LODOS ESTABILIZADOS Y CEPAS BACTERIANAS EN LA BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS

Ismenia Araujo, Manuel Montilla, Carmen Cárdenas, Lenín Herrera, Nancy Angulo y Gustavo Morillo.

Ismenia Araujo. Licenciada en Educación, La Universidad del Zulia (LUZ), Venezuela. M.Sc. en Microbiología, Universidad de Georgia, EEUU. Profesora y Coordinadora del Laboratorio de Microbiología Industrial, Centro de Investigación del Agua de la Universidad del Zulia (CIA-LUZ), Venezuela. Dirección: CIA, Facultad de Ingeniería, Universidad del Zulia, Apartado 526. Maracaibo, Edo. Zulia, Venezuela. e-mail: ismenia_araujo@hotmail.com

Manuel Montilla. Ingeniero Agrónomo y Maestría en Ingeniería Ambiental, LUZ, Venezuela. Ingeniero de Estudios y Proyectos Ambientales, Petróleos de Venezuela, S.A.

Carmen Cárdenas. Ingeniero Químico y Maestría en Ingeniería Ambiental, LUZ, Venezuela. Profesora y Directora del CIA, LUZ, Venezuela. Venezuela. e-mail: chcarden@luz.edu.ve

Lenín Herrera. Ingeniero Químico, LUZ, Venezuela. M.Sc. en Ingeniería Ambiental y Salud, Universidad de Texas, EEUU. Profesor y Asesor, CIA-LUZ, Venezuela. e-mail: ceinvagua@luz.edu.ve

Nancy Angulo. Licenciada en Biología y Maestría en Microbiología, LUZ, Venezuela. Profesora, LUZ, Venezuela. e-mail: ceinvagua@luz.edu.ve

Gustavo Morillo. Ingeniero Agrónomo y Maestría en Ingeniería Ambiental, LUZ, Venezuela. Profesor, LUZ, Venezuela. e-mail: ceinvagua@luz.edu.ve

Resumen

La utilización de cepas bacterianas autóctonas y la aplicación de lodo estabilizado en la biorremediación de un suelo contaminado con hidrocarburo fue estudiada en suelo contaminado con petróleo del Campo Moga del Estado Zulia, Venezuela. Cepas bacterianas aisladas del suelo fueron probadas en su capacidad para degradar gasoil (factibilidad). Las cuatro cepas más eficientes integraron el cultivo mixto en un estudio de tratabilidad, donde se aplicó la técnica de compostaje utilizando lodos estabilizados de un sistema de lagunas como esponjante, en el suelo contaminado con petróleo y nitrógeno y fósforo como fertilizante durante 150 días. Se analizaron hidrocarburos totales (HCT), fracciones de hidrocarburos saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos (SARA), nitrógeno total Kjeldahl, fósforo total, y metales pesados totales, heterótrofos mesófilos, conductividad eléctrica, temperatura y pH. El lodo, suelo y lixiviado generados presentaron rangos permisibles de metales pesados totales, según la normativa ambiental vigente. Se presentaron diferencias significativas (P<0,05) en los tratamientos para las variables heterótrofos mesófilos y remoción de HCT, obteniendo los mejores promedios (Tukey) en los tratamientos que contenían, además del lodo, 15 y 10% de cultivo mixto con densidad poblacional de 27 y 19×109 UFC/ml y una remoción de HCT de 90 y 74%, respectivamente. Los tratamientos con lodo más 15 y 10% de cultivo mixto evidenciaron correlación positiva altamente significativa (P<0,001) entre la degradación de los HCT y el crecimiento bacteriano con el esponjante. Estos tratamientos presentaron la mayor remoción de las fracciones de SARA, demostrando la eficiencia de la tecnología empleada en la biorremediación de suelos contaminados con petróleo.

STABILIZED SLUDGES AND BACTERIAL STRAINS FOR BIOREMEDIATION OF OIL CONTAMINATED SOILS

Ismenia Araujo, Manuel Montilla, Carmen Cárdenas, Lenín Herrera, Nancy Angulo and Gustavo Morillo.

