Receptividade do estigma e ajuste de protocolo para germinacão  in vitro de grãos de pólen de citros

José Darlan Ramos, Moacir Pasqual, Leila Aparecida Salles, Edvan Alves Chagas e Rafael Pio

José Darlan Ramos. Engheneiro Agrônomo e D.Sc., Universidade Federal de Lavras (UFLA), Brasil. Professor, UFLA, Brasil. e- mail: darlan@ufla.br.

Moacir Pasqual. Engheneiro agrônomo e D.Sc., Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz - Universidade de São Paulo (ESALQ-USP), Brasil. Profesor, UFLA, Brasil.

Leila Aparecida Salles. Engheneiro Agrônomo e Doutoranda, UFLA, Brasil. e-mail: leilapio@ufla.br

Edvan Alves Chagas. Engheneiro Agrônomo e D.Sc., Universidade Estadual do São Paulo, Brasil. Pesquisador, Centro APTA Frutas. Endereço: Instituto Agronômico-IAC. Av. Luiz Pereira dos Santos, nº 1500, Corrupira, CEP. 13214-820, Jundiaí-SP, Brasil. e-mail: echagas@iac.sp.gov.br

Rafael Pio. Engheneiro Agrônomo e D.Sc., ESALQ-USP. Professor, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Brasil. e-mail: rafaelpio@unioeste.br

RESUMO

Dados sobre a viabilidade e a germinação de grãos de pólen são fundamentais para o sucesso das hibridações controladas realizadas a campo. Objetivou-se estudar o período de receptividade dos estigmas de flores de citros em diferentes estádios e ajustar protocolo para a germinação in vitro dos grãos de pólen. Foram realizados seis experimentos com a finalidade de definir o melhor estágio para coleta e realização das polinizações e estabelecer o valor de pH, a concentração ideal de sacarose, cálcio e boro, e a temperatura para germinação de grãos de pólen. Para as variedades de laranja doce Pêra, Natal e Valência, a polinização manual pode ser realizada utilizando-se flores no estádio "balão". Para germinação dos grãos de pólen das variedades Natal, Pêra e Valência, o meio deve ser constituído de 100g·l^-1 de sacarose, 800mg·l^-1 de cálcio, 200mg·l^-1 de ácido bórico e pH 6,5, exceção da variedade Pêra cuja germinação foi maior em pH 5,0. A temperatura de 25ºC proporcionou maior porcentagem de germinação do grão de pólen para todas as variedades.

Stigma receptivity and in vitro citrus pollen grains germination protocol  adjustment

SUMMARY

Data about the viability and germination of pollen grains are essential for the success of on-field controlled hybridizing. The purpose of this work was to study the stigmas receptivity period of citrus flowers under different stages and adjust the protocol to the in vitro pollen grain germination. Six essays were carried out with the aim to define the stages for collection and pollinizations, and to establish the pH and ideal sucrose, agar, calcium and boron concentrations, and temperature, for germination. For the Pêra, Natal and Valência sweet orange varieties, manual pollinization can be performed using flowers at the "balloon" stage. For the pollen grains germination of the Natal, Pêra and Valência varieties, the medium should be made of 100g·l^-1 sucrose, 800mg·l^-1 calcium, 200mg·l^-1 boric acid and pH= 6.5, exception made of the Pêra variety, whose germination was better at pH 5.0. A temperature of 25ºC provided the best percentage of germinated pollen grains for all varieties.

Receptivadad del estigma y ajuste del protocolo para la germinación in vitro de granos del polen en cítricos

Resumen

Datos sobre viabilidad y germinación de granos del polen son básicos para el éxito de los cruzamientos controlados retirados en campo. Se estudió el período de receptividad de los estigmas de flores de cítricos en diversos estadios y ajustar un protocolo para la germinación in vitro de los granos de polen. Se realizaron seis experimentos con el propósito de definir el período óptimo de colecta, realización de las polinizaciones y para establecer el valor del pH, la concentración ideal de sacarosa, calcio, boro y la temperatura para la germinación de los granos de polen. Para las variedades de naranjas dulce ‘Pêra’, ‘Natal’ y ‘Valência’, la polinización manual se puede llevar a cabo con la utilización de flores en el estadio "globo". Para la germinación de los granos de polen de las variedades Pêra, Valência y Natal el medio debe estar constituido de 100g·l^-1 de sacarosa, 800mg·l^-1 de calcio, 200mg·l^-1 de ácido bórico y pH 6,5, con excepción de la ‘Pêra’ cuya germinación fue mayor en pH 5,0. La temperatura de 25ºC proporcionó al mayor porcentaje de germinación de granos de polen para todas las variedades.

