ven-4 e Ven-7, e o terceiro pelos linhagens Ven-1 e Ven-6. A distribuição de freqüências foi de 76,34; 11,16; 5,58; 2,01; 2,23; 1,56; e 1,12% para o Ven-1 ao Ven-7, respectivamente. O índice de eqüidade ajustado por re-amostragem identifica ao estado Guárico como o "hot spot site".

PALABRAS CLAVE / Añublo / Diversidad genética / Linaje / Oryza sativa / Pyricularia oryzae / Sitio caliente /

Recibido: 25/01/2005. Modificado: 15/11/2005. Aceptado: 16/11/2005.

Introducción

El arroz (Oryza sativa L.) es uno de los mayores cereales producidos a nivel mundial, supliendo aproximadamente el 23% de la energía per cápita de seis mil millones de personas (Tan et al., 2001). Ocupa el segundo lugar después del trigo en superficie cosechada, pero desde el punto de vista alimenticio una mayor cantidad de población depende del arroz. En Venezuela anualmente se cultivan alrededor de 135000ha de arroz con un producción anual promedio de 700000ton (IRRI, 2005), distribuidas en los estados Barinas, Cojedes, Delta Amacuro, Guárico y Portuguesa. Cerca del 85% de la producción nacional se concentra en el área bajo riego de los estados Guárico y Portuguesa, con un rendimiento promedio de 5,19t/ha (IRRI, 2005).

El hongo piricularia (Pyricularia grisea (Cooke) Sacc.) es considerada la más devastadora enfermedad del arroz a nivel mundial, debido a su amplia distribución y las graves perdidas económicas que ocasiona. Produce una enfermedad criptogámica compleja debido a la variabilidad patogénica y la rapidez con que este hongo vence la resistencia de la planta. El micelio del hongo produce una sustancia tóxica conocida como piricularina, que inhibe el crecimiento de los tejidos y los desorganiza. En las hojas, las lesiones típicas son manchas elípticas de color gris o blanquecino en el centro y bordes marrones a rojizo, las cuales pueden unirse dependiendo de las condiciones ambientales y de la susceptibilidad del cultivar, lo que produce la reducción del área fotosintética y por tanto del rendimiento. En el cuello de la panícula, la colonización del hongo inhibe el flujo de fotosintetizados hacia los granos en formación, originando panículas vacías y la caída de las mismas. Los cultivares susceptibles sembrados en condiciones favorables para el desarrollo del hongo pueden ser totalmente destruidos en la fase de plántula o macollamiento. Cuando no hay destrucción total del cultivo es bastante difícil estimar las perdidas, por lo que no hay una estimación exacta de las mismas, pero se considera que las perdidas son proporcionales al porcentaje del área foliar o del cuello de la panícula afectada (Ou, 1985).

El mecanismo de resistencia genética a piricularia ha sido atribuido a genes dominantes de efectos mayores (Kiyosawa et al., 1986) y en otros casos a grupos de genes de efectos menores (Lin, 1986 y Wang et al., 1989), constituyendo el desarrollo de variedades resistentes a la enfermedad la vía más económica para su control y con menor impacto ambiental. Sin embargo, esta resistencia es usualmente superada después de que los cultivares son liberados, debido a los continuos cambios y evolución del patógeno, los cuales dan origen a nuevos patotipos en el ecosistema compatibles con los cultivares resistentes. La liberación de variedades resistentes requiere la implementación de prácticas agrícolas integrales que tomen en cuenta la interacción entre los genes de resistencia y las poblaciones del patógeno, la dinámica de virulencia del hongo y el flujo de genes a las malezas y a especies silvestres relacionadas al arroz (Roca et al., 1996)

