IDENTIFICACIÓN DEL AGENTE CAUSAL DE UNA BACTERIOSIS EN ÑAME (Dioscorea alata L.)

 

Margarita Rodríguez, Juan Matehus, Armando Gerstl y María A. Santana

Margarita Rodríguez. Licenciada en Educación Mención Biología, Universidad Católica Andrés Bello (UCAB), Venezuela. M.Sc, Ph.D., Carleton University, Canadá. Profesora, Universidad Simón Bolívar (USB), Venezuela.

Juan Matehus. Ingeniero Agrónomo, Universidad Central de Venezuela (UCV). Profesional Asociado, Instituto de Estudios Avanzados (IDEA), Venezuela.

Armando Gerstl. Ingeniero Agrónomo, UCV, Venezuela. Gerente de Campo. Agroindustrial Mandioca CA, Temblador, Estado Monagas, Venezuela.

María Angélica Santana. Licenciada en Biología, USB, Venezuela. Ph.D., University of Cambridge, Inglaterra. Profesora, USB, Venezuela. Investigadora Invitada, IDEA, Venezuela. Dirección: Departamento de Biología Celular. División de Ciencias Biológicas, USB. Carretera Nacional Hoyo de la Puerta. Caracas 1080. Venezuela. e-mail: msantana@usb.ve

RESUMEN

El ñame (Dioscorea alata L.), ampliamente usado como fuente de calorías en África, Asia y el Caribe, es una planta herbácea y trepadora que se reproduce generalmente de forma vegetativa y produce un tubérculo comestible de gran tamaño con alto contenido de almidón. Varios microorganismos fitopatógenos, incluyendo virus, hongos y bacterias, afectan al cultivo. Plantas enfermas de la zona de Guarataro, estado Bolívar, Venezuela, fueron colectadas en el 2003, año en que hubo ~80% de pérdidas en la producción de ñame de la zona a causa de una enfermedad desconocida. Hojas colectadas de plantas enfermas con lesiones acuosas y necróticas fueron esterilizadas superficialmente y transferidas a solución salina para permitir la difusión de bacterias desde los bordes del tejido y ser luego sembradas en medio LB agar. Como controles se emplearon agua y medio LB. Colonias amarillas, brillantes y lisas, fueron visibles a las 24-48h de incubación a 30^oC. Varios aislados fueron inoculados en las pruebas de hipersensibilidad en tabaco y de patogenicidad en plántulas de ñame cultivadas in vitro. Varios grados de respuesta de hipersensibilidad en tabaco fueron observados. Las plántulas de ñame inoculadas mostraron lesiones acuosas en la lámina foliar, las cuales no se observaron en los controles. Aislados bacterianos fueron observados mediante microscopía de luz, revelando bacterias bacilares Gram negativas. Varios flagelos peritricos fueron observados por microscopía electrónica. Los resultados de las pruebas bioquímicas y fisiológicas indicaron que los aislados corresponden a Pantoea agglomerans (Enterobacteriacea). Se discuten diferentes metodologías para la identificación de bacterias.

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF A PHYTOPATHOGENIC BACTERIA FROM WATER YAM (Dioscorea alata L.)

SUMMARY

Water yam (Dioscorea alata L.), a staple crop in Africa, Asia and the Caribbean, is a herbaceous twining vine plant generally reproduced by vegetative sections and highly affected by several phytopathogenic organisms including virus, fungi and bacteria. Diseased plants were collected from Guarataro, Bolívar State, Venezuela, in 2003. That year an unknown disease led to ~80% loss of water yam production. The leaves from diseased plants have watery or necrotic lesions on the leaf lamina. Pieces of necrotic tissue were surface sterilized, then transferred to saline solution and the bacteria allowed to diffuse into the solution from the edge of the dissected tissue. The bacteria were isolated on LB agar media. Yellow, shining, smooth colonies with regular margins were visible within 24-48h of incubation at 30^oC. Several isolates were inoculated on tobacco plants. Water and LB media were used as negative controls. Several degrees of hypersensitivity response resulted from the inoculation of tobacco. However, inoculation of in vitro water yam plants showed watering lesions on the leaf lamina inoculated with bacteria cultures and no lesions on water and media inoculated leaves. Bacterial cells observed by light microscopy showed Gram-negative regular rods. Several peritricous flagella were observed under EM. Data from biochemical and physiological tests indicated that the isolates belong to the Enterobacteriaceas family specifically to Pantoea agglomerans. Different methodologies for bacterial identification are discussed.