PALAVRAS CHAVE / Citrus / Meio de Cultura / Palinologia / Reagentes /

Recebido: 24/04/2007. Modificado: 01/11/2007. Aceito: 02/11/2007.

Introdução

Informações sobre viabilidade e desenvolvimento de grãos de pólen são fundamentais para trabalhos de biologia reprodutiva e melhoramento genético de citros, pois permitem obter maior sucesso nos cruzamentos controlados, que tem como objetivo gerar novos híbridos e/ou aumentar a variabilidade genética (Flanklin et al., 1995). Neste sentido, pesquisas têm sido conduzidas a fim de estabelecer e padronizar meios de cultura e condições ambientais para avaliar a germinação e estimar a viabilidade de pólen em diferentes espécies (Lorenzon e Almeida, 1997; Nunes et al., 2001). Diversos fatores como pH, concentrações de sacarose, cálcio, boro, ágar e temperatura, dentre outros, influenciam na germinação de grãos de pólen.

O pH é um fator crítico e muito importante do meio de cultura, influenciando na disponibilidade de nutrientes, fitorreguladores e no grau de solidificação do agar (Pasqual et al., 2002). Se bem ajustado, o pH pode promover maior e melhor aproveitamento dos nutrientes pelo explante, sendo que valores entre 5,0 e 6,5 proporcionam os melhores resultados na maioria das culturas in vitro (Pierik, 1987; Chagas et al., 2006a).

A adição de sacarose ao meio de cultura proporciona equilíbrio osmótico entre grão de pólen e solução de germinação e fornece energia para o processo de desenvolvimento do tubo polínico. O mecanismo de ação do boro consiste em interagir com a sacarose e formar um complexo ionizável sacarose-borato, o qual reage mais rapidamente com as membranas celulares (Askin et al., 1990).

O cálcio propicia características fisiológicas como tubo polínico e grãos de pólen com menor sensibilidade a variações do meio básico, menor permeabilidade do tubo polínico, crescimento do mesmo com forma linear e aparência rígida (Bhojwani e Bhatnagar, 1974).

A necessidade de adição de cálcio e boro no meio de cultura para a germinação de grãos de pólen depende, entre outros fatores, da espécie e da variedade. Em nectarineira, a adição de cálcio e boro foi limitante para a germinação (Chagas et al., 2006a). Já para nespereira (Cavallari et al., 2006) e pereira (Freitas et al., 2006a) constatou-se que o requerimento de cálcio e boro depende da variedade.

Em relação à concentração do ágar utilizado para solidificar o meio de cultura, respostas na germinação de grãos de pólen variam também de acordo com a espécie. Para algumas espécies, germinam melhor em meio com maior concentração de ágar (Freitas et al., 2006b), já outras, necessitam de quantidades menores (Chagas et al., 2006b).

A temperatura é outro fator de significativa influência na germinação de pólen. Silva (1996) estudou diferentes temperaturas para germinação de pólen de maracujazeiro, 20, 24, 25 e 28ºC, obtendo melhores resultados com 28ºC. Resultado similar também foi verificado para pereira (Chagas et al., 2006b) e pessegueiro (Chagas et al., 2006c).

Neste contexto, objetivou-se estudar o período de receptividade dos estigmas de flores em diferentes estádios e ajustar às condições de pH, sacarose, cálcio, boro e temperatura ideais para a germinação in vitro de grãos de pólen de três variedades de laranja doce.