Summary

The utilization of native bacterial strains and application of stabilized sludges during bioremediation of a soil were studied using contaminated soil from field "Moga", Zulia state, Venezuela. Bacterial strains were isolated and evaluated in their ability for gasoil degradation (feasibility). The four most efficient oil degrading strains were used as a mixed culture in the study of oil hydrocarbon degradation. Fertilization by nitrogenous and phosphorus, stabilized sludges from a lagoon system in a carbon free source environment were utilized during 150 days. Total hydrocarbon (TPH), total Kjeldahl nitrogen, total phosphorus and metal concentrations, saturated, aromatics, resins and asphalt fractions, mesophylic heterotrophs, electric conductivity, temperature and pH were determined. Sludges, soil and lixiviate showed permissible total metal contents according to permitted environmental standards. Significant differences were obtained (P<0.05) in treatments for the mesophylic heterotrophs and TPH removal variables. The highest hydrocarbon removal averages were obtained (Tukey) on treatments containing 15 and 10% of mixed culture plus sludge. The population density values were 19 and 27x109CFU/ml for treatments with mixed culture and sludge, and a total hydrocarbon removal of 90 and 74%, respectively. These treatments showed a highly significant (P<0.001) positive correlation between the degradation of the TPH and bacterial growth with the compostage, and revealed a higher removal of saturated, aromatic, resin and asphaltene fractions, demonstrating the efficiency of the technology used in the bioremediation of oil contaminated soils.

LODOS ESTABILIZADOS E CEPAS BACTERIANAS NA BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS COM HIDROCARBONETOS

Ismenia Araujo, Manuel Montilla, Carmen Cárdenas, Lenín Herrera, Nancy Angulo e Gustavo Morillo

Resumo

A utilização de cepas bacterianas autóctonas e a aplicação de lodo estabilizado na biorremediação de um solo contaminado com hidrocarboneto foi estudada em solo contaminado com petróleo do Campo Moga do Estado Zulia, Venezuela. Cepas bacterianas isoladas do solo foram provadas na sua capacidade para degradar óleo diesel (factibilidade). As quatro cepas mais eficientes integraram o cultivo misto em um estudo de tratabilidade, onde se aplicou a técnica de compostagem utilizando lodos estabilizados de um sistema de lagoas como esponjante, no solo contaminado com petróleo e nitrogênio e fósforo como fertilizante durante 150 dias. Analisaram-se hidrocarbonetos totais (HCT), frações de hidrocarbonetos saturados, aromáticos, resinas e asfaltenos (SARA), nitrogênio total Kjeldahl, fósforo total e metais pesados totais, heterótrofos mesófilos, condutividade eléctrica, temperatura e pH. O lodo, solo e lixiviado gerados apresentaram níveis permissíveis de metais pesados totais, segundo a normativa ambiental vigente. Apresentaram-se diferenças significativas (P<0,05) nos tratamentos para as variáveis heterótrofos mesófilos e remoção de HCT, obtendo as melhores médias (Tukey) nos tratamentos que continham, além do lodo, 15 e 10% de cultivo misto com densidade populacional de 27 e 19×109 UFC/ml e uma remoção de HCT de 90 e 74%, respectivamente. Os tratamentos com lodo mais 15 e 10% de cultivo misto evidenciaram correlação positiva altamente significativa (P<0,001) entre a degradação dos HCT e o crescimento bacteriano com o esponjante. Estes tratamentos apresentaram a maior remoção das fraçðes de SARA, demonstrando a eficiência da tecnologia empregada na biorremediação de solos contaminados com petróleo.

PALABRAS CLAVE / Biotratamiento / Cepas Autóctonas / Compostaje / Contaminación / Hidrocarburos /

Recibido: 08/03/2005. Modificado: 11/01/2006. Aceptado: 16/01/2006.

 

Introducción

La industrialización en el mundo ha causado numerosos problemas de contaminación de suelos y aguas. En el caso de la industria petrolera, ésta produce gran cantidad de desechos con contenidos de hidrocarburos, los cuales es necesario que sean dispuestos (Eweiss et al., 1999) en sitios seguros como fosas de almacenamiento o recipientes especiales para su disposición temporal, hasta que sean reutilizados o tratados. Los accidentes en la industria petrolera, como rupturas de tuberías y naufragios, originan derrames de petróleo sobre los ecosistemas terrestres y marinos, causan procesos de contaminación y afectan las propiedades fisicoquímicas y los componentes biológicos de los ecosistemas. Estos accidentes impiden el aprovechamiento de los recursos naturales afectados, ya que son alterados los procesos productivos o se modifica directamente el hábitat de especies y la estética del paisaje natural (Levin y Gealt, 1997, Eweis et al., 1999).

La biorremediación o biotratamiento permite la recuperación de sitios (suelos o aguas) contaminados. Para que este proceso se realice de manera exitosa, es necesario que los microorganismos que llevan a cabo la degradación de los hidrocarburos utilicen el carbono del contaminante como fuente de energía, para lo cual se requiere de condiciones fisicoquímicas óptimas (La Grega et al., 1996).

En este trabajo se evaluó la utilización de un cultivo mixto de cepas bacterianas aplicado en diferentes concentraciones (5, 10 y 15% de la mezcla total) y el uso de lodos estabilizados como esponjante, en la degradación de suelos contaminados con petróleo.

