Morfogénesis in vitro de dioon merolae de Luca, Sabato & Vázquez-Torres (zamiaceae, cycadales) a partir de megagametofitos y embriones cigóticos.

Sandra Luz Cabrera Hilerio, Victor Manuel Chávez Ávila, Estela Sandoval Zapotitla, Richard E. Litz y Francisco Cruz Sosa

Sandra Luz Cabrera Hilerio. Maestría en Biotecnología, Universidad Autónoma del Estado de Morelos, México. Profesora, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Dirección: Departamento de Biotecnología, Universidad Autónoma Metropolitana (UAM)-Iztapalapa. Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, C. P. 09340 México, DF, México. e-mail: cabrerahs@ibiologia.unam.mx

Victor Manuel Chávez Ávila. Doctor en Ciencias, UNAM, México. Investigador, UNAM, México. e-mail: victorm@ibiologia.unam.mx

Estela Sandoval Zapotitla. M. en C. UNAM, México. Técnico Académico, UNAM, México. e-mail: esz@ibiologia.unam.mx.

Richard E. Litz. Ph.D. en Botánica/Biología Celular, Universidad de Nottingham, RU. Profesor, Universidad de Florida, Homestead, FL, EEUU. e-mail: relitz@ufl.edu

Francisco Cruz Sosa. Doctor en Ciencias, UNAM, México. Profesor, UAM-Iztapalapa, México. e-mail: cuhp@xanum.uam.mx

RESUMEN

A partir de explantes de embriones cigóticos y megagametofitos fueron inducidos cultivos organogénicos de Dioon merolae del estado de Chiapas (México), cícada en peligro de extinción. El medio de inducción Litz consistió en los macronutrientes del medio B5, los micronutrientes del medio MS y los compuestos orgánicos glutamina (400mg·l^-1) arginina (100mg·l^-1), asparagina (100mg·l^-1), sacarosa (60g·l^-1), gellan-gum (4g), y suplementado con 0; 0,45; 2,26; 4,52 y 9,05μM αcido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), y 0; 2,32; 4,60; 9,30 y 13,90μM kinetina (K), con un arreglo de 5´5 con un diseño de bloque seleccionado al azar. Los cultivos fueron mantenidos en oscuridad a 25°C y el callo fue subcultivado en medio fresco cada cuatro semanas. La iniciación del callo ocurrió en un amplio rango de combinaciones de reguladores de crecimiento en explantes de megagametofito. El callo en explantes de embriones cigóticos se formó en pocas combinaciones. La formación de brotes adventicios ocurrió solo en callos que provenían de combinaciones con K y 2,4-D. A través del análisis histológico de secciones longitudinales de embriones cigóticos se detectaron células meristemáticas apicales de brote y raíz, y en megagametofitos la formación de elementos de conducción similares a traqueidas y raíces coraloides. Esta técnica presenta gran potencial para la preservación de especies de cícadas en peligro de extinción.

In vitro morphogenesis of dioon merolae de Luca, Sabato & Vázquez Torres (zamiaceae, cycadales) from megagametophytes and zygotic embryos.

SUMMARY

Organogenic cultures were induced from zygotic embryo and megagametophyte explants of the Chiapas State (México) endangered cycad species, Dioon merolae. The Litz induction medium consisted of B5 major salts, MS medium minor salts and the organics glutamine (400mg·l^-1), arginine (100mg·l^-1), asparagines (100mg·l^-1), sucrose (60g·l^-1), gellan gum (4g), and supplemented with 0, 0.45, 2.26, 4.52 and 9.05μM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 0, 2.32, 4.60, 9.30, 13.90μM kinetin (K), arranged as a 5´5 factorial in a randomized block design. Cultures were maintained in darkness at 25°C, and callus was subcultured onto fresh medium at 4 week intervals. Callus initiation occurred on a wide range of plant growth regulators (PGR) combinations from megagametophyte explants. In comparison, callus initiation from explanted zygotic embryos occurred on few PGR combinations. Adventitious shoot induction occurred from callus on formulations with K and 2,4-D. Through the histological analysis of longitudinal sections of zygotic embryos were detected apical meristematic cells of the shoot and root and in megagametophytes the formation of elements similar to tracheids and coralloid roots. This technique has a great potential for preservation of the highly endangered cycads.