Material e Métodos

Para testar a receptividade dos estigmas, foram coletadas, em setembro e outubro de 2002, flores de laranja doce (Citru sinensis L. Osbeck) das variedades Valência, Natal e Pêra em três estádios distintos: botão pequeno (<0,8cm), balão e flor aberta. Os estigmas foram retirados e imersos em água oxigenada a 3% por três minutos para a observação da liberação de bolhas de ar, uma vez que a reação da água oxigenada com a enzima peroxidase, indica que o estigma está receptivo, segundo metodologia descrita por Zeisler (1938).

Para testar a germinação de grãos de pólen, utilizaram-se anteras retiradas de flores em estádio de balão, colocadas em placas de Petri com papel de filtro e mantidas à temperatura de 26^oC, durante 12h, para a completa deiscência e liberação de grãos de pólen. O políneo, ou massa viscosa de grãos de pólen fortemente aderidos foi utilizado para a instalação dos seguintes experimentos: 1) pH do meio (3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 e 6,5); 2) concentrações de sacarose (0, 50, 100, 150 e 200g·l^-1); 3) concentrações de nitrato de cálcio (400, 800, 1200 e 1400mg·l^-1); 4) concentrações de ácido bórico (0, 200, 400 e 600mg·l^-1) e 5) temperaturas (23, 24, 25, 26 e 27ºC). O meio de cultura básico utilizado nesses experimentos foi constituído de 10g·l^-1 de ágar, 30g·l^-1 de sacarose, 400mg·l^-1 de nitrato de cálcio, 100mg·l^-1 de ácido bórico e temperatura de 27ºC.

Nos experimentos de germinação, 10ml de meio de cultura foram vertidos em placas de Petri. Os polínios de cada variedade foram distribuídos sobre a superfície do meio com auxílio de um pincel, de modo a promover distribuição homogênea. As culturas foram mantidas a 27^oC e fotoperíodo de 24h, exceção para o experimento de diferentes temperaturas. Com auxílio de lupa binocular com objetiva de 10× avaliou-se a porcentagem de grãos de pólen germinados, após 24h de incubação. Foram considerados germinados os grãos de pólen cujo comprimento do tubo polínico tivesse o dobro do próprio diâmetro.

Em todos os experimentos, o delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com quatro repetições e 100 grãos de pólen por parcela. Os dados foram submetidos à análise de variância, as médias comparadas pelo teste de Tukey à 5% de probabilidade e os dados quantitativos foram submetidos a regressão. As análises foram realizadas pelo programa computacional Sistema para Análise de Variância - SISVAR (Ferreira, 2000).

Resultados e Discussão

Receptividade dos estigmas

Para o sucesso da fertilização é desejável que o pólen seja transferido para o estigma receptivo de uma outra flor. Em muitos casos, a fertilização também pode ocorrer quando o grão de pólen é depositado antes do período receptivo dos estigmas, desde que permaneça viável em tempo suficiente para poder germinar assim que a flor se torne receptiva.

Algumas características como cor, presença de gotículas e permanência de polens na superfície do estigma, são indicativos da receptividade dos estigmas das flores (Zeisler, 1938).

Observou-se que flores pequenas apresentavam estigmas menos desenvolvidos, de cor verde, ausência de gotículas ou secreções e não havia a permanência de grãos do pólen sobre a superfície do mesmo. Tais observações indicam falta de maturidade dos botões florais e estigmas ainda não receptivos. Botões em estádio balão e flor aberta apresentaram estigmas mais desenvolvidos, cor amarelo-esverdeado a amarelado, presença de gotículas e permanência dos grãos de pólen em suas superfícies. Essas características indicam que os estigmas estavam receptivos e aptos para serem fertilizados (Tabela I).

Na Tabela II observa-se a receptividade dos estigmas das flores em seus diferentes estádios. Em flores coletadas em estádio "balão", 80-100% dos estigmas apresentaram-se receptivos, sendo que os maiores percentuais foram verificados para as variedades Valência e Pêra (100%), seguida da ‘Natal’ com 80%. Isto foi observado pela presença de borbulhamento após o contato do estigma com a água oxigenada, indicando a presença da enzima peroxidase. Para as flores abertas este valor foi de 100%. Resultado semelhante foi obtido por Manju e Rawat (2006), quando observaram que os estigmas de flores de lima variedade Kagzi estavam mais receptivos na antese, ou seja, no momento da abertura das anteras e liberação dos grãos de pólen.