Los aspectos de mayor importancia a ser considerados en el desarrollo de variedades con resistencia duradera a la enfermedad causada por el hongo piricularia son la identificación del sitio (hot spot site) donde se realizará la selección de progenitores y líneas, y la identificación fiable de las razas del hongo. En el primer aspecto, Correa-Victoria y Zeigler (1994) indican que un sitio será considerado más caliente o hot spot site si existe una alta presión de la enfermedad y diversidad del patógeno asociada a condiciones ambientales favorables al desarrollo del hongo. En el segundo, la gran variabilidad patogénica del hongo es una de las mayores limitantes en el mejoramiento genético (Ahn, 1994), por lo que la utilización del concepto de linaje o familias genéticas con características similares e identificadas a través de ‘fingerprinting’ del ADN del hongo y de su espectro de virulencia en pruebas de invernadero, reduce la complejidad del manejo del gran número de razas del hongo (Guimaraes et al., 1996, 1998; George et al., 1998), permitiendo establecer programas de mejoramiento basados en la teoría de exclusión de linajes (Levy et al., 1991).

Para el estudio de la estructura genética e identificación de linajes de P. grisea se han utilizado dos metodologías. Levy et al. (1991) agrupan la población del hongo en familias genéticas a través de la utilización de la secuencia repetitiva de ADN conocida como MGR586 o ‘fingerprinting’ del ADN. Esta sonda que utiliza la técnica RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) restringiendo el ADN del hongo con la enzima EcoRI, detecta entre 50 y 60 perfiles geonómicos. George et al. (1998) desarrollaron la técnica rep-PCR (Repetitive Element-Based Polymerase Chain Reaction) usando los iniciadores Pot-2, la cual posee la misma sensibilidad para discriminar los aislamientos de P. grisea que la técnica RFLP, pero es más simple y económica, demostrándose la correspondencia entre los linajes definidos por rep-PCR y por RFLP.

Se han realizado numerosos estudios moleculares de diversidad genética de P. grisea con aislamientos del hongo provenientes de diferentes regiones del mundo, detectándose que están compuestos de pequeños números, entre 2 y 8, de linajes bien diferenciados. Se han detectado 6 linajes en Colombia (Levy et al., 1991, 1993), 7 linajes en Filipinas (Zeigler et al., 1995), 5 linajes en Europa (Francia, Hungría, Italia, Portugal y España; Roumen et al., 1997), 8 linajes en Estados Unidos (Correl et al., 2000), 2 linajes en Brasil (Prabhu et al., 2002) y 5 linajes en Irán (Javan-Nikkhah et al., 2004). La conformación de la referencia internacional de la diversidad del patógeno permitirá la selección de fuentes de resistencia para regiones productoras de arroz del mundo.

En Venezuela se han realizado estudios preliminares de estandarización de la metodología de amplificación de rep-PCR (Arnao et al., 2003). Con el objeto de generar la información básica que contribuya a la estrategia de mejoramiento, en el presente trabajo se caracteriza la estructura genética y se estudia la diversidad de linajes de P. grisea en la zona arrocera venezolana, a través de la técnica rep-PCR.

Materiales y Métodos

Material vegetal

La colección del hongo se realizó en parcelas comerciales de los estados venezolanos de Barinas, Cojedes, Guárico y Portuguesa, en las localidades de Toruno, San Carlos, Bancos de San Pedro y Araure. El muestreo fue realizado de manera aleatoria sobre las variedades comerciales, líneas experimentales, variedades foráneas y líneas diferenciadoras internacionales sembradas durante las cosechas de los años 1998, 1999 y 2000, y se afijo proporcionalmente sobre el área sembrada por localidad, a razón de 25, 19, 47 y 9% para los estados Barinas, Cojedes, Guárico y Portuguesa, respectivamente, que representan el 98% del área total sembrada de arroz en Venezuela.

Las fuentes de aislamiento del hongo se obtuvieron de 27 cultivares, de los cuales ARAURE 1, ARAURE 2, ARAURE 3, ARAURE 4, CIMARRON, FONAIAP 1, FONAIAP 2, CT 15 y PALMAR son variedades comerciales que han sido sembradas en Venezuela durante los últimos 20 años; CMCEPA, FD9702, FD9706, LINEA 6 y PN97A004 son líneas experimentales; BLUEBONNET 50, CAPI 93, FANNY, IR8, IRGA416, MUDGO, ORYZICA LLANO 5, ORYZICA 1, UF1 y UF4 son variedades foráneas; y CALORO, DULAR y SHA TIA TSAO líneas diferenciadoras internacionales.