IDENTIFICAÇÃO DO AGENTE CAUSAL DE UMA BACTERIOSE NO INHAME (Dioscorea alata L.)

RESUMO

O inhame (Dioscorea alata L.), amplamente usado como fonte de calorias na África, Ásia e no Caribe, é uma planta herbácea e trepadeira que se reproduz geralmente de forma vegetativa e produz um tubérculo comestível de grande tamanho com alto conteúdo de amido. Vários microorganismos fitopatógenos, incluindo vírus, fungos e bactérias, afetam ao cultivo. Plantas enfermas da zona de Guarataro, estado Bolívar, Venezuela, foram coletadas em 2003, ano em que houve ~80% de perdas na produção de inhame dessa zona a causa de uma enfermidade desconhecida. Folhas coletadas de plantas enfermas com lesões aquosas e necróticas foram esterilizadas superficialmente e transferidas a uma solução salina para permitir a difusão de bactérias desde as bordas do tecido e ser logo plantadas em meio LBA. Como controles foram empregados água e meio LBA. Colônias amarelas, brilhantes e lisas, foram visíveis às 24-48h de incubação a 30^oC. Vários isolados foram inoculados nas provas de hipersensibilidade em tabaco e de patogenicidade em plântulas de inhame cultivadas in vitro. Vários graus de resposta de hipersensibilidade em tabaco foram observados. As de plântulas de inhame inoculadas mostraram lesões aquosas na lâmina foliar, as quais não se observaram nos controles. Isolados bacterianos foram observados mediante microscopia de luz, revelando bactérias bacilares Gram negativas. Vários flagelos perítricos foram observados por microscopia eletrônica. Os resultados das provas bioquímicas e fisiológicas indicaram que os isolados correspondem a Pantoea agglomerans (Enterobacteriacea). Discutem-se diferentes metodologias para a identificação de bactérias.

PALABRAS CLAVE / Bacteriosis / Dioscorea alata L. / Fitopatógenos / Ñame /

Recibido: 14/08/2007. Modificado: 05/06/2008. Aceptado: 06/06/2008.

Introducción

El ñame constituye un cultivo de varias especies de la familia Dioscoreaceae, la cual comprende más de 600 especies distribuidas en la zona tropical húmeda. Dioscorea alata L. es un ñame originario de Asia que ha sido cultivado desde hace varios miles de años, siendo esta especie la más ampliamente distribuida en las zonas productoras. Dioscorea alata L. es una planta trepadora cuyas raíces producen un tubérculo profundo de gran tamaño y alto contenido de almidón. El ñame es cultivado y consumido principalmente en los trópicos húmedos de África, Asia y el Caribe. Se reproduce principalmente de forma vegetativa mediante fracciones de los tubérculos, siendo esto la principal causa de la poca disponibilidad de material de siembra, ya que ~30% de los tubérculos son guardados con ese fin. Adicionalmente, también a consecuencia de la reproducción vegetativa, las enfermedades son transferidas de un ciclo a otro y de una localidad a otra, incidiendo esto sobre la productividad del cultivo.

A nivel mundial >90% de la producción de ñame tiene lugar en el continente africano, siendo Nigeria su principal productor con 34×10⁶t en 2006, lo que representó el 77% de la producción mundial (FAOSTAT, 2007). En Venezuela, el ñame es un cultivo marginal cuyo principal uso es el consumo directo como hortaliza. La producción nacional del cultivo para el año 2006 fue de 86952t, con una productividad de 8,6t·ha^-1, menor al promedio mundial de 9,1t·ha^-1 y muy por debajo de los rendimientos alcanzados en algunos países como Japón con una productividad de 23,3t·ha^-1 (FAOSTAT, 2007). El área de cultivo reportada en Venezuela para 2006 fue de 10093ha, razón ésta de la poca importancia y atención que se le ha dado a la producción de material de siembra sano y al apoyo en el estudio de los problemas del cultivo.