Morfogênese in vitro de dioon merolae de Luca, Sabato & Vázquez-Torres (zamiaceae, cycadales) a partir de megagametofitos e embriões zigóticos.

RESUMO

A partir de explantes de embriões zigóticos e megagametofitos foram induzidos cultivos organogênicos de Dioon merolae do estado de Chiapas (México), Cicas em perigo de extinção. O meio de indução Litz consistiu nos macronutrientes do meio B5, os micronutrientes do meio MS e os compostos orgânicos glutamina (400mg·l^-1) arginina (100mg·l^-1), asparagina (100mg·l^-1), sacarose (60g·l^-1), goma gelana (4g), e suplementado com 0; 0,45; 2,26; 4,52 e 9,05μM αcido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), e 0; 2,32; 4,60; 9,30 e 13,90μM kinetina (K), com um arranjo de 5×5 com um desenho de bloco selecionado aleatoriamente. Os cultivos foram mantidos no escuro a 25°C e o calo foi subcultivado, em meio fresco, cada quatro semanas. A iniciação do calo ocorreu em uma ampla faixa de combinações de reguladores de crescimento em explantes de megagametofito. O calo em explantes de embriões zigóticos se formou em poucas combinações. A formação de brotos adventícios ocorreu somente em calos que provinham de combinações com K e 2,4-D. Através da análise histológica de secções longitudinais de embriões zigóticos se detectaram células meristemáticas apicais de broto e raiz, e em megagametófitos a formação de elementos de condução similares a traqueídes e raízes coralóides. Esta técnica apresenta grande potencial para a preservação de espécies de Cicas em perigo de extinção.

PALABRAS CLAVE / Cícadas / Dioon merolae / Especies en Extinción / Histología / Organogénesis /

Recibido: 15/07/2008.  Modificado: 23/10/2008.  Aceptado: 29/10/2008.

Introducción

Las cícadas son las espermatofitas más primitivas que persisten en la actualidad, con 160-200 millones de años de haber aparecido en el planeta, razón por la que son consideradas verdaderos "fósiles vivientes" (Gilbert, 1984; Osborne, 1995). Son las únicas gimnospermas que fijan nitrógeno ambiental, enriqueciendo los ecosistemas en donde crecen. Existen ~132 especies distribuidas en áreas tropicales de África, América, Asia y Australia. La mayoría de las cícadas se hallan en serio peligro de extinción (Norstog, 2003) y, de acuerdo a este autor, debido no solo a la destrucción del hábitat y a la sobrecolecta, sino también a la ruptura del ciclo de vida de sus polinizadores (Litz et al., 1995a). Las cícadas son dioicas, de muy lento crecimiento y sus semillas son recalcitrantes, por lo que el daño a las poblaciones silvestres comúnmente lleva a su desaparición, pues no se cultivan y no existe un método de propagación efectivo para todas las especies (Chávez, 1993). Como ello, es imprescindible disponer de métodos alternativos de propagación que contribuyan a su conocimiento y conservación.

Dioon merolae de Luca, Sabato & Vázquez-Torres, es una especie endémica de México (Chiapas y Oaxaca; Pérez et al., 1999), de gran importancia cultural (Becerra, 1985; Manguen y Montesinos, 1991) y de un alto valor comercial en el mercado ilegal nacional e internacional como planta de ornato (Pérez y Rodríguez 1992; Pérez y Vovides, 1997). Sus escasas poblaciones silvestres, de pocos individuos, se encuentran en peligro de extinción (Vovides y Peters, 1987; Pérez et al., 1999; Diario Oficial de la Federación, 2002), situación que se agudiza por su limitada propagación natural, así como también por prolongados períodos de sequía y fuegos, en ocasiones provocados, a los que está sometida esta especie (Chávez, 1993; Chávez y Vovides 1993; Pérez y Vovides, 1997).