Aislamiento y multiplicación del hongo

La recolección de las hojas infectadas en el campo, el aislamiento y la multiplicación del hongo en el laboratorio fueron realizadas según metodología descrita por Guimaraes et al. (1996). Los aislamientos fueron obtenidos en campo de hojas enfermas de los diferentes cultivares sembrados a partir de secciones de hojas con una sola lesión, lavada previa colocación en cámara húmeda. Los aislamientos fueron incubados por 24 a 48h en ambiente de laboratorio con el objeto de inducir la esporulación. Una vez esporuladas las lesiones, con la ayuda de un microscopio estereoscopio y un hisopo metálico, se tomaron esporas que fueron transferidas y esparcidas en cajas de Petri estéril contentivas de agar-agua acidificado (AAA). A las 24h de ser transferidas, se tomaron secciones de AAA contentivas de una sola espora germinada, ubicada con la ayuda del microscopio y se colocaron 5 trozos por caja de Petri estéril contentiva de agar-salvado de arroz (ASA) obteniendo así los aislamientos monospóricos. La identificación de P. grisea fue confirmada con la ayuda de un microscopio compuesto.

Cada aislamiento se almacenó sobre papel de filtro seco bajo refrigeración (-4ºC) hasta su utilización. Los aislamientos fueron reactivados colocando una sección de papel de filtro contentivo de micelio y esporas del hongo en una cápsula de Petri estéril conteniendo ASA. Se obtuvo un total de 448 aislamientos monospóricos de P. grisea provenientes de hojas de arroz infectadas en campo.

Extracción y amplificación del ADN

El ADN total de cada aislamiento monospórico de P. grisea se extrajo mediante el protocolo de miniextracción con CTAB descrito en CIAT (1994), la cuantificación se realizó por comparación visual con el ADN de fago l no digerido y su amplificación se efectuó según metodología propuesta por George et al. (1998) y CIAT (1994).

Las amplificaciones del ADN se realizaron en una mezcla de reacción final de 25µl constituida por 2,5mM de tampón 10X (10mM tris HCl; pH 9,0; 50mM KCl; 0,1% Triton^® X-100); 1,5mM de MgCl₂; 750µM de sulfato de amonio; 0,185mM de dNTPs (A, C, G y T); 2,5U de Taq polimerasa (Promega^®); 100ng de ADN; y 0,5µM de cada uno de los iniciadores Pot2-1 [5'-CGG AAG CCC TAA AGC TGT TT-3'] y Pot2-2 [5'-CCC TCA TTC GTC ACA CGT TC-3']. Se adicionó 20µl de aceite mineral para cubrir la reacción.

La amplificación fue realizada en un termociclador modelo GeneE (TECHNE^®), bajo los siguientes perfiles de temperatura: 1 ciclo de desnaturalización a 95ºC por 2,5min; 4 ciclos cada uno con un segmento de desnaturalización a 94ºC por 1min; uno de alineamiento de iniciadores a 62ºC por 1min; y uno de extensión a 65ºC por 10min. Ello fue seguido por 26 ciclos cada uno con 30s a 95ºC de desnaturalización, 1min a 62ºC de alineamiento de primer y 10min a 65ºC de extensión, con un ciclo de extensión final a 65ºC por 10min.

Los productos de PCR fueron separados electroforéticamente en geles de agarosa al 1,0% y buffer TBE 1X, corridos por 4h a 120V, visualizando los fragmentos de amplificación con bromuro de etídio y se fotografiaron con una película tipo Polaroid 667.

Análisis de los datos

Para el análisis molecular de los linajes, los fragmentos de amplificación obtenidos fueron codificados como 0 y 1 para fragmentos ausentes y presentes, respectivamente. El contenido de información polimórfica (PIC) y el error estándar Bootstrap asociado a este, se utilizaron para evaluar la capacidad del iniciador en detectar el polimorfismo del locus en los linajes de P. grisea caracterizados (Anderson et al., 1993). Se calculó la probabilidad de obtener parejas idénticas de alelos por cambio de alelo en los linajes según metodología descrita por Wetton et al. (1987) y Ramakrishna et al. (1994), modificada por Demey et al. (2003).

