Influencia de las condiciones de iluminación en la germinación de embriones somáticos del cultivar híbrido de plátano `FHIA-21'.

Influence of illumination conditions on germination of somatic embryos of plantain crop hybrid `FHIA-21'.

L. García Águila¹, R. Gómez Kosky¹, N.R. Albany², J.A. Vilchez², Y. Alvarado¹ y M. Reyes¹

¹Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas, Carretera a Camajuaní Km 5,5 Santa Clara, Villa Clara. Cuba, CP 54830.

²Departamentos de Química y Botánica, Facultad de Agronomía, Universidad del Zulia, AP 15205, Maracaibo, estado Zulia. (4005ZU), República Bolivariana de Venezuela.

Autor de correspondencia e-mail: leyanis02@yahoo.es; leyanis05@ibp.co.cu; nilca_albany@cantv.net; jvilchez@cantv.net

Resumen

La germinación de los embriones somáticos y formación de plantas completas es determinante en la eficiencia de la propagación masiva a través de la embriogénesis somática. Las condiciones de iluminación es uno de los factores de mayor influencia en la germinación y es por ello que se evaluó su influencia en la germinación de embriones somáticos del cultivar híbrido `FHIA-21'. Los embriones somáticos maduros fueron colocados en cámaras de crecimiento con iluminación solar y artificial. A los 15 días se evaluó el número de embriones germinados con plúmula clorofílica expuesta y la formación de plantas completas. Se evidenció el efecto de las condiciones de iluminación en el desarrollo del proceso de germinación de los embriones somáticos. Las condiciones de cultivo en cámara de crecimiento con luz artificial y fotoperíodo de 16 horas luz proporcionaron mayor número de embriones germinados (29,4) y la formación de nuevos embriones somáticos a partir de los existentes, originados por embriogénesis secundaria o repetitiva.

Palabras clave: embrión somático, germinación, Musa, intensidad de luz.

Abstract

The germination of the somatic embryos and formation of complete plants is decisive in the efficiency of the massive propagation through the somatic embryogenesis. The conditions of illumination is one of factors of more influence in the germination and it is for that their influence was evaluated in the germination of somatic embryos of cultivating hybrid `FHIA-21'. The mature somatic embryos were placed in growing cameras with solar and artificial illumination. At 15 days the number of germinated embryos and formation of complete plants were evaluated. The influence of the illumination conditions was evidenced in the development of germination process of the somatic embryos. The crop conditions of the controlled-growth environment chamber with artificial light and photoperiod of 16 hours light provided the highest number of germinated embryos (4, 29) and the formation of new somatic embryos from the existent ones, originated by secondary o repetitive embryogenesis.

Key words: germination, Musa, somatic embryos, illumination intensity.

Recibido el 11-9-2006 Aceptado el 10-6-2007

Introducción

La regeneración vía organogénica a partir del cultivo de yemas axilares se mantiene como el método de propagación in vitro más utilizado en Musa sp. Sin embargo, algunos cultivares tetraploides de la Fundación Hondureña de Investigación Agrícola (FHIA) se consideran altamente "recalcitrantes" por el bajo coeficiente de multiplicación y crecimiento de brotes en forma de rosetas (4).

En Musa, la embriogénesis somática se desarrolló con dos propósitos, el mejoramiento genético con la aplicación de técnicas de ingeniería genética y para la propagación masiva de plantas (5).

El cultivar híbrido de plátano `FHIA-21' (AAAB) ha ganado importancia en Cuba y en varios países de América Latina debido a sus características agronómicas y organolépticas, por lo cual se consideró importante utilizar la embriogénesis somática para la propagación masiva de plantas de este híbrido.

Daniels et al., (1) determinaron parámetros físicos y biológicos para la transformación genética del cultivar híbrido `FHIA-21' y propusieron un sistema de regeneración de plantas a través de la embriogénesis somática. Sin embargo, el porcentaje de germinación de los embriones somáticos fue bajo para su utilización en la propagación masiva de este cultivar.

Durante el estudio de la embriogénesis somática en diferentes cultivares de banano Strosse et al. (14) consideraron como factores importantes la presencia de agregados embriogénicos en la suspensión celular, la edad de la suspensión celular embriogénica y las condiciones de iluminación en la cámara de cultivo. Tomando en cuenta este último factor en este trabajo se evaluó el efecto de las condiciones de iluminación en la germinación de embriones somáticos del cultivar híbrido `FHIA-21'.