Materiales y Métodos

La investigación consistió de cuatro etapas: aislamiento de cepas bacterianas degradadoras de hidrocarburos, ensayo de factibilidad, ensayo de tratabilidad y análisis estadístico de los resultados.

Aislamiento de las cepas bacterianas

Para el aislamiento de las cepas bacterianas degradadoras de hidrocarburos se tomaron al azar muestras de suelo afectado por un derrame de petróleo en el Campo Moga, municipio Mara, estado Zulia, Venezuela (Pozo DM43). Las muestras fueron trasladadas en bolsas refrigeradas y selladas herméticamente al laboratorio. El aislamiento de cepas del suelo contaminado con petróleo se realizó a partir de una muestra inicial de 10g de suelo diluida en 90ml de infusión cerebro-corazón, BHI (Himedia® M210). El BHI es un medio estandarizado y enriquecido, conteniendo (en g/l) infusión de cerebro (200), de corazón (250), peptona (10), Na3PO4 (2,5), NaCl (5) y dextrosa (2). Las colonias aisladas fueron refrigeradas a 4ºC en tubos de agar nutritivo inclinado (MacFaddin, 1980; Kerr, 1981). La morfología de las cepas aisladas se determinó con base en la caracterización macromorfológica sugerida por Seeley y Vandemark (1973) y por Kerr (1981). La micromorfología de cada cepa se determinó utilizando la tinción de Gram en cultivos de 48h (Kerr, 1981; Madigan et al., 2000). También se aplicó una serie de pruebas bioquímicas, tales como crecimiento en agar triple azúcar hierro (TSI), utilización del citrato, utilización del triptofano o indol, prueba de la ureasa, prueba del rojo de metilo, prueba de Voges-Proskauer, prueba de la oxidasa y prueba de la catalasa (MacFaddin, 1980; Madigan et al., 2000).

Ensayo de factibilidad

Las cepas bacterianas aisladas y activadas fueron transferidas a un medio de cultivo fresco de Tripticasa Soya (TSB; Himedia® M290). El TSB es un medio estandarizado, enriquecido (en g/l) con hidrolizados enzimáticos de caseína de soya (17), carne (3), NaCl (5), K2HPO4 (2,5) y dextrosa (2,5), e incubadas hasta alcanzar una densidad poblacional de 1×108 UFC/mL (Kerr, 1981; APHA, 1998). Los cultivos fueron amplificados por transferencia a volúmenes mayores. Cada cepa bacteriana fue inoculada en un matraz de 250ml, con 97% de medio mínimo mineral (MMM) compuesto (en g/l) por NH4Cl (1), KNO3 (2), CaCl2.6H2O (0,0005), Na2SO4 (2), MgSO4 (1), K2HPO4 (0,5), FeSO4.7H2O (0,001) propuesto por Jobson (1975), 2% v/v de gasoil y 1% v/v del inóculo bacteriano con su respectivo testigo no inoculado. La fuente de carbono fue suministrada por el gasoil. Los matraces se colocaron en una incubadora New Brunswick, modelo 625, donde se mantuvieron a 37ºC y en incubación a 120rpm por 5 semanas, período durante el cual se realizaron los análisis microbiológicos y fisicoquímicos determinando los heterótrofos mesófilos mediante la técnica de placa vertida (APHA, 1998) y la cantidad de hidrocarburos totales presentes (HCT) por el método 5520-F (APHA, 1998). Estos parámetros permitieron seleccionar las cepas más eficientes en la degradación de hidrocarburos del gasoil (Araujo et al., 2004). Se tomaron porciones equivalentes de cada cepa bacteriana seleccionada y se agregaron en un matraz para formar el cultivo mixto.

Ensayo de tratabilidad

Se establecieron 16 unidades experimentales, cada una conformada por un recipiente plástico de 50 litros de capacidad, perforado en el fondo, con una capa de grava y colocado sobre otro recipiente donde se recolectaba el material lixiviado, el cual fue considerado en el cálculo de la remoción de los parámetros. Cada unidad contenía un total de 20kg de la mezcla a la cual se le aplicó el tratamiento con lodo estabilizado y cultivo mixto en tres concentraciones. Se establecieron dos unidades experimentales para cada tratamiento. Se aplicó riego cada 3 días, para mantener el porcentaje de humedad requerido de 40-60%, determinado por el método 2540-B (APHA, 1998). Se mantuvo el contenido de O2 en las unidades experimentales mediante la mezcla mecánica y continua del suelo de forma manual (Eweis et al., 1999). Las características del tratamiento en cada unidad experimental se muestran en la Tabla I. Por ejemplo, la composición de LCM5%, fue de suelo contaminado con petróleo + lodo estabilizado + 5% de cultivo mixto, y a los testigos (SP y SPL) no le fue añadido cultivo. Se realizó una caracterización fisicoquímica del suelo contaminado con petróleo y de la mezcla del mismo con el lodo estabilizado, así como del lixiviado generado. Los parámetros fisicoquímicos y biológicos y los métodos utilizados se presentan en la Tabla II (APHA, 1998). Los heterótrofos mesófilos, HCT, pH, temperatura y conductividad eléctrica se determinaron cada 30 días, desde el inicio (t1) y durante un tiempo de 150 días (t6). Las determinaciones de las fracciones de saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos (SARA) se evaluaron al inicio (t1) a los sesenta días (t3) y al final del ensayo (t6). Los cloruros, N total y P total se evaluaron al inicio y al final del ensayo, mientras que la evaluación de los metales pesados totales se realizó solo al inicio del ensayo (APHA, 1998).