Con los patrones generados se estudiaron las relaciones genéticas entre los linajes de P. grisea a través de la representación gráfica generada por el método no-jerarquico del Neighbor Joining (Saitou y Nei, 1987) y la disimilitud debida al coeficiente de Dice (Dice, 1945). La estabilidad de la agrupación se estudió a través del árbol de consenso generado por remuestreo (n=1000; Felsenstein, 1985; Nei y Kumar, 2000).

La equidad, calculada como Índice de diversidad de Shannon / Ln (número de especies) (Pielou, 1975) ajustada por remuestreo para n=1000 según metodología descrita por Pla (2004), es utilizada para estimar la diversidad de los linajes de P. grisea por localidad, años y para el total en estudio. El índice de equidad derivado de los vectores de frecuencias por linaje, remuestreados con reemplazo, proporciona una medida relativa de la homogeneidad en que se distribuyen los 448 aislamientos monospóricos de P. grisea dentro de los diferentes linajes y permite confrontar las localidades y determinar el sitio más caliente o hot spot site, bajo el supuesto que el menor valor del índice de equidad esta asociado a una menor diversidad o mayor concentración en alguno de los linajes presentes.

Todos los análisis se realizaron utilizando Info-Gen ver. 1 (Balzarini et al., 2003), InfoStat ver. Profesional (InfoStat, 2004), Resampling Stats ver. 5,02 (Resampling, 1999), FreeTree ver. 0.9.1.50 (Pavlicek et al., 1999) y Treeview ver. 1.6.0. (Page, 1996).

Resultados y Discusión

El método de extracción de ADN fue simple, rápido y eficiente, produciendo entre 200 y 300ng/µl de ADN de buena calidad. Los iniciadores Pot2-1 y Pot2-2 detectaron siete linajes, identificados como Ven-1, Ven-2, Ven-3, Ven-4, Ven-5, Ven-6 y Ven-7. El patrón electroforético y la identidad genética en pares de bases de los linajes venezolanos de P. grisea se muestran en la Figura 1. El contenido de información polimórfica (PIC) promedio fue de 0,2518 ±0,1191 con un valor mínimo de 0,2149 y un máximo de 0,3698; este valor máximo de PIC correspondió a los loci Pot2-125, Pot2-2008, Pot2-2019, Pot2-2322 y Pot2-2428, lo que representa más del 50% del contenido de información polimórfica del intervalo teórico de 0,01 a 0,50, por lo que estos fragmentos de amplificación pueden ser usados como referencia en subsecuentes investigaciones. El índice de similaridad promedio fue de 0,2006 ±0,0323. La probabilidad de que dos diferentes linajes venezolanos de P. grisea, usando los iniciadores Pot-2, tengan igual identidad es de 2,51x10^-16, lo que indica un alto grado de confianza en la identificación hasta de 10¹⁶ linajes comparados simultáneamente, permitiendo detectar el linaje específico de cada uno de los 448 aislamientos monospóricos de P. grisea provenientes de las muestras de hojas de las variedades comerciales, líneas experimentales, variedades foráneas y líneas diferenciadoras internacionales, sembradas entre los años 1998 y 2000.

La Figura 2 muestra las relaciones genéticas entre los linajes de P. grisea. El árbol genera tres grupos homogéneos, el primero formado por el linaje Ven-5, el segundo lo forman los linajes Ven-2, Ven-3, Ven-4 y Ven-7, y el tercero los linajes Ven-1 y Ven-6. Así mismo, se destaca la diferencia del Ven-5 respecto al resto de los linajes. La distribución de frecuencia de los linajes fue 76,34; 11,16; 5,58; 2,01; 2,23; 1,56; 1,12% para el Ven-1 al Ven-7, respectivamente. Los resultados no permiten establecer una correspondencia entre las relaciones genéticas de los linajes estudiados a través del árbol de consenso y su distribución. Aunque se destaca que en el 100% de los casos en que se construye el árbol el linaje Ven-5 se diferencia del resto, la distribución de frecuencia no muestra diferencias estadísticamente significativas (p>0,05) respecto a los linajes Ven-4, Ven-6 y Ven-7.