El ñame es fuertemente atacado por diversos organismos fitopatógenos virales y fúngicos, que afectan su productividad y almacenamiento, siendo éstos los responsables de la pérdida de ~25% de la producción anual. La mayor parte de las pérdidas reportadas para el cultivo son debido a enfermedades virales, antracnosis y nemátodos (Amusa et al., 2003). Con relación a las bacteriosis, el Instituto Internacional de Agricultura Tropical (IITA) reporta únicamente la presencia de una enfermedad bacteriana, conocida como la enfermedad de la agalla de la corona, cuyo agente causal es Agrobacterium tumefaciens y la pudrición bacteriana. Para esta última no se encontró ningún reporte que describiera el agente causal de la enfermedad. Adicionalmente, Hernández y Trujillo (1993) reportan una bacteriosis en mapuey (Dioscorea trifida L.) cuyo agente causal fuera identificado dentro del género de las Xanthomonas sp., y Knight et al. (1999) sugieren que Xanthomonas campestris puede infectar a Dioscorea cayenensis, siendo éste uno de los factores que pudiera estar afectando la producción de ñame en Jamaica.

En Venezuela no se ha reportado bacteriosis de importancia en cultivos de Dioscorea alata L. o presentes en el material de siembra utilizado por los agricultores. Sin embargo, en el 2003 se registró en la zona de Guarataro, al oriente del país, una pérdida cercana al 80% del total del material sembrado en la zona, que presentaba lesiones acuosas y pudrición avanzada de los tejidos. El presente trabajo tuvo como objetivo aislar e identificar el agente causal presente en plantas de ñame enfermas proveniente de la zona en cuestión.

Materiales y Métodos

Plantas de ñame enfermas de tres variedades, "Criollo", "Culebrón" y "Uña", fueron colectadas en la zona de Guarataro, Estado Bolívar, Venezuela. Explantes con yemas laterales fueron desinfectados superficialmente con etanol 70% por 1min y luego tratados por 10min con cloro comercial (hipoclorito de sodio 2,5%) y Tween 20 0,5%, previo al aislamiento de bacterias a partir de los tejidos en solución salina. Las especies bacterianas presentes en el explante fueron inoculadas en medio Luria-Bertani (LB) suplementado con agar 1,5% (LBA) e incubadas a 30°C por 24h. Colonias individuales fueron resuspendidas en agua estéril y reinoculadas mediante estriado por estiramiento en medio LBA hasta alcanzar un cultivo puro.

Las pruebas de hipersensibilidad fueron realizadas en plantas de tabaco, inoculando cultivos bacterianos de 24h de crecimiento en medio LB a 30°C (~1×10⁸ ufc/ml). Semillas de tabaco fueron sembradas en turba estéril y luego trasplantadas individualmente en bolsas. Plantas de 20-25cm y con 4-6 hojas fueron utilizadas para las pruebas de hipersensibilidad. Agua y medio LB estéril fueron utilizados como controles negativos. Las reacciones de hipersensibilidad fueron observadas 24 y 48h después de la inoculación.

Las pruebas de patogenicidad se hicieron inoculando plantas de ñame provenientes del Banco de Germoplasma del Instituto de Estudios Avanzados, Venezuela, y crecidas bajo condiciones in vitro. Previo a la inoculación, plantas de ñame de seis semanas creciendo in vitro en medio Murashige y Skoog (1962) suplementado con 3% sacarosa, 1mg·l^-1 ácido naftalén acético, 0,2mg·l^-1 bencil aminopurina y 0,1% carbón activado, fueron transplantadas a envases de vidrio conteniendo agua y una esponja de soporte (Trigiano y Gray, 2000). Dichas plantas fueron mantenidas por 7 días antes de su inoculación en una cámara de crecimiento con luz, fotoperíodo y temperatura controladas (2500lux, 12h luz y 28-30°C) e inoculadas con la aguja de una jeringa conteniendo la solución de bacterias de 24h de crecimiento en LB a 30°C (~1×10⁸ufc·ml^-1). Agua y medio LB estéril fueron también utilizados como controles negativos de esta prueba. El progreso de la enfermedad fue monitoreado durante 15 días.