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de los resultados se siguió la metodología establecida en SAS (2002). Se evaluaron 2 modelos estadísticos; en el caso del ensayo de factibilidad, el diseño experimental fue en bloques al azar con arreglo de tratamiento en parcelas subdivididas en el tiempo, y el modelo estadístico en el ensayo de tratabilidad fue un diseño experimental de bloques al azar con arreglo factorial en parcelas divididas en el tiempo. Debido a los costos de la investigación, se realizaron 2 réplicas o repeticiones. Según Kuelh (2001) el costo de la conducción de un ensayo es un factor primordial para la determinación del número de réplicas. Se realizó el análisis de varianza (ANOVA), las pruebas de medias según Tukey y el coeficiente de correlación de Pearson para el grado de asociación entre las variables estudiadas.

En el diseño experimental se calculó la estadística descriptiva a los valores obtenidos en las variables estudiadas, entre las que destacan las pruebas de normalidad o prueba analítica, se verificó los supuestos del análisis de varianza. Las pruebas (SAS, 2002) de Kurtosis y Skewness (simetría), Shapiro-Wilk, Kolmogorov-Smirnov (normalidad - prueba de hipótesis), evaluaron la distribución de las observaciones, coeficientes de variación, la distribución normal, pruebas de hipótesis, y pruebas de ploteo o probabilidad normal.

Resultados y Discusión

Aislamiento y caracterización de las cepas

Se obtuvieron 28 cepas bacterianas aisladas, las cepas mas eficientes en la degradación del gasoil fueron seleccionadas para conformar el cultivo mixto. Un total de siete cepas fueron seleccionadas y se denominaron MI-4, MI-6, MI-10, MI-23, MI-33, MI-36 y MI-38, cuyas características macromorfológicas y micromorfológicas se presentan en la Tabla III. Esta nomenclatura se basó en las siglas del Laboratorio de Microbiología Industrial del Centro de Investigación del Agua de la Universidad del Zulia.

Ensayo de factibilidad

Los valores de heterótrofos mesófilos máximos y mínimos alcanzados por las cepas bacterianas al inicio del ensayo (t1) estuvieron entre 1,1×108 y 2,1×106 UFC/ml, respectivamente. Los mayores títulos de crecimiento fueron alcanzados por las cepas MI-10, MI-23, MI-33 y MI-38. Todas las cepas disminuyeron gradualmente su densidad poblacional a medida que avanzó el ensayo, posiblemente debido al agotamiento progresivo de la fuente de carbono (gasoil); disminución de nutrientes (N, P). Resultados similares fueron obtenidos por Araujo et al. (2004), quienes evaluaron cepas bacterianas en ensayos de factibilidad, obteniendo diferencias significativas en las cepas evaluadas, con promedios de crecimiento al final del ensayo de 1×106 UFC/ml.

Durante los primeros siete días de la evaluación se observó una ligera disminución del contenido de los hidrocarburos totales (HCT); fue el período de adaptación de las cepas al sustrato (gasoil), y luego disminuyó de manera significativa (Figura 1). A los 35 días las cepas MI-38, MI-23, MI-10 y MI-33 lograron una disminución en los promedios de HCT de 11137, 13693, 14521 y 15292mg/kg, con un porcentaje de remoción de 79, 51, 39 y 38%, respectivamente; mientras que las cepas MI-4, MI-6, MI-36 y el tratamiento testigo presentaron mayores promedios de HCT (17086, 16558, 15781 y 18522mg/kg, con remoción de 19, 26, 29 y 1%, respectivamente) indicando que estas cepas degradaron menor cantidad de HCT (Tabla IV). Se realizó el análisis de varianza, obteniendo diferencias altamente significativas (P<0,001) entre las cepas evaluadas. El análisis de varianza agrupa las cepas de la siguiente manera: MI-38 difiere significativamente (P<0,05) del resto de las cepas; por su parte MI-10, MI-23 y MI-33, así como MI-4, MI-6 y MI-36 presentan diferencias significativas (P<0,05) en relación a las otras cepas.