La Tabla I presenta las frecuencias de los linajes de P. grisea por localidad y año, y el índice de equidad asociado. Los resultados referidos al índice de equidad muestran que, con excepción del año 2000, el estado Guárico es el sitio más caliente. Este índice ajustado por la metodología del Bootstrap corrige las imperfecciones derivadas del muestreo, garantizando la calidad de los resultados obtenidos. Adicionalmente, la distribución de frecuencia observada del linaje Ven-1 es >75%, lo que disminuye la incertidumbre respecto a las frecuencias de ceros. Las localidades con índice equidad igual o cercana a 1 indican que la distribución de la probabilidad de aparición de cada linaje es constante e igual a 1/número de linajes.

Estos resultados fueron corroborados generando las diferencias necesarias para que todos los sitios tuviesen la misma frecuencia de linajes, es decir, el número de linajes que hubiesen sido necesarios para producir el mismo valor de diversidad de Shannon para cada localidad. Este análisis de "redundancia" mostró resultados similares a los obtenidos con el índice de equidad ajustado (datos no mostrados).

Estudios moleculares de diversidad genética de P. grisea con aislamientos del hongo provenientes de diferentes regiones del mundo señalan que en relación con Venezuela (7 linajes) existe menor diversidad del hongo en Brasil (Prabhu et al., 2002), Irán (Javan-Nikkhah et al., 2004), Francia, Hungría, Italia, Portugal y España (Roumen et al., 1997) y Colombia (Levy et al., 1991 y 1993); igual diversidad del patógeno en Filipinas (Zeigler et al., 1995) y mayor diversidad de P. grisea en Estados Unidos (Correl et al., 2000). Estos resultados indican que Venezuela posee una diversidad del patógeno que contribuye en forma significativa con la conformación de la referencia internacional que permitirá la selección de fuentes de resistencia para regiones productoras de arroz del mundo.

El conocimiento sobre la caracterización de las familias genéticas de P. grisea presentes en el país contribuirá de manera significativa al establecimiento de la estrategia de mejoramiento basada en la teoría de exclusión de linajes, tomando en cuenta que en cada región donde se cultiva arroz existen grupos de linajes diferentes y, por lo tanto, se deberán seleccionar progenitores que aporten genes de resistencia a dichos grupos.

La determinación del hot spot site o la localidad con mayor presión y diversidad de linajes adquiere importancia a la hora de emprender un programa de mejoramiento en la zona arrocera venezolana, ya que las localidades estudiadas presentan condiciones ambientales similares, caracterizadas por altas temperaturas, humedad relativa y diferencia entre temperaturas diurnas y nocturnas (Muñoz y Gamboa, 1998; Navas et al., 2003), condiciones que han sido reportadas como favorables a desarrollo del hongo.

El monitoreo de la evolución que conduce a cambios importantes en el espectro genético de la estructura y de la virulencia del patógeno es importante para identificar genes de resistencia y sus combinaciones, que les permitan resistir los nuevos patotipos y prevenir la interrupción de la resistencia.

Aunque no es posible predecir si la resistencia a una enfermedad es duradera o efímera, el conocimiento de la estructura genética de las poblaciones del patógeno puede ser de utilidad para hacer predicciones sobre la posibilidad de adaptación del patógeno a las variedades resistentes, lo cual es de interés antes de que éstas se siembren extensivamente. El conocimiento de los linajes de P. grisea que afectan los cultivares de arroz bajo ensayos comerciales en Venezuela es de utilidad para el establecimiento de los programas de mejoramiento tradicionales, ya que la resistencia duradera es debida a la combinación multigénica de variedades que expresan la complementariedad de la resistencia a un amplio rango de linajes del hongo.

AGRADECIMIENTOS

La investigación fue parcialmente financiada por el INIA-CENIAP y FUNDARROZ a través del proyecto: "Identificación y caracterización de razas y linajes genéticos del hongo Pyricularia grisea en Venezuela".

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