Siguiendo el protocolo de identificación de bacterias fitopatógenas reportado por Schaad et al. (2001), se procedió a hacer la tinción de Gram y la prueba de la solubilidad en KOH 3%. Luego se procedió a la prueba del crecimiento anaeróbico usando el sistema GasPak Anaerobic System (Gibco-BBL, Voigt Global Distribution, EEUU) y la prueba de oxidación/fermentación de la glucosa o prueba de Hugh y Leifsons (Macfaddin, 1976).

La observación de los flagelos se hizo en cultivos bacterianos de 24h de crecimiento en LB a 30°C, los cuales fueron resuspendidos cuidadosamente en agua estéril y diluidos a razón de 1:10⁴. Los cultivos diluidos fueron teñidos mediante tinción negativa y la observación de los flagelos se hizo en el Servicio de Microscopía Electrónica del Departamento de Biología Estructural del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, en un microscopio electrónico marca Philips Cryo CM120.

La extracción de pigmentos se hizo en acetona:metanol (50:50) siguiendo el procedimiento reportado por Sedkova et al. (2005). El espectro de absorción del pigmento se hizo en un espectrofotómetro Perkin Elmer UV-VIS Lambda35.

La caracterización bioquímica se llevó a cabo mediante la inoculación de las cepas en los medios específicos, siguiendo los procedimientos de MacFaddin (1976) y Schaad et al. (2001). Las pruebas bioquímicas realizadas fueron licuefacción de gelatina, catalasa, oxidasa, ureasa, reducción de nitratos, producción de H₂S a partir de peptona, citrato, indol, rojo de metilo, ornitina decarboxilasa, y la formación de ácido a partir de la utilización de glucosa, sacarosa, arabinosa, manosa, trealosa, celobiosa, ramnosa, melibiosa, rafinosa, sorbitol e inositol. Adicionalmente, se verificó el crecimiento a diferentes temperaturas y se hicieron las pruebas de Voges-Proskaeur y MIO (motilidad, indol y ornitina decarboxilasa).

Para confirmar la identificación bioquímica de las cepas aisladas se realizaron las pruebas MicroScan Autoscan4 y el análisis del perfil de ácidos grasos, en el Laboratorio de Bacteriología de la Clínica Leopoldo Aguerrevere, Caracas, y por el servicio del laboratorio de patología vegetal de la Universidad de Florida, EEUU, respectivamente.

Con el objeto de hacer la tipificación de los genes del ARN ribosomal 16S de la cepa bacteriana, el ADN bacteriano fue aislado mediante el procedimiento de Chen y Kuo (1993). La amplificación del ADN que codifica a los genes del ARN ribosomal 16S se hizo mediante la metodología publicada por Lu et al. (2000) con los cebadores universales (U1 y U2) reportados. Después de 10min de denaturalización del ADN a 94°C, se corrieron 35 ciclos de 1min a 94°C para la denaturalización, 1min a 55°C para el acoplado del cebador y 2min para la síntesis o extensión. Al final, un ciclo de 10min a 72°C fue incluido para la terminación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los fragmentos amplificados fueron separados mediante electroforesis en geles de 1xTAE - 1% (p/v) agarosa, purificados y secuenciados por el servicio de secuenciamiento del Laboratorio de Genómica del Instituto de Estudios Avanzados. Las secuencias obtenidas fueron analizadas mediante el uso del programa DNAMAN y comparadas con las secuencias publicadas en la base de datos del genebank por BLAST de nucleótidos (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Las pruebas para determinar motilidad bacteriana por contracción, enjambre y natación se hicieron siguiendo la metodología de Rashid y Kornberg (2000).