Materiales y métodos

Formación de callos y establecimiento de suspensiones celulares

Los callos con estructuras embriogénicas se formaron a partir de flores masculinas inmaduras extraídas de la inflorescencia de plantas de campo. La formación de callos se observó a partir del quinto mes en el medio de cultivo semisólido propuesto por Escalant et al. (3), en condiciones de oscuridad y temperatura de 27±2,0ºC. Se observaron callos de diferentes aspectos morfológicos, pero para el establecimiento de las suspensiones celulares solo fueron seleccionados los callos formados por grupos de proembriones y embriones somáticos translucidos en etapa globular (13).

Para el establecimiento y multiplicación de las suspensiones celulares embriogénicas se utilizó el medio de cultivo líquido propuesto por Daniels et al. (1), que contenía las sales propuestas por Murashige y Skoog (MS) (10); 0,5 mg.L^-1 de biotina;, 100 mg.L^-1 de L-glutamina;, 100 mg.L^-1 de extracto de malta, 3 mg.L^-1 de 2,4-D y 45 g.L^-1 de sacarosa. Se utilizaron Erlenmeyer de 25 mL de volumen con 3 mL de medio de cultivo, a los cuales se adicionaron 150 mg de masa fresca de proembriones y embriones en estado globular. Después de 15 días de cultivo, las suspensiones celulares formadas fueron tamizadas a través de filtros de malla metálica con un tamaño de poro de 500 mm. A partir de los filtrados se inició la multiplicaron de las suspensiones celulares y con ello el incremento de la cantidad de agregados celulares embriogénicos. Para ello fue necesario utilizar Erlenmeyer de 250 mL de volumen y adicionar 25 mL de medio de cultivo líquido. Cada 15 días se renovó la mitad del medio de cultivo y se adicionó medio de cultivo fresco. Los Erlenmeyer se colocaron en un agitador orbital INFORS modelo HT a una velocidad de 90 rpm, en condiciones de oscuridad y temperatura de 27±2,0°C.

Formación de embriones somáticos

Los embriones somáticos se derivaron a partir de los agregados celulares embriogénicos en suspensión, colocados en medio de cultivo semisólido y oscuridad total. Se utilizó el medio de cultivo propuesto por Dhed et al. (2). Los embriones somáticos formados en estado globular se colocaron en medio de cultivo de maduración y posteriormente fueron transferidos a medio de cultivo de germinación, ambos propuestos por Gómez et al. (7).

Efecto de las condiciones de iluminación en la germinación de los embriones somáticos.

Para estudiar el efecto de las condiciones de iluminación en la germinación, se colocaron 10 grupos de embriones por frasco (500 mL de capacidad total) que contenían 60 mL de medio de cultivo de germinación. Los grupos contenían de 4 a 5 embriones maduros y se establecieron 20 repeticiones (frascos) por tipo de iluminación estudiada. Los frascos se colocaron en:

Cámara de crecimiento con luz solar, fotoperíodo promedio de 12,5 horas luz y densidad de flujo de fotones fotosintéticos (DFFF) de 50-62,5 µmol m^-2 s^-1.

Cámara de crecimiento con luz artificial (lámparas fluorescentes de 40 W del tipo Full Spectrum), fotoperíodo de 16 horas luz y DFFF de 62-68 µmol m^-2 s^-1.

La calidad de la luz respecto a la disponibilidad del espectro fue similar en ambas cámaras de crecimiento objeto de estudio. Al igual que la luz solar, las lámparas fluorescentes de 40 W del tipo Full Spectrum se caracterizan por presentar todos los colores del arco iris y temperatura del color de 6500 ºK (10). En ambas condiciones de iluminación es tudiadas, la temperatura fue de 27±2,0^oC.

A los 15 días se determinó el número de embriones somáticos con germinación tipo I y tipo II según la clasificación establecida por Escalant et al. (3). La germinación de tipo I correspondió a los embriones germinados con plúmula clorofílica expuesta (pequeña protuberancia de color verde). Mientras que la germinación de tipo II correspondió a los embriones germinados completamente, o sea formación de plantas con hojas abiertas.

Análisis estadístico

El diseño experimental utilizado fue un completamente al azar y se realizaron dos repeticiones del experimento con el objetivo de disponer de suficientes datos para validar los resultados. Los datos que corresponden al número de embriones con germinación de tipo I y II por frasco se procesaron con la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Se utilizó el paquete estadístico Statgraphics Plus versión 5,1 para Windows de Microsoft^®.