La Figura 2 muestra el porcentaje de remoción de HCT durante los 35 días de evaluación, mostrando diferencias significativas (P<0,05). Las cepas MI-38, MI-23, MI-10 y MI-33 produjeron la mayor remoción, con valores de 79, 51, 39 y 38%, respectivamente, lo que indica que fueron las más eficientes en la degradación del gasoil. La remoción se correlacionó mediante el coeficiente de Pearson (P<0,001) de manera directamente proporcional con el crecimiento bacteriano, ya que estas cepas presentaron los mayores promedios de UFC/ml. Las cepas: MI-4, MI-6 y MI-36 presentaron los menores porcentajes de remoción, con 19, 26 y 29%, respectivamente, lo cual fue proporcional a los valores de crecimiento alcanzados por las mismas cepas. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Araujo et al. (2004), quienes reportaron porcentajes de remoción de hidrocarburos totales en pruebas de factibilidad llevadas a cabo en períodos de 20 y 120 días de incubación, obteniendo porcentajes de remoción de 90 y 89%, respectivamente. Con base en estos resultados se seleccionaron las cepas más eficientes, MI-38, MI-23, MI-10 y MI-33, para conformar el cultivo mixto.

Ensayo de tratabilidad

Caracterización fisicoquímica del suelo y lodo estabilizado. La Tabla V muestra los resultados obtenidos en el análisis fisicoquímico del suelo utilizado. El suelo posee textura franca con predominancia de arenas, con buena permeabilidad y bien estructurado, con pH ligeramente ácido, y contenidos bajos de materia orgánica y, por ende, bajos contenidos de N y P. También se observó bajo contenido de Al. El suelo presentó una conductividad eléctrica baja, indicativo de bajos contenidos de sales. La mezcla suelo-lodo estabilizado presentó un pH cercano a la neutralidad, ligeramente ácido, con altos contenidos de materia orgánica, factor importante para el mejoramiento de la estructura del suelo, y para el suministro de nutrientes por el alto contenido N y P.

Las Tablas VI y VII muestran el contenido de metales totales en el suelo contaminado con hidrocarburo, en la mezcla suelo contaminado con lodo estabilizado y en los lixiviados en el tiempo inicial. Los valores obtenidos, al ser comparados con la normativa ambiental venezolana (Gaceta Oficial, 1998) se encontraron dentro de los rangos máximos permitidos conforme al Artículo 53 de la misma; por lo tanto, se puede decir que los microorganismos no se vieron afectados por el contenido de metales, lo que se comprueba por el crecimiento que alcanzaron los mismos en el transcurso del ensayo.

El contenido de hidrocarburos totales para suelo contaminado y lixiviados estuvo por debajo del 10%, valor estipulado en el Art. 53 del Decreto 2635 (Gaceta Oficial, 1998) para dar comienzo a un biotratamiento. Por encima de este valor, el hidrocarburo puede causar la lisis o ruptura de la membrana celular, ocasionando la muerte de los microorganismos (Levin y Gealt, 1997; Eweis et al., 1999).

Heterótrofos mesófilos. En la Figura 3 se observa el comportamiento de las curvas de crecimiento en todos los tratamientos evaluados. Se aprecia que el grupo de los tratamientos con lodo estabilizado en su composición (LCM15%, LCM10%, LCM5%) siempre estuvieron por encima del grupo sin lodo en su composición (CM15%, CM10%, CM5%) y de los tratamientos sin cultivo mixto (SPL y SP). Al inicio del ensayo la mayoría de los tratamientos tuvieron valores de densidad poblacional cercanos a 1×108 UFC/ml, y al final del ensayo, transcurridos 150 días, los títulos bacterianos se incrementaron alcanzando valores máximos y mínimos de 15×1011 y 2×109 UFC/ml. Wrenn (1994) utilizó un cultivo mixto conformado por cepas degradadoras de hidrocarburos, probaron su eficiencia en la degradación de crudo liviano en un medio acuático y cuantificaron poblaciones hasta de 1×108 UFC/ml al final del ensayo. Así mismo, Ijah (2003) reportó valores entre 14×105 y 4×106 UFC/ml en poblaciones microbianas utilizadas en la recuperación de suelos contaminados con aceites.