Los estudios sobre morfogénesis en cícadas iniciaron con LaRue (1948), quien a partir de megagametofitos de Zamia floridana (Z. pumila) obtuvo el desarrollo de las primeras plántulas haploides (organogénesis) y en 1954 reportó la presencia de "pseudobulbillos" que desarrollaron raíz y tallo de manera semejante a las desarrolladas de semillas en germinación. En los últimos 60 años son pocos los reportes de cultivos in vitro de este grupo de plantas en los que se haya logrado la regeneración de plántulas. Las respuestas organogénicas son aún menos frecuentes (brotes) en Stangeria eriopus, Zamia furfuracea, Z. pumila, Cycas revoluta, Encephalartos dyerianus, E. natalensis y Dioon edule (Litz et al., 2005). En el género Dioon solo hay un reporte in vitro para D. edule, del que se formaron brotes a partir de megagametofitos y de embriones cigóticos (Chávez y Litz, 1999).

El objetivo del presente estudio es establecer condiciones de cultivo in vitro para inducir respuestas morfogenéticas de D. merolae que permitan ampliar el conocimiento sobre su biología y proponer una alternativa metodológica que aporte a su conservación, y que sirva de base para estudios futuros en la conservación de otras especies de cícadas.

Materiales y Métodos

Estudios morfogenéticos

A partir de dos conos en maduración, se colectaron semillas de Dioon merolae de Luca, Sabato & Vázquez-Torres en la Reserva de la Biósfera "La Sepultura", Chiapas, México. Después de remover la esclerotesta (cubierta dura) se extrajeron los megagametofitos, los cuales fueron lavados con detergente por 10min y desinfectados por 30s en etanol 70% seguido de una solución de hipoclorito de sodio 20% (v/v), por 20min, y luego enjuagados 3 veces con agua destilada estéril. En una cámara de flujo laminar se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril. Los megagametofitos se disectaron longitudinalmente ylos embriones fueron aislados. Ambas estructuras fueron utilizadas como explantes. Los embriones median ~0,7-1cm de longitud y fueron sembrados completos. Los megagametofitos disectados longitudinalmente fueron divididos en dos partes iguales.

Los explantes fueron cultivados en medio de inducción Litz, ya que se ha demostrado que este medio de cultivo resulta eficiente con otras especies de cícadas (Chávez et al., 1992a, b, c; 1998 Litz et al., 1995). El medio de inducción Litz consistió en los macronutrientes del medio B5, los micronutrientes del medio de Murashige y Skoog (1962) y los compuestos orgánicos glutamina (400mg·l^-1) arginina (100mg·l^-1), asparagina (100mg·l^-1), sacarosa (60g·l^-1), gellan-gum (4g), y suplementado con 0; 0,45; 2,26; 4,52 y 9,05μM αcido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), y 0; 2,32; 4,60; 9,30 y 13,90μM kinetina. Se utilizó un diseño al azar de 10 explantes por tratamiento y la unidad experimental consistió de un frasco de cultivo conteniendo dos explantes de megagametofitos o un embrión cigótico. Todos los medios se ajustaron a un pH de 5.7, con 0,1N HCl y/o 1N NaOH, y esterilizados a 121°C y 1,5kg·/cm^-2 durante 15min.

Los cultivos fueron incubados en oscuridad a 25°C, y subcultivados mensualmente en medio de inducción (durante tres meses y posteriormente fueron transferidos mensualmente a medio de cultivo sin reguladores de crecimiento, durante nueve meses más). Las variables evaluadas fueron formación de callo, raíz, brotes, germinación y tiempo de respuesta. Para el análisis estadístico de los datos se utilizó la prueba de Chi-cuadrado de Pearson (c²) para medir las diferencias de la variable de germinación.

Estudio histológico

A partir de los cultivos de embriones en estado precotiledonario, se tomaron tres muestras de callo cada mes para su análisis histológico. Fueron fijadas con una solución de Navashin por 24h y lavadas al chorro de agua corriente durante 2h. Posteriormente se realizó la deshidratación en una serie de solución agua-alcohol etílico-alcohol terbutílico (ATB) con concentraciones de 30, 50, 70, 95 y 100% y alcohol terbutílico (ATB) absoluto. Las muestras permanecieron 24h en cada solución. La infiltración e inclusión se realizaron con Paraplast puro por 24h.

Se obtuvieron secciones de 6-8µM con un micrótomo de rotación American Optical 820. Se desparafinaron en estufa a 60°C por 20min y luego se dejaron por 10min en xileno puro, otros 10min en solución de xileno-etanol absoluto (1:1) y luegos fueron rehidratadas en soluciones de alcohol etílico absoluto, 96, 70, 50, 30%, y finalmente agua destilada.

