Oxidación en la inducción de la embriogénesis somática a partir de flores masculinas inmaduras de Gran Enano (Musa AAA)

Oxidation during the induction of somatic embryogenesis with immature male flowers of Grand Nain (Musa AAA)

Z. Villegas F.¹, C. Giménez A.¹, J. Vílchez P.², M. Moreno C.¹, L. Sandoval ³ y M. Colmenares E.¹

Autor de correspondencia e-mail: zaithvillegas@cantv.net

¹Departamento de Biología. Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia (LUZ), Maracaibo, Venezuela.

²Departamento de Botánica. Facultad de Agronomía. LUZ. Maracaibo, Venezuela

³Instituto de Investigaciones Agronómicas. Facultad de Agronomía. LUZ. Maracaibo, Venezuela

Resumen

Las bananas y plátanos (Musa spp.) son económicamente importantes a nivel mundial. Su mejoramiento clásico ha presentado limitaciones que podrían superarse aplicando transgénesis, lo que requiere un protocolo eficiente de multiplicación y regeneración como la embriogénesis somática. Para inducir embriogénesis somática en Musa spp. el explante más usado son las manos de flores masculinas inmaduras, no obstante, el método convencional para su extracción implica dificultades prácticas. Recientemente se reportó para el cultivar Dwarf Brazilian (Musa AAB) una metodología más sencilla que la convencional para extraer explantes con flores masculinas, pero se desconoce si el manejo del material vegetal con este método causa problemas de oxidación. El objetivo de esta investigación fue evaluar la oxidación fenólica al inducir embriogénesis somática en explantes con flores masculinas inmaduras de Gran Enano, extraídos con el método convencional y con la metodología novedosa propuesta para Dwarf Brazilian. Se esterilizaron con alcohol isopropílico bellotas reducidas, se lavaron con agua y se redujeron nuevamente. Se extrajeron explantes de cada bellota con flores masculinas usando dos métodos: el convencional (aislando manos florales) y el método nuevo (seccionando la bellota). Los explantes se cultivaron durante 7-9 meses en medios semisólidos y en oscuridad, a 27±4ºC. Se obtuvo un porcentaje bajo de explantes con oxidación intensa en las flores, tanto al usar el método convencional (7,35%) como la metodología novedosa (0,25%). En general, la oxidación no afectó el establecimiento de los explantes y la extracción de los mismos resultó más sencilla al aplicar el método novedoso.

Palabras clave: embriogénesis somática, Musa, inducción, Gran Enano, oxidación.

Abstract

The bananas and plantains (Musa spp.) are economically important crops in the world. Their classical improvement has very limitations which could be overcome with transgenic plants. Plant trangenesis require an efficient method for multiplication and regeneration like somatic embryogenesis. For somatic embryogenesis induction the more used explant are immature male flowers; however the application of this method has practice difficulties for flower extractions. More recently was reported a more simple methodology applied in the cultivar Dwarf Brazilian (Musa AAB) to process the male immature flowers but is not described the oxidation problems that could be occurred for the application of this methodology. The objective of this research was to evaluate the phenolic oxidation during the somatic embryogenesis induction in explants with immature male flowers of Grand Nain using both methods for the explants extraction. Male buds were reduced and sterilized with isopropyl alcohol, washed with sterile water and reduced again. From each sterilized male bud were extracted immature male flowers with two methods: the conventional method (isolating floral hands) and the new method (separating the acorn). All the explants were cultured during 7 to 9 month in semisolid media, in dark at 27±4 ºC. A low percentage of explants were obtained with intense oxidation in the flowers, so much when using the conventional method (7.35%) as the novel methodology (0.25%). In general, the oxidation didn't affect the establishment of the explants and the extraction of the same ones was simpler when applying the new method.

Key words: somatic embryogenesis, Musa, induction, Grand Nain, oxidation.

Recibido el 16-10-2007 Aceptado el 7-5-2008

Introducción

Las bananas y los plátanos (Musa spp.) se encuentran entre las frutas con mayor importancia económica en el mundo (Jalil et al., 2003). En nuestro país el cultivo de estas frutas, especialmente del banano Gran Enano (Musa AAA), proporciona parte insustituible de la dieta diaria del venezolano, aporta divisas y genera empleos (Delgado y Paiva, 2001).

Las enfermedades fungales y virales representan la principal amenaza para la producción de bananas y plátanos (Houllou-Kido et al., 2005). Su control se realiza asperjando intensamente con productos químicos, lo cual perjudica el ambiente y la salud humana e incrementa los costos de producción (Novak et al., 1989). El mejoramiento genético convencional para conferir resistencia a patógenos a Musa spp. ha sido limitado hasta ahora (Khalil et al., 2002), debido al escaso conocimiento sobre los mismos, la poliploidía y la baja fertilidad de las plantas (Sági et al., 1994).