El análisis de varianza mostró para los heterótrofos mesófilos diferencias altamente significativas (P<0,001) entre los tratamientos evaluados. Los mayores promedios de crecimiento de heterótrofos mesófilos se encontraron en los tratamientos LCM15% y LCM10%, con lodo y cultivo mixto en proporciones de 15 y 10% respectivamente, con valores de 27×109 y 19×109 UFC/ml, respectivamente (Tabla VIII). Según la prueba de medias de Tukey, dichos valores difieren significativamente (P<0,05) con el resto de los tratamientos. El tratamiento LCM5%, presentó un promedio de densidad poblacional de 8×109 UFC/ml, inferior a los promedios de los tratamientos LCM15% y LCM10%, pero superior a los promedios de los tratamientos CM5%, CM10% y CM15%, de: 1; 3; y 3×109 UFC/ml, respectivamente. Estos tratamientos, a pesar de tener cultivo mixto en proporciones 5, 10 y 15% v/p respectivamente, no tenían el lodo estabilizado, factor que en el caso del primer grupo de tratamientos produjo un efecto positivo en el crecimiento bacteriano. Los tratamientos SP y SPL, sin inóculo bacteriano, presentaron los menores promedios de crecimiento, con densidades poblacionales promedio de 2 y 4×107 UFC/ml.

Según el coeficiente de Pearson, existe una correlación positiva altamente significativa (P<0,001) entre el contenido de lodo estabilizado, el crecimiento bacteriano y el porcentaje de cultivo mixto aplicado a los tratamientos, demostrando que el incremento de los valores de crecimiento bacteriano están asociados al contenido de lodos y al porcentaje de cultivo mixto aplicado.

Hidrocarburos totales. La Figura 4 muestra la degradación de los HCT en las unidades experimentales evaluadas. Se aprecia que en los primeros 30 días la pendiente fue más pronunciada en la mayoría de los tratamientos, debido a que inicialmente ocurre la degradación de las fracciones menos complejas, y más fáciles de degradar; posteriormente ocurre la degradación de las fracciones más recalcitrantes.

Los tratamientos LCM15% y LCM10% presentaron los menores contenidos de HCT a los 150 días, de 3865 y 8441mg/kg respectivamente, valores que se encuentran dentro de lo exigido por la normativa ambiental (Gaceta Oficial, 1998).

Al realizar el análisis de varianza para esta variable se encontraron diferencias altamente significativas (P<0,001) entre los tratamientos evaluados. Los resultados de los HCT obtenidos muestran diferencias significativas (P<0,05) según la prueba de medias de Tukey, lográndose el mayor porcentaje de remoción de HCT en el tratamiento LCM15% con 90% (Figura 5). Se encontró una correlación positiva y altamente significativa, demostrada con el coeficiente de Pearson (P<0,001) entre la adición del esponjante, el porcentaje de cultivo mixto y la degradación del hidrocarburo, la cual se presenta de manera directamente proporcional, ya que este mismo tratamiento presentó el mayor título de crecimiento bacteriano con un promedio de 3×1010 UFC/ml, aspecto que explica la acción degradadora del cultivo mixto sobre el hidrocarburo presente en el suelo.

La adición del esponjante también favoreció el proceso de degradación mejorando las condiciones del suelo (aire, retención de humedad, temperatura, nutrientes entre otros) tal como lo señalan Acosta e Infante (1995) en un estudio donde evaluaron el efecto de lodos estabilizados sobre el suelo, encontrando efectos significativos (P<0,05) en cuanto a la mejora de las propiedades fisicoquímicas del suelo evaluado (aireación, humedad, nutrientes, y temperatura), factores que pueden potenciar el proceso de biodegradación. El tratamiento LCM10% presentó un porcentaje de remoción de 74%, superior al LCM5% que presentó una remoción de 54%. La dosis de cultivo mixto aplicada en este tratamiento resultó insuficiente para degradar de manera significativa el hidrocarburo presente en el suelo (Figura 5).

Los primeros 30 días de biotratamiento la remoción del hidrocarburo alcanzó promedios superiores al 35%, como se observó en los tratamientos LCM15% y LCM10%, respectivamente. En este sentido, Yerushalmi (2003), al evaluar la capacidad de degradación de hidrocarburos provenientes del petróleo mediante bioestimulación, logró la remoción del 49% de HCT en los primeros 40 días de tratamiento, degradando a los 120 días un 83% de los HCT presentes en el suelo. Los tratamientos CM5%, CM10% y CM15%, también presentaron diferencias altamente significativas, encontrando porcentajes de remoción de 43, 39 y 30% respectivamente, promedios que fueron menores a los presentados por los tratamientos LCM5%, LCM10% y LCM15%. El coeficiente de correlación de Pearson (P<0,001) permitió determinar que la presencia del cultivo mixto y el lodo estabilizado están asociados al crecimiento bacteriano y a la degradación del petróleo presente en el suelo.

Saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos. En la Tabla IX se observan los resultados obtenidos en el caso de la variable saturados, expresados en mg/kg, así como el porcentaje de remoción obtenido al final del ensayo transcurridos 150 días de evaluación. Al realizar el análisis de varianza se encontraron diferencias altamente significativas (P<0,001) entre los tratamientos evaluados. La prueba de medias de Tukey indica diferencias significativas (P<0,05), presentando el mayor porcentaje de remoción de fracciones saturadas en el tratamiento LCM15%, con una remoción de 92%, seguidos de los tratamientos: LCM10% y LCM5%.

Los tratamientos LCM15%, LCM10% y LCM5%, contenían cultivo mixto además del lodo estabilizado, aspectos que correlacionan positivamente según el coeficiente de Pearson (P<0,001), indicando que las variables heterótrofos mesófilos, contenido de lodos, y remoción de saturados, se encuentran asociados de manera directamente proporcional.

Westlake (1993) demostró que las fracciones saturadas y aromáticas sencillas contenidas en una muestra de crudo eran degradadas por microorganismos autóctonos de aguas contaminadas con los mismos, cuando se les adicionó N y P. En cambio, sin el suplemento de nutrientes los saturados eran degradados más rápidamente que los aromáticos. Las fracciones de saturados son las más fáciles de degradar por tener una estructura química más sencilla.

La Figura 6 muestra que los tratamientos CM15%, CM10% y CM5% presentaron porcentajes de remoción de fracciones de saturados de 59, 55 y 46%, respectivamente, valores inferiores a los encontrados en los tratamientos LCM15%, LCM10% y LCM5%. El tratamiento LCM15% resultó ser el que tuvo mayor remoción; a los primeros 60 días la remoción fue 56%, lo que coincide con lo reportado por Ward (2003), quien obtuvo remociones de saturados del 50% en 14 días de tratamiento.

En lo que respecta a los aromáticos I (compuestos que presentan entre 1 y 3 anillos aromáticos en su estructura) y los aromáticos II (compuestos con más de 3 anillos aromáticos en su estructura), estas fracciones pueden ser biodegradadas con facilidad después de los saturados (Tabla X) dependiendo del grado de complejidad de los hidrocarburos que lo conforman (Westlake, 1993). En este estudio se encontraron diferencias significativas según la prueba de Tukey (P<0,05) en el porcentaje de remoción de estas fracciones en los tratamientos evaluados. La remoción de aromáticos I y II fue más eficiente en el tratamiento LCM15%, con promedios de 88 y 94%, seguidos del LCM10% con remociones de 73 y 87% respectivamente, y el LCM5% con remociones del 53 y 76%, respectivamente, en los 150 días de evaluación.

Según el coeficiente de Pearson existe una correlación indirectamente proporcional altamente significativa (P<0,001) que indica que a medida que se remueven más aromáticos II, la remoción de aromáticos I se hace menor, ya que tanto las resinas como los aromáticos II, pueden ser trasformadas en fracciones de aromáticos I, manteniéndose estable el promedio de este último. En este sentido, Ward (2003) señala que las fracciones de aromáticos se incrementaban considerablemente, indicando que los microorganismos se inclinaron más por las fracciones saturadas y resinas, transformándolos en otros compuestos.

Otro aspecto a considerar en este estudio fue el hecho de que el menor porcentaje de remoción de aromáticos I y II fue encontrado en los tratamientos CM5%, SP y SPL, los cuales no presentaron diferencias significativas, obteniendo resultados muy similares a pesar de que el CM5% contenía cultivo mixto en proporción del 5%, convirtiéndolo en un tratamiento de poca efectividad (Figura 7).

Los valores de remoción de las resinas y asfaltenos, según la prueba de medias de Tukey fueron significativos (P<0,05), encontrando los mayores valores de remoción en los tratamientos LCM15%, LCM10% y LCM5%, con porcentajes de remoción en el caso de las resinas de 81, 56 y 18%, respectivamente, y una remoción de asfaltenos de 63, 51 y 39%, respectivamente. Este último se considera una de las fracciones más difícil de degradar; sin embargo, se han obtenido buenos resultados en la remoción de estas fracciones, tal como lo señalan Ward (2003) y Pineda y Howard (2001), quienes obtuvieron remociones de asfaltenos del 21 y 35%, respectivamente, usando consorcios bacterianos.

Los tratamientos CM5%, CM10%, CM15% y SP, conteniendo el cultivo mixto con las concentraciones de 5, 10 y 15% respectivamente y con suelo contaminado con petróleo mostraron un incremento en la fracción de resinas, se encontraron valores de 52, 46, 41 y 22%, respectivamente. En cambio el tratamiento SPL, suelo contaminado con petróleo y lodo, a pesar de no tener cultivo mixto presentó remoción del 13% de las mismas, ya que los microorganismos presentes en el suelo están capacitados para degradar esas fracciones, por estar en contacto previo con el contaminante (Figura 8). En estos tratamientos hubo remoción de asfaltenos de manera significativa, los cuales fueron transformados en otras fracciones, incrementando la fracción de las resinas. Estos resultados coinciden con los de Walker y Colwell (1976) quienes reportaron la degradación de asfaltenos en un 45% pero con incrementos de la fracción de resinas.