Se realizó la tinción dicrómicra con Safranina O-verde rápido, se montaron en resina sintética Permount y se dejaron secar en horno a 60°C durante 15 días para obtener preparaciones permanentes (Sandoval et al., 2005). Éstas se analizaron a través de un fotomicroscopio Axioskope Carl Zeiss y se capturaron imágenes a través de una cámara de video Sony y se digitalizaron con tarjeta de video ATI.

Resultados

Germinación

La germinación ocurrió solo para algunos embriones a los 15 días después de la siembra y la elongación de los cotiledones a 1-2cm se alcanzó a los 4 meses sin el posterior desarrollo de un brote. En otros embriones la germinación ocurrió a los 40 días, pero sin el desarrollo de raíz, y en su lugar se formó un callo de aspecto amarillento, húmedo, con áreas de apariencia mucilaginosa. Solo un 75% de embriones germinaron, en el resto no hubo cambios y se oxidaron. La prueba de c² mostró que a p<0,05 el valor teórico es 16,83 y el valor calculado es 2,7´10^-2; por lo tanto, no existen diferencias significativas en los porcentajes de germinación. La germinación ocurrió en 11 de los tratamientos ensayados; en mayor medida con 2,32; 4,60; 9,30 y 13.90μM K y con 0; 0,45 y 2,26μM 2,4-D; no obstante, a concentraciones de 2.32μM K o de 0,45 y 2,26μM 2,4-D, al igual que con 0,45μM 2,4-D con algunas concentraciones de K, el embriσn tendió a dar una respuesta morfogénica, los embriones germinaron y también desarrollaron brotes adventicios a la vez (Tabla I).

Formación de callo

A partir de las primeras dos semanas de cultivo en un amplio intervalo de combinaciones de reguladores de crecimiento los megagametofitos manifestaron un notorio crecimiento general. Al término del primer mes de cultivo solo en algunos de ellos se observó una restringida y escasa formación de callo en la zona de corte, cercana a los arquegonios (Tabla II, Figura 1a). Entre el segundo y tercer mes de cultivo, en la parte superior del megagametofito emergió un tipo de callo friable, de color amarillento a hialino, en algunos casos con aspecto húmedo, algunas áreas adquirieron una evidente conformación nodular. Al término de cuatro meses de iniciados los cultivos, se observó que también en el control se había formado callo. Los tratamientos en que se obtuvo la mayor cantidad de callo fueron 0,45µM 2,4-D + 9,30µM K y 2,26µM 2,4-D + 13.9 µM K (Tabla II).

En los embriones, al cabo de dos meses de cultivo fue evidente el inicio de la formación de callo, el cual con el tiempo fue más frecuente hacia el extremo radicular, aunque también se generó callo en el ápice de los cotiledones. El callo fue friable en las zonas que no tenían contacto con el medio de cultivo, en tanto que fue más compacto en aquellas zonas que mantenían contacto con el medio. El callo se formó igualmente en embriones que germinaron o no. La formación de callo ocurrió más frecuentemente a altas concentraciones de K (4,60; 9,30 y 13,9µM) con 2,4-D (2,26 y 9,05µM). Fue notorio que en ausencia de reguladores de crecimiento, en los embriones no ocurrió ni la germinación ni crecimiento de callo y que en los megagametofitos hubo un mayor porcentaje en la producción de callo (80%) con respecto a la producción en los embriones (20%).