Resultados y discusión

Se demostró el efecto de las condiciones de iluminación en la germinación de los embriones somáticos del cultivar hibrido `FHIA 21'. Los mejores resultados respecto al número de embriones con germinación tipo I y II se obtuvieron en la cámara de crecimiento con luz artificial. Estos resultados presentaron diferencias estadísticamente significativas respecto a los obtenidos en la cámara con luz solar (cuadro 1).

Cuadro 1. Efecto del tipo de iluminación en el número de embriones somáticos germinados del cultivar hibrido `FHIA 21' a los 15 días de cultivo.

Media de rangos con letras distintas en una columna difieren estadísticamente según Kruskal-Wallis (P<0,05). Nº de ES: Número de embriones somáticos.

Los embriones somáticos colocados en cámara de crecimiento con luz artificial desarrollaron con mayor rapidez los diferentes eventos relacionados con la germinación, en medio de cultivo semisólido. A los 15 días de cultivo se cuantificó mayor número de embriones germinados con formación de plantas completas y embriones con la plúmula clorofílica expuesta (cuadro 1, figura 1A), además de la formación de nuevos embriones somáticos a partir de los existentes, originados por embriogénesis secundaria o repetitiva, los cuales también germinaron.

Figura 1. (A) Cámara de crecimiento con luz artificial. (B) Embriones germinados del cultivar híbrido `FHIA-21'con germinación de tipo I y germinación de tipo II. (C) Embriones germinados en cámara de crecimiento con luz solar. (D) Embriones germinados en cámara de crecimiento con luz artificial.

Un factor importante a considerar en la respuesta fotomorfogénica de los tejidos vegetales es la calidad de la luz. En este trabajo no se consideró como determinante su influencia porque las cámaras de crecimiento objeto de estudio presentaron igual disponibilidad del espectro de luz, por lo que es posible que la respuesta fotomorfogénica en la germinación de los embriones somáticos observada este determinada por la intensidad de la luz y el fotoperíodo de las cámaras de crecimiento.

La intensidad de la luz y el fotoperíodo fue mayor en la cámara con luz artificial (figura 1B). Por consiguiente, los embriones somáticos recibieron una intensidad continua y con poca variación. Además, permanecieron expuestos a la iluminación durante mayor período de tiempo con respecto a los embriones colocados en la cámara de crecimiento con luz solar.

Las condiciones de iluminación de la cámara con luz artificial propiciaron mayor eficiencia en la iniciación del proceso fotosintético de los embriones, los cuales se tornaron de color verde en los primeros cinco días de cultivo. Además, determinó que germinará el mayor número de embriones así como el crecimiento que originó plantas con hojas abiertas (cuadro 1, y figura 1C). Según Raven et al. (13) la luz influye en la germinación de los embriones a través del fitocromo. Los embriones absorben la luz de la zona activa del infrarrojo que interacciona con los mecanismos endógenos, y se desencadenan numerosos cambios morfológicos, bioquímicos y fisiológicos que inducen la germinación. Se conoce que la luz induce la acetilación de las histonas activando los genes relacionados con la fotomorfogénesis (9).

Khalil et al. (8) obtuvieron 90% de embriones germinados y desarrollo de plantas completas de banano (Musa spp. AAB cv. Dwart Brazilian), utilizando iluminación artificial, proporcionada por lámparas fluorescentes de 40 W del tipo cool-white y fotoperíodo de 16 horas luz.

Los embriones somáticos colocados en la cámara de crecimiento con luz solar desarrollaron los mismos eventos relacionados con la germinación, pero en menor cuantía (cuadro 1, figura 1D). En esta cámara la intensidad de luz fue menor y con mayor variación; la duración del fotoperíodo también fue menor, el cual estuvo determinado por la duración del día, dependiendo de la época del año; esta pudo ser la causa de obtener menor número de embriones germinados y menor formación de plantas. Sin embargo, en Ipomoea batata se formó mayor número de callos embriogénicos en cámara con luz solar, respecto a condiciones de oscuridad total y cámara con luz artificial (6)

La luz es uno de los factores que determina el desarrollo de los organismos autótrofos, en ello radica la importancia de controlar la luz en los cultivos in vitro. La cámara de cultivo debe reproducir lo mejor posible las necesidades de iluminación del cultivo (11).