Os botões pequenos não apresentaram receptividade, não sendo recomendada sua utilização em hibridações controladas.

A atividade enzimática da peroxidase, neste estudo, foi maior em flores abertas, o que pode aumentar o sucesso da fertilização, mas por outro lado, também de contaminações por polinização natural, a não ser que cada flor seja protegida individualmente. De qualquer forma, as flores em estádio "balão" também apresentaram atividade desta enzima. Este dado é importante para o melhorista, pois permite a ele fazer os cruzamentos nesta fase, quando as flores ainda não foram polinizadas.

pH

Houve aumento linear da germinação de grãos de pólen das variedades Pêra e Valência com a elevação do pH no meio de cultivo. Tais resultados estão de acordo com Pierik (1987), que aponta melhor taxa de crescimento da maioria das plantas em pH entre 5,0 e 6,5 e Chagas et al. (2006b), que constataram aumento linear na germinação de grãos de pólen de nectarineira, com a elevação do pH até o valor máximo testado de 6,5. Entretanto, para a laranja ‘Natal’, maiores valores foram observados em pH 5, havendo inibição da germinação em valores maiores (Figura 1a).

Sacarose

Concordando com a afirmação de Miranda e Clement (1990), de que a sacarose e um dos componentes necessários para a germinação de pólen, maior germinação de grãos de pólen para as três variedades de citros foi obtida utilizando-se 100g·l^-1 de sacarose, havendo entretanto decréscimo em concentrações mais elevadas (Figura 1b). O efeito da adição de sacarose na germinação de grãos de pólen deve estar relacionado ao equilíbrio osmótico da solução, além do maior fornecimento de energia necessária para o crescimento do tubo polínico. Resultado semelhante foi obtido por Bhattacharya e Mandal (1999) trabalhando com cássia, que observaram melhor germinação in vitro de grãos de pólen com a adição de 100g·l^-1 de sacarose no meio de cultura. Em contrapartida, Kobayashi et al. (1991) obtiveram maior sucesso na germinação de grãos de pólen do híbrido de Citrus sinensis × Poncirus trifoliata utilizando-se 200g·l^-1 de sacarose. Ateyyeh (2005) também obteve boas porcentagems de germinação de grãos de pólen de Citrus máxima e C. paradisi utilizando 200g·l^-1 de sacarose. Já Butt et al. (1993) obtiveram melhores resultados utilizando-se 150g·l^-1 de glicose para várias espécies de citros. Por outro lado, em outras espécies diferentes a concentração de sacarose requerida pode ser menor (Raseira e Raseira, 1996; Dantas et al., 2005). Possivelmente essa diferença de concentração pode ser explicada por se tratar de genótipos diferentes.

Observou-se também, que as maiores porcentagems de grãos de pólen estourados ocorreram na ausência ou na presença de baixas concentrações de sacarose (50g·l^-1) ou quando submetidos a concentrações elevadas (200g·l^-1). A menor porcentagem de grãos de pólen estourados foi obtida com a concentração de 100g·l^-1 (dados não amostrados). Esses resultados confirmam aqueles obtidos para a germinação de grãos de pólen, evidenciando a necessidade do ajuste da concentração de sacarose para a germinação in vitro de pólen de laranjeira.

Cálcio

Independentemente da concentração de cálcio, constatou-se maior porcentagem de germinação dos grãos de pólen na ‘Valência’, seguida pela ‘Pêra’, sendo menor na ‘Natal’ (Figura 2a). Com relação à concentração de cálcio, melhor resultado foi obtido até 800mg·l^-1 de nitrato de cálcio, independente da variedade, a partir do qual houve decréscimo na germinação (Figura 2b). Estes resultados concordam com Oliveira Junior et al., (1996), que também verificaram que a melhor concentração de nitrato de cálcio é de 800mg·l^-1 para germinação de pólen de limoeiro ‘Cravo’. Por outro lado, Chagas et al. (2006a) verificaram que há necessidade da adição de cálcio na germinação de grãos de pólen de nectarineira, variedade Centenária e Colombina.