Organogénesis

No todos los explantes respondieron a la formación de brotes, la cual solo ocurrió a partir de cultivos de embriones vía directa en los tratamientos con 4,52µM 2,4-D + 9,30µM K y con 2,4-D unicamente, en tanto que por vía indirecta fue con 4,60; 9,30 y 13,90µM K en presencia de 9,05µM 2,4-D (Tabla I). La formación de brotes fue favorecida por la presencia de K y solo con altas concentraciones de 2,4-D (9,05µM) comparadas con el control en donde no se formaron brotes. En un lapso de 45 días, los brotes crecieron muy lentamente, alcanzando solo 0,5cm de longitud, y a los 60 días alcanzaron los 3,5cm de longitud. A partir de nódulos formados en callo de megagametofitos, entre los 3 y 6 meses se diferenciaron brotes; solamente en uno de estos fue evidente la diferenciación de primordios foliares, los cuales permanecieron sin desarrollo posterior al término de un año después de iniciados los cultivos. La inducción de brotes ocurrió de forma ligeramente más lenta a concentraciones altas de 2,4-D. Algunos explantes de megagametofitos presentaron una severa oxidación en sus extremos y abundante formación de callo; así mismo, fue común observar diferencias en el desarrollo de los brotes diferenciados. La separación del brote del explante, conllevó a un lento desarrollo y en algunos casos a su necrosamiento y posterior muerte. Bajo las condiciones del ensayo, los embriones de D. merolae resultaron más morfogenéticos que los megagametofitos; no obstante, los brotes adventicios no generaron raíces, aún cuando fueron subcultivados a medio basal (6 meses).

Raíces coraloides

A los tres meses de iniciados los cultivos, en el área cercana al corte de solamente dos megagametofitos se formaron nódulos hidratados, café-amarillentos, en grupos compactos de 12-20 nódulos, donde cada nódulo medía <1mm (Figura 1b). Al término de 8 meses de observación de estos cultivos, los nódulos prácticamente no variaron su condición; no habían proliferado, y solo incrementaron ligeramente su altura y semejaron pequeños cilindros compactos, de aspecto menos hidratado, de color café o amarillento, particularmente en el tratamiento con 4,52µM 2,4-D y 13,90µM K.

Histología

A través de la observación de secciones histológicas de los callos de los megagametofitos de las primeras semanas de cultivo se pudo detectar la presencia de células parenquimáticas que conformaron el callo. Estas células fueron de forma isodiamétrica, de tamaños relativamente grandes, vacuoladas y sin ningún tipo de diferenciación (Figura 1c). A los 3 meses de cultivo, el tejido calloso presentó algunas regiones en diferenciación. Hacia la periferia del callo se observaron células colapsadas y varios centros meristemáticos inmersos en él. Estos centros meristemáticos presentan una organización celular más definida; la mayoría de las células tienen forma rectangular, su relación de tamaño de núcleo y célula es alta y se organizan formando hileras para constituir una región meristemática. Desde una vista superior estas células se distribuyen de forma concéntrica y hacia el centro de ellas se observan elementos de conducción diferenciados como traqueidas (Figura 1d). Para el caso particular de los embriones, en los callos formados fue posible observar una mayor proporción de células diferenciadas formando regiones meristemáticas con células pequeñas, rectangulares, con citoplasma denso y núcleos notorios. A este nivel las células en división fueron frecuentes y en menor número se encontraron células alargadas. Sin embargo, no fue posible identificar una diferenciación morfogénica después de seis meses de cultivo.

En los embriones cigóticos a los 50 días de cultivo se detectó la conformación de brotes adventicios vía directa. Para analizar histológicamente y definir la estructura de estos brotes se realizó un corte longitudinal de un brote adventicio en una etapa temprana de desarrollo. En tales secciones se detectó la presencia de un meristemo apical. En esta etapa ya se encuentran diferenciados dos primordios foliares, uno de los cuales tiene mayor longitud que la otra, lo que hace evidente un desarrollo asincrónico. Estos primordios consisten de células parenquimáticas poco diferenciadas. El resto del brote adventicio está formado de células parenquimáticas poco diferenciadas y de mayor tamaño en relación a las del meristemo apical del brote (Figura 1e).

A partir del callo de un embrión en germinación, el ápice meristemático de su raíz fue seccionado longitudinalmente. En el estudio histológico de estas secciones se pudo detectar la diferenciación de las regiones meristemáticas propias de una raíz, incluida la diferenciación de una cofia, formada de varios estratos de células aplanadas, siendo más laxos los estratos hacia la punta de la raíz, donde sus células están suberizadas y algunas obliteradas (Figura 1f).