Las plantas formadas a partir de los embriones somáticos fueron transferidas a medio de cultivo compuesto por las sales MS (100%) y libre reguladores del crecimiento donde continuaron su crecimiento y desarrollo fisiológico. Se obtuvieron 4200 plantas a partir de embriones somáticos; estas plantas alcanzaron de 3 a 4 cm de altura, más de 3 hojas abiertas y un sistema radical (datos no mostrados) que permitió su establecimiento en condiciones ex vitro, en invernadero.

Conclusiones

Las condiciones de cultivo en cámara de crecimiento con luz artificial, fotoperíodo de 16 horas luz y densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 62-68 µ m^-2 s^-1, generó el mayor número embriones germinados y formación de plantas completas. La optimización de la propagación vía embriogénesis somática a través del estudio de las condiciones de iluminación permitirá la propagación eficiente del cultivar híbrido `FHIA-21'.

Agradecimientos

Agradecemos la colaboración del doctor Raúl Barbón Rodríguez por la revisión crítica de este trabajo.

Literatura citada

1. Daniels, D., Kosky, R., Vega, M. 2002. Plant regeneration system via somatic embryogenesis in the hibrid cultivar FHIA 21 (Musa spp. AAAB Gropl). In Vitro Cell Dev Biol 38: 330-333.        [ Links ]

2. Dhed'a, D., Dumortier, F., Panis, B., Vuylsteke, D., De Langhe, E. 1991. Plant regeneration in cell suspension cultures of the cooking banana cv. "Bluggoe" (Musa spp. ABB group). Fruits 46: 125-135.        [ Links ]

3. Escalant, J. V., Teisson, C., Cote, F. 1994. Amplified somatic embryogenesis from male flowers of triploid banana and plantain cultivars (Musa spp). In vitro Cell Dev. Biol 30: 181-186.        [ Links ]

4. García, L., Pérez, B., Sarría, Z., Clavero, J. 2002. Alternativas para la propagación in vitro del cultivar híbrido FHIA-20. Infomusa 11 ( 1): 35-38.        [ Links ]

5. Grapin, A., Ortíz, J. L., Domergue, R., Babeau, J., Monmarson, S., Escalant, J.V., Teisson, C., Côte, F. 1998. Establishment of embryogenic callus and initiation and regeneration of embryogenic cell suspensions from female and male immature flower of Musa spp. Infomusa 7 (1): 13-15.        [ Links ]

6. González, O., Silva, J., Espinosa, A., Oliva, E., Milanés, I. 2001. Efecto de la iluminación en la inducción de callos morfogénicos en boniato. Biotecnología vegetal. 1 (2): 89-92.        [ Links ]

7. Gómez, R., Gilliard, T., Barranco, L.A., Reyes, M. (2000). Embriogénesis somática en medios líquidos. Maduración y aumento de la germinación en el cultivar híbrido FHIA-18 (AAAB). Infomusa 9 (1): 12-16.        [ Links ]

8. Khalil, S.M., Cheah, K.T., Pérez, E.A., Gaskill, D.A., Hu, S.M. 2002. Regeneration of banana (Musa spp. AAB cv Dwarf Brazilian) via secondary somatic embryogenesis. Plant Cell Rep 20: 1128-1134.        [ Links ]

9. Moore, R., W. D. Clark  y  D.S. Vodopich. 1998. "Botany". Second edition. WCB Mc Graw-Hill. New York. 234 p.         [ Links ]

10. Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: 473-497.         [ Links ]

11. Penacho, A., L. Martín, R. Cueva, J. Sanfelire y  G. Alins. 2002. Cultivo in vitro. Escuela técnica superior de ingeniería agrícola de Lleida. & #091;en línea & #093;: documento electrónico fuente en Internet. Fecha de consulta: 6 de junio 2006. Disponible en. <http:// www.etsea2.udl.es/in vitro/ luz>         [ Links ]

12. Raven  P.H., R.F. Evert  y  S. E. Eichhorn. 1999. Biology of Plants. Sixth edition, W.H. Freeman and Company. 122 p.         [ Links ]

13. Strosse  H., R. Domergue, B. Panis, J. V. Escalant y  F. Côte. 2003. Suspensiones de células embriogénicas de bananos y plátanos. Guías técnicas INIBAP. 8: 6-6.         [ Links ]14. Strosse  H., I. Van den Houwe  y  B. Panis. 2004. Banana cell and tissue culture-review. p. 1-12. En  J. S. Mohaan y  R. Swennen  (Eds). Banana improvement cellular, molecular biology and induced mutations.         [ Links ]