Nitrógeno y fósforo. La Tabla XI muestra los resultados obtenidos en la determinación de las concentraciones totales de N y P. El análisis de varianza reveló diferencias altamente significativas entre los tratamientos (P<0,001), tanto para la variable N como el P; sin embargo, al realizar la prueba de medias de Tukey, en ambos casos los valores promedios de N y P de los tratamientos LCM5%, LCM10%, LCM15% y SLP no presentaron diferencias significativas entre ellos (P<0,05), pero si mostraron diferencias con respecto a los tratamientos CM5%, CM10%, CM15% y SP. Al analizar el coeficiente de Pearson se encontró un coeficiente de correlación altamente significativo (P<0,001) entre el contenido de lodos y el contenido de N y P, indicando que los tratamientos con contenidos de lodos presentan mayor cantidad de estos nutrientes.

Por otra parte, se observó que los contenidos totales de N y P tienden a disminuir significativamente a medida que trascurre el tiempo. En este sentido, el porcentaje de remoción promedio de N y P al final del ensayo fue mayor en los tratamientos que contenían lodo LCM5%, LCM10%, LCM15% y SLP, con cultivo mixto y suelo con petróleo; con 40, 64, 67 y 44% de remoción del N y 42, 48, 55 y 36% de remoción de P, respectivamente, con respecto a los tratamientos CM5%, CM10%, CM15% y SP, solo con cultivo mixto y suelo con petróleo. En los tratamientos con lodo la actividad microbiana fue mayor en la degradación de los HCT, necesitando una mayor cantidad de estos nutrientes para llevar a cabo el proceso metabólico.

Conductividad eléctrica, temperatura y pH. Los mayores valores de conductividad eléctrica se encontraron en los tratamientos LCM5%, LCM10%, LCM15% y SLP, los valores fueron 935, 859, 877, y 848µS/cm, respectivamente, indicando que estos tratamientos presentaron el mayor contenido de sales, situación correlacionada con las sales que presentan los lodos estabilizados. El contenido de sales se encontró en rangos permisibles al compararlo con el Decreto 2635 (Gaceta Oficial, 1998), el cual establece un límite máximo de 3500µS/cm para la aplicación de este tipo de tratamientos.

La temperatura estuvo entre 27 y 30ºC, con promedios de 28 y 29ºC en los tratamientos, rango de temperatura que beneficia la actividad metabólica de la mayoría de los microorganismos. Los tratamientos que contenían lodos presentaron los mayores promedios de temperatura, debido a que el compostaje con cualquier tipo de materia orgánica eleva la temperatura del medio incrementando la actividad metabólica de los organismos presentes (La Grega et al., 1996).

Los valores de pH encontrados estuvieron entre 5,6 y 7,2. El contenido de materia orgánica que los lodos poseen y la actividad metabólica de las bacterias ocasionan acidificación del medio, por la producción de ácidos orgánicos y de CO2. Estos resultados coinciden con los de La Grega et al. (1996), quienes señalan que la acción de los microorganismos puede alterar los valores de pH, disminuyéndolo. Así mismo, Margesin y Schinder (2001) observaron disminución del pH de 8 a 7 en el transcurso de 22 días de evaluación; sin embargo, se obtuvieron valores de remoción de hidrocarburos del 70%. Acosta e Infante (1995) utilizaron lodo estabilizado para mejorar las características de suelos y observaron disminución del pH de 8,9 a 8,5; sin embargo, esto no afectó significativamente el crecimiento bacteriano ni la remoción de hidrocarburos.

Conclusiones

Las cepas bacterianas MI10, MI23, MI33 y MI38 fueron las más eficientes en la degradación del gasoil con una remoción máxima de 79% en 35 días. Esto sugiere que las bacterias utilizan el carbono como fuente de energía. Los tratamientos donde se utilizó el lodo ofrecieron una mayor eficiencia en la degradación de los hidrocarburos que aquellos sin lodo, debido a que su presencia favoreció la actividad bacteriana, lográndose remociones de 90% de los hidrocarburos presentes en el tratamiento LCM15% en 150 días. Esta tecnología de biorremediación puede ser una alternativa de elección para el saneamiento de suelos impactados con petróleo u otros contaminantes.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad del Zulia por el apoyo financiero a través del Proyecto CC-0447-04, al Centro de Investigación del Agua por el cofinanciamiento aportado y a Larry Lugo por su apoyo en el diseño estadístico.

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