Discusión

La oxidación afectó el porcentaje de germinación de los embriones cigóticos. Sin embargo, este efecto se pudo disminuir cuando se transfirieron los embriones a un medio fresco. El problema de oxidación también se hizo presente en algunos explantes, lo que conllevó a una mayor producción de masa callosa en éstos y posteriormente su necrosamiento. La oxidación de los explantes tuvo lugar5 en un 25% de ellos. Aunque algunos autores mencionan que la exudación de sustancias fenólicas es mayormente problemático en tejidos maduros que en juveniles (Bonga, 1981; Gill y Gosal, 1996), ésta fue una limitante en el desarrollo de órganos en explantes de embriones cigóticos de Dioon merolae. Eventos semejantes in vitro no han sido descritos para otra especie de Dioon (Chávez y Litz, 1999). Pérez y Vovides (1997) describieron el crecimiento de cotiledones en semillas de D. edule y D. merolae, como criterio del inicio de la germinación a 24 días de la siembra en condiciones de suelo (Pérez et al., 1999).

En estudios previos con Zamia (Norstog y Rhamstine, 1967; Webb et al., 1983; Chávez et al., 1992b), Ceratozamia (de Luca et al., 1979; Chávez et al., 1992a) y D. edule (Chávez y Litz, 1999) el inicio del callo ocurrió en un amplio rango de combinaciones de reguladores de crecimiento, pero no alcanzó a la totalidad de los tratamientos ni al control, aún después de 7 meses de cultivo.

Esta respuesta se reportó a partir de brotes de megagametofitos de Z. fischeri y Z. pumila que pudieron llegar o no a extender sus folíolos (Chávez et al., 1992b), a diferencia del cultivo de megagametofitos de D. edule en los que se formaron con solo 2,26µM 2,4-D como también se reportó para Ceratozamia hildae, C. mexicana (Chávez et al., 1992a) y Z. fischeri (Chávez et al., 1992b). Estos valores de 2,4-D con K concuerdan con las concentraciones reportadas por Chávez y Litz (1999) para promover el desarrollo de brotes en cultivos de D. edule (9,29-13,94µM K + 0,45-9,05µM 2,4-D).

De Luca y Sabato (1980) describieron "crecimientos esféricos" análogos a nódulos de raíces coraloides en cultivos de megagametofitos de Cycas revoluta. Este proceso de organogénesis ocurrió en medio White, después de tres meses de cultivo en presencia de K con 2,4-D (1,13; 2,26 y 4,52µM), ambas en la misma concentración. En D. merolae el desarrollo ocurrió en medio Litz, más rico en sales y compuestos orgánicos y en presencia de K y de 2,4-D (4,52µM 2,4-D + 13,9µM K). En cícadas las raíces coraloides presentan una característica forma nodular a cilíndrica y están en simbiosis con cianobacterias. En cultivos in vitro de megagametofitos de Cycas revoluta L. y Macrozamia communis L. Johnson, también fueron descritas estas estructuras como primordios de raíces coraloides (De Luca et al., 1980; Osborne, 1990). En D. merolae se desarrollaron sin haberse detectado la presencia de microorganismos y su desarrollo in vitro refleja que son estructuras propias del sistema radical de las cícadas (De Luca y Sabato, 1980).

La presencia de grupos celulares con cierto grado de organización y diferenciación celular en los callos (Figura 1c y d) es evidencia del inicio de la formación de estructuras diferenciadas (Ross et al., 1973; Asbell, 1977; Litz et al., 1995b). Estos resultados son semejantes a lo descrito por Webb (1984) en callos de D. edule, donde se detectaron grupos de células que dieron origen a regiones meristemáticas. Algunos autores mencionan que la diferenciación cotiledonar de los cultivos proembriogénicos es asincrónica y puede no estar mediada por alteraciones de las condiciones de estrés en los cultivos. Se demostró el gran potencial y alternativas que desde las primeras publicaciones sobre morfogénesis en cícadas (LaRue, 1948; 1954; Norstog, 1965; Chávez et al., 1995) y años después en confieras (Hakman y Von Arnold, 1985; Nagmani y Bonga, 1985) se ha puesto de manifiesto para los métodos de cultivo de tejidos al mismo tiempo de reflejar como estos métodos han progresado y permitido la utilización de distintas fuentes de explantes, desde megagametofitos y embriones cigóticos inmaduros a embriones cigóticos maduros y plántulas.