Resultados y Discusión

De las tres variedades de ñame provenientes del Guarataro, Estado Bolívar, pudieron aislarse bacterias que formaron colonias brillantes de color amarillo (Figura 1a). La tinción Gram y KOH al 3% indicaron estar en presencia de bacterias Gram negativas capaces de crecer en condiciones de anaerobiosis (Figura 1b). La observación de la bacteria por microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa mostró la presencia de varios flagelos peritricos (Figura 1c).

Las reacciones de hipersensibilidad en tabaco fueron positivas a las 48h pero la respuesta de hipersensibilidad (Figura 2a) fue variable entre diferentes inoculaciones de los aislados. Las cepas aisladas fueron inoculadas en plantas in vitro de ñame (Dioscorea alata L.) produciéndose la aparición de lesiones acuosas en la lámina foliar, amarillamiento de los bordes de las lesiones y la senescencia prematura de las hojas inoculadas con la bacteria (Figura 2c). Ninguna lesión fue observada en aquellas plantas que fueron inoculadas con agua o medio de cultivo estéril (Figura 2b). Adicionalmente, las bacterias pudieron ser reaisladas de las plantas enfermas inoculadas, presentando las mismas características de las cepas que le dieron origen.

El pigmento extraído a partir del cultivo bacteriano tuvo dos picos de absorción, uno a 522nm y otro a 490nm, este último indicativo de pigmentos de la presencia de carotenoides (Polivka et al., 1999; Sedkova et al., 2005).

Los resultados de las pruebas de caracterización bioquímica llevadas a cabo en las cepas aisladas a partir de plantas enfermas se listan en la Tabla I y muestran un perfil bioquímico que las diferencian de otras bacterias fitopatógenas, tales como Xanthomonas campestris (mostrado en la tabla) y Erwinia carotovora, entre otras (Schaad et al., 2001).

El análisis de un cultivo en el Microscan autoscan 4, que analiza adicionalmente las actividades de las enzimas arginina hidrolasa, lisina decarboxilasa, ornitina decarboxilasa, b-galactosidasa y la utilización de adonitol, malonato, acetato, cetrimida y esculina, identificó a la bacteria con un 96,5% de probabilidad como Enterobacter agglomerans, actualmente denominada Pantoea agglomerans (Gavini et al., 1989).

El grupo bacteriano Pantoea está conformado por el antiguo grupo denominado Enterobacter agglomerans, donde también estaba incluida Escherichia vulneris (Brenner et al., 1982). La especie está ampliamente distribuida y ha sido aislada de plantas, suelos y humanos (heridas, sangre y órganos internos) después de heridas con material vegetal (Cruz et al., 2007). El grupo Pantoea también recoge al antiguo grupo de bacterias clasificadas como Erwinia herbicola, especie que ha sido reportada como endofítica en varias especies de plantas y saprófita del suelo (Gavini et al., 1989; Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006).

Por otro lado, el análisis de los ácidos grasos ubicó a esta bacteria dentro de la especie Escherichia vulneris con un índice de similaridad de 0,83. Una búsqueda en la base de datos de las características bioquímicas que diferencian E. vulneris y P. agglomerans muestra que se diferencian por la actividad de la lisina decarboxilasa, y la prueba de Voges-Proskauer, las cuales deben dar positiva y negativa, respectivamente, para E. vulneris e inversamente (negativa y positiva) como P. agglomerans (Sacsaquispe y Ventura, 2001). Las pruebas dieron para P. agglomerans.

Adicionalmente, el análisis de una secuencia parcial de 850pb de la región conservada de los genes del ARN ribosomal 16S mostró que la secuencia reportada en la base de datos del genebank con mayor identidad fue de una Enterobacteriacea CCUG (AY837751.1), y de éstas las del género Enterobacter, siendo Enterobacter cloacae (EF120473.1) la primera especie indicada en la lista de identidad de acuerdo a un BLASTn con el genebank. Una búsqueda de las diferencias bioquímicas entre P. agglomerans y E. cloacae, muestra que la arginina hidrolasa y la ornitina decarboxilasa son positivas para E. cloacae y negativas para P. aglomerans (Sacsaquispe y Ventura, 2001). Ambas pruebas fueron realizadas, siendo negativas para el aislado de ñame.