Boro

Para as variedades ‘Pêra’ e ‘Natal’ a maior porcentagem de germinação dos grãos de pólen ocorreu quando grãos de pólen foram cultivados na presença de 200mg·l^-1 de ácido bórico no meio. Já para ‘Valência’, houve diminuição na germinação com o aumento da concentração do micronutriente no meio de cultura (Figura 3).

Tais resultados comprovam que a necessidade da adição de boro é dependente da espécie e variedade. Chagas et al. (2006a) verificaram que não há necessidade de adição de boro na germinação de grãos de pólen de nectarineira. Já Freitas et al. (2006a) observaram que adição de 794 e 838mg·l^-1 de ácido bórico proporcionaram maior germinação de grãos de pólen das variedades de pereira Taiwan Nashi-C e Taiwan Mamenashi, respectivamente.

Harikareenakar e Haripriya (2000) estudaram a germinação e a viabilidade de pólen de cebola e constataram que a germinação e o desenvolvimento do tubo polínico eram maiores em meio contendo 10g·l^-1 de ágar e 100mg·l^-1 de ácido bórico.

Outros resultados também indicam a essencialidade da adição de boro no meio de cultura para germinação de grãos de pólen. Nyomora et al. (2000), trabalhando com a aplicação de boro foliar em amendoeiras, verificaram redução na ruptura dos tubos polínicos durante a germinação e que a adição de 100mg·l^-1 de ácido bórico aumentou a germinação de grãos de pólen in vitro. Bomben et al. (1999), estudando a germinação de grãos de pólen de kiwi, obtiveram melhores resultados com a utilização de meio de cultura composto por 100g·l^-1 de sacarose, 250mg·l^-1 de ácido bórico e 6g·l^-1 de ágar. Campos Andrada e Hill (1999) observaram em tremoço que o meio de cultura contendo 20g·l^-1 de sacarose, 100mg·l^-1 de ácido bórico e 2,5g·l^-1 de ágar, proporcionaram melhores resultados para germinação. Milutinovic et al. (1996) também constaram efeito positivo na germinação de grãos de pólen de macieira.

Também foram observados maior quantidade de grãos de pólen rompidos na ausência de boro no meio. Estes resultados indicam a essencialidade do boro no meio para se evitar um maior rompimento das membranas do tubo polínico dos grãos de pólen, liberando o conteúdo citoplasmático para o meio exterior e, conseqüentemente, obtendo maior porcentagem de germinação.

Temperatura

Não houve interação entre os fatores variedades e temperaturas. Para variedades, observa-se na Figura 4a que a ‘Valência’ apresentou maior porcentagem de grãos de pólen germinados do que ‘Pêra’ e ‘Natal’.

Independentemente da variedade, a temperatura de 25ºC foi a que proporcionou o melhor resultado de germinação de grãos de pólen (Figura 4b). Esses resultados concordam com os verificados por Vasilakakis e Porling (1985) e Chagas et al. (2006b), que obtiveram índices maiores de germinação e crescimento do tubo polínico na temperatura de 25^oC, em estudos realizados com pólen de laranjeira Pêra e nectarineira, respectivamente.

Conclusões

– A polinização manual para as variedades Valência, Pêra e Natal pode ser realizada em flores no estádio "balão".

– O meio de cultura para germinação dos grãos de pólen das variedades Natal e Valência deve ter o pH ajustado para 6,5 e da variedade Pêra para 5,0.

– Sacarose 100g·l^-1, cálcio 800mg·l^-1 e ácido bórico 200mg·l^-1 e temperatura de 25ºC podem ser empregados com sucesso para a germinação in vitro de grãos de pólen das três variedades de laranja doce.

– Para a germinação in vitro de grãos de pólen das três variedades de laranja doce podem ser ultilizados com sucesso 100g·l^-1 de sacarose, 800mg·l^-1 de cálcio, 200mg·l^-1 de ácido bórico e temperatura de 25ºC.

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