No obstante los 60 años de investigación en cultivo de tejidos vegetales de cícadas, los reportes en esta familia son muy pocos y este estudio representa un avance en el aprovechamiento de las técnicas de cultivo de tejidos para el conocimiento de las posibilidades de regeneración y respuesta de los distintos explantes en D. merolae. Por otro lado, a través de la revisión bibliográfica se pone de manifiesto la falta de estudios sobre el tema de ésta y de otras especies de cícadas. Es por ello de interés incentivar nuevos estudios y demostrar la plasticidad de los tejidos para lograr regenerantes que permitan indagar en particular sobre este grupo de plantas tan antiguas y valiosas, pero en crítica situación de supervivencia, como lo son las cícadas.

AGRADECIMIENTOS

La primera autora agradece el apoyo de CONACYT, México, por la beca otorgada (No. 152390) para la realización de sus estudios doctorales, así como la orientación y aportes de Federico Gutiérrez Miceli, Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, y Miguel Ángel Pérez Farrera, UNICACH; Samanta Saucedo y Dalia Goldhaber, Jardín Botánico, IB-UNAM.

REFERENCIAS

1. Asbell CW (1977) Ultrastructural modifications during shoot formation in vitro. In Vitro 13: 180.        [ Links ]

2. Becerra ME (1985) Nombres geográficos indígenas de Chiapas. 3ª ed. INI. México. pp. 211, 219.        [ Links ]

3. Bonga J (1981) Vegetative propagation of mature trees by tissue culture. En Rao AN (Ed.) Tissue Culture of Economical Important Plants. Proc. Int. Symp. Costed / ANBS. Singapore. pp. 191-196.        [ Links ]

4. Chávez VM (1993) Embriogénesis somática a partir de foliolos jóvenes de plantas maduras de Ceratozamia mexicana var Robusta (Miq) Dyer (Zamiaceae) especie en peligro de extinción. Tesis. Universidad Nacional Autónoma de México. 148 pp.        [ Links ]

5. Chávez VM, Vovides AP (1993) Regeneración in vitro de tres especies de Zamia. Amaranto 6: 12-17.         [ Links ]

6. Chávez VM, Litz RE (1999) Organogenesis from megagametophyte and zygotic embryo explants of the gymnosperm Dioon edule Lindley (Zamiaceae, Cycadales). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 58: 219-222.        [ Links ]

7. Chávez VM, Litz RE, Norstog K (1992a) In vitro morphogenesis of Ceratozamia hildae and C. mexicana from megagametophytes and zygotic embryos. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 30: 93-98.        [ Links ]

8. Chávez VM, Litz RE, Norstog K (1992b) Somatic embryogenesis and organogenesis in Zamia fischeri, Z. furfuracea and Z. pumila. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 30: 99-105.        [ Links ]

9. Chávez VM, Litz RE, Norstog K (1992c) Somatic embryogenesis from leaf callus of mature plants of the gymnosperm Ceratozamia mexicana var. robusta (Miq) Dyer Cycadales. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 28: 59-63.        [ Links ]

10. Chávez VM, Litz RE, Norstog K, Marquez J (1995) Histology of somatic embryogenesis of the cycad Ceratozamia mexicana var. robusta (Miq.) Dyer. Plant Sci. 108: 191-200.        [ Links ]

11. Chávez VM, Litz RE, Monroy M, Moon PA, Vovides A (1998) Regeneration of Ceratozamia euryphyllidia (Cycadales, Gymnospermae) plants from embryogenic leaf cultures derived from mature-phase trees. Plan Cell Rep. 17: 612-616.        [ Links ]

12. De Luca P, Sabato S (1980) Regeneration of coralloid roots on cycad megagametophytes. Plant Sci. Lett. 18: 27-31.        [ Links ]

13. De Luca P, Moretti A, Sabato S (1979) Regeneration in megagametophytes of cycads. Giorn. Bot. Ital. 113: 129-143.        [ Links ]

14. De Luca P, Sabato S, Balduzzi A, Nazzaro R (1980) Coralloid root regeneration on Macrozamia megagametophytes. Giorn. Bot. Ital. 114: 271-275.        [ Links ]

15. Gilbert S (1984) Cycads: Status, Trade, Exploitation and Protection 1997-1982. TRAFFIC, WWF, Washington DC, EEUU. 42 pp.        [ Links ]