La identificación de bacterias por la secuencia de los genes ribosomales ha sido ampliamente utilizada en los últimos años. Sin embargo, para el grupo de las Enterobacteriaceas se ha reportado la poca discriminación que puede tener esta metodología en la diferenciación de especies estrechamente relacionadas dentro del grupo, debido al alto grado de conservación de estos genes (Spröer et al., 1999; Paradis et al., 2005). La comparación de la secuencia ribosomal del aislado con las secuencias reportadas en el genebank mostró que varios géneros de bacterias mostraban 99% de homología. Esto resultó aún más evidente al comparar dos secuencias del genebank; una correspondiente a Enterobacter cloacae (cepa B5 DQ202394.1) y una de P. agglomerans (AB004691.1) encontrándose únicamente 4 nucleótidos de diferencia de 850pb entre las dos secuencias. De aquí la necesidad de la búsqueda de nuevos genes para el análisis filogenético y la identificación de este grupo de bacterias. Debido a esta problemática Paradis et al. (2005) proponen el uso de los genes que codifican para el factor de elongación Tu y la subunidad b de la F-ATPasa, para la mejor discriminación de las diferentes especies dentro del grupo de las Enterobacteriaceaes.

Una observación relevante es que la cepa aislada mostró consistentemente la formación de biopelícula, una apariencia mucoide después de varios días de crecimiento y una prueba positiva para el movimiento por contracciones (twitching), por natación (swimming) y por enjambre (swarming; Figura 3). La formación de agregados de apariencia mucosa en la superficie del tubo en la interfase líquido-aire, es característico de la formación de una biopelícula, como se muestra en la Figura 3a. Esto se debe a la adhesión de células planctónicas del medio que se desplazan por medio de flagelos o pili y se adhieren a la superficie para formar primero una monocapa de microcolonias que se desarrollan como comunidades complejas, cubiertas de exopolisacáridos, que las ayudan a retener alimento y protegerse de agentes tóxicos (Costerton et al., 1995). Adicionalmente, la motilidad bacteriana ha sido reconocida como una de las propiedades necesarias para la formación de una biopelícula (Pratt y Kolter, 1998; Harshey, 2003). Las diferentes formas de motilidad permiten la formación de asociaciones simbióticas o patogénicas en plantas y animales. La biopelícula esta relacionada con los mecanismos de patogenicidad de bacterias fitopatógenas de muchos cultivos (Parsek y Greenberg, 2005; Torres et al., 2007). Koutsoudis et al. (2006) reportan que la patogenicidad de Pantoea stewarti subsp. stewartii y su colonización en el xilema de la planta se realiza mediante la formación de biopelícula, lo cual conduce al bloqueo del tejido al paso de agua y al posterior marchitamiento que caracteriza a la enfermedad. Todo este proceso se inicia con la formación de la biopelícula, la que es regulada por el mecanismo de quorum sensing, el cual regula a su vez expresión de genes de patogenicidad bacteriana. La formación de la biopelícula observada para las cepas aisladas a partir de ñame pudiera estar relacionado entonces con la patogenicidad bacteriana.

P. agglomerans ha sido reportada en años recientes como una especie fitopatógena de algunos cultivos de importancia económica tales como el milo, la cebolla, la remolacha, el palmito y el algodón entre otros (Frederickson et al., 1997; Ezra et al., 2004; Edens et. al., 2006; Medrano y Bell, 2007). En Venezuela este es el primer reporte de Pantoea agglomerans en Dioscorea alata L. Sin embargo, existen reportes de infecciones de esta especie en cultivares de arroz (Gonzáles et al., 2003) y plantas ornamentales de Gloxinia alba (Jiménez et al., 2007).

Conclusión

El presente trabajo muestra el aislamiento e identificación de Pantoea agglomerans a partir de plantas de ñame (Dioscorea alata L.) enfermas provenientes de la zona del Guarataro, Estado Bolívar, Venezuela.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Laboratorio de Bacteriología de la Clínica Leopoldo Aguerrevere por el análisis bacteriológico con el Microscan Autoscan4 y a Yhendi García por su asistencia técnica.

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