16. Gill R, Gosal S (1996) Micropropagation of economically important tropical trees. En Dieters M, Matheson A, Nikles D, Hardwood C (Eds.) Tree improvement for sustainable tropical forestry. QFRI-IUFRO Conference. Caloundra, Australia. pp. 230-233.        [ Links ]

17. Hakman I, Von Arnold S (1985) Plant regeneration through somatic embryogenesis in Picea abies. J. Plant Physiol. 121: 149-158.        [ Links ]

18. LaRue CA (1948) Regeneration in the megagametophyte of Zamia floridana. Bull. Torrey Bot. Club 75: 597-603.        [ Links ]

19. Litz RE, Moon PA, Chávez VM (1995a) Somatic embryogenesis from leaf callus derived from mature trees of the cycad Ceratozamia hildae (Gymnospermae). Plant Cell Tiss. Org. Cult 40: 25-31.        [ Links ]

20. Litz RE, Moon PA, Chávez VM (1995b) Somatic embryogenesis in the Cycadales. En Jain SM, Gupta PK, Newton RJ (Eds.) Somatic Embryogenesis in Woody Plants. Vol. 3. Kluwer. Dordrecht, Holanda. pp. 1-15.        [ Links ]

21. Litz RE, Moon PA, Chávez VM (2005) Somatic embryogenesis and regeneration of endangered cycad species. Acta Hort. 692: 75-80.        [ Links ]

22. Manguen A, Montesinos R (1991) Los Chiapanecas, Guerreros de la Historia. Gobierno del Estado de Chiapas. México. Vol 1. pp. 115-116.        [ Links ]

23. Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol. 15: 473-497.        [ Links ]

24. Norstog K (1965) Induction of apogamy in megagametophytes of Zamia integrifolia. Am. J. Bot. 52: 995-999.        [ Links ]

25. Norstog K (2003) Foreward. In: Cycads: Status, Survey, and conservation Action Plan. Donalson J (Ed.), IUCN/SSC, Gland Australia. pp. 3-8.        [ Links ]

26. Norstog K, Rhamstine E (1967) Isolation and culture of haploid and diploid Cycad tissue. Phytomorphology 17: 374-381.        [ Links ]

27. Osborne R (1990) Micropropagation in Cycads. Mem. NY Bot. Garden. 57: 82-88.        [ Links ]

28. Osborne R (1995) The world cycad census and a proposed revision of the threatened species status for cycad taxa. Biol. Cons. 71: 1-12.        [ Links ]

29. Pérez FM, Rodríguez GJ (1992) The espadaña Dioon merolae (Zamiaceae) during the Santa Cruz festivity in Suchiapa, Chiapas. III Int. Cong. Ethnobiology. Mexico. pp. 1-134.         [ Links ]

30. Pérez FM, Vovides AP (1997) Manual para el Cultivo y Propagación de Cícadas. Instituto Nacional de Ecología, Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas, Instituto de Historia Natural e Instituto de Ecología. 33 pp.        [ Links ]

31. Pérez FM, Vovides AP, Álvarez MJ (1999) A study on seed germination of the cycad, Dioon merolae (Zamiaceae). New Plantsman. 6: 214-218.        [ Links ]

32. Ross MK, Thorpe TA, Costerton JW (1973) Ultrastructural aspects of shoot initiation in tobacco callus cultures. Am. J. Bot. 60: 788-795.        [ Links ]

33. Sandoval ZE, Rojas AL, Guzmán CR, Carmona LJ, Ponce RMS, León CG, Loyola CB, Vallejo MAZ, Medina AA (2005) Técnicas Aplicadas al Estudio de la Anatomía Vegetal. Cuadernos IBUNAM 38. 278 pp.        [ Links ]

34. Vovides AP, Peters CM (1987) Dioon edule: la planta más antigua de México. Ciencia y Desarrollo 73: 19-24.        [ Links ]

35. Webb DT (1984) Developmental anatomy and histochemistry of light-induced callus formation by Dioon edule (Zamiaceae) seedling roots in vitro. Am. J. Bot. 71: 65-68.        [ Links ]

36. Webb DT, Rivera ES, Matos J (1983) Callus initiation and organized development from Zamia pumila embryo explants. Ann. Bot. 51: 711-717.        [ Links ]