La propagación masiva de genotipos élite, la variación somaclonal y la transformación genética, pueden usarse para vencer algunos factores que limitan el mejoramiento genético convencional de bananos y plátanos; no obstante, estas aplicaciones requieren como base protocolos eficientes para la multiplicación y regeneración de plantas (Navarro et al., 1997).

La utilidad de la embriogénesis somática en el mejoramiento genético de Musa spp. radica en que ésta es considerada el método de micropropragación de plantas más eficiente (Monsalve et al., 2005). Además, el material embriogénico es adecuado para introducir genes, inducir mutaciones y realizar selección in vitro (Gómez et al., 1999).

En Musáceas la embriogénesis somática se ha inducido usando ápices vegetativos (Cronauer y Krikorian, 1983), embriones cigóticos (Cronauer y Krikorian, 1988; Escalant y Teisson, 1989; Marroquin et al., 1993), cormo y base de hojas (Novak et al., 1989), yemas adventicias (Dhed'a et al., 1991), flores femeninas inmaduras (Grapin et al., 2000) y flores masculinas inmaduras (Escalant et al., 1994; Grapin et al., 1996; Jalil et al., 2003; Ma, 1991). Éstas últimas han resultado ser el explante más adecuado para iniciar cultivos embriogénicos (Jalil et al., 2003).

La extracción de explantes con flores masculinas para la inducción de la embriogénesis somática en Musa spp. ha consistido convencionalmente en aislar manos florales enteras (Escalant et al., 1994; Grapin et al., 2000; Grapin et al., 1996; Jalil et al., 2003). Esto implica dificultad práctica, pues se requiere usar un estereoscopio, invertir mucho tiempo y tener gran destreza manual.

Recientemente, para inducir la embriogénesis somática del cultivar Dwarf Brazilian (Musa AAB), se utilizó un método en el que en lugar de aislar manos florales completas, se realizaron cortes longitudinales y transversales de las bellotas hasta obtener explantes con flores masculinas inmaduras y porciones de brácteas (Khalil et al., 2002). Esta metodología de extracción de explantes novedosa resulta mucho más sencilla que la convencional; sin embargo, se desconoce si el manejo del material vegetal por este nuevo método afecta el establecimiento de los explantes, ya que estos podrían sufrir oxidaciones fenólicas fuertes debido a los numerosos cortes que deben realizarse para extraerlos. Tales oxidaciones podrían inhibir el crecimiento de los explantes y hacer que pierdan su viabilidad (Ramírez, 1998).

El objetivo de la presente investigación fue comparar la oxidación producida al inducir la embriogénesis somática en explantes con flores masculinas inmaduras de Gran Enano extraídos con el método convencional (Grapin et al., 1996) y con la metodología novedosa propuesta para el cultivar Dwarf Brazilian (Khalil et al., 2002).

Materiales y métodos

Recolección y esterilización del material vegetal

La recolección del material vegetal se realizó durante julio y agosto de 2005 en una plantación comercial de la empresa BANAORO, C.A., localizada en la finca Punta de Oro (km 14 de la vía a La Ceiba, Estado Trujillo).

El material vegetal se obtuvo de bellotas del cultivar Gran Enano recolectadas cuando se habían abierto de 7 a 12 brácteas después de la última flor femenina. Cada bellota se cortó 15 cm antes del ápice y se redujo a 3 cm de longitud en condiciones no estériles, mediante la remoción de las brácteas externas y de las manos cubiertas por éstas. Las bellotas reducidas se esterilizaron superficialmente sumergiéndolas en alcohol isopropílico 70% (v/v) durante 15 min. Inmediatamente, las bellotas estériles se lavaron tres veces con agua destilada en una cámara de flujo laminar horizontal. Las bellotas lavadas se mantuvieron en una solución antioxidante (cisteína: 60 mg.L^-1 + ácido ascórbico: 100 mg.L^-1) hasta la extracción de los explantes.

Extracción y selección de explantes

Método 1 (Grapin et al., 1996): se redujeron a 1 cm de longitud las bellotas lavadas, removiendo en condiciones estériles las brácteas y las manos florales mediante una pinza y un bisturí. Se aislaron las manos de las posiciones 1 a 16 de cada una de estas bellotas, utilizando un microscopio estereoscópico. Para ello se consideró que la posición 1 era ocupada por la mano más cercana al meristemo floral. Las manos aisladas se colocaron en una placa de Petri y se mantuvieron humedecidas con solución antioxidante hasta el momento de su siembra en el medio de cultivo. Se seleccionaron como explantes las manos en las posiciones 5 a 16 de 34 bellotas.

Método 2 (Khalil et al., 2002): la reducción a 1 cm de longitud de las bellotas lavadas se hizo siguiendo el procedimiento descrito para el método anterior. Posteriormente se cortó longitudinalmente cada bellota a través del eje floral en cuatro segmentos más o menos iguales (figura 1A y 1B). A su vez, cada segmento se dividió transversalmente en cinco secciones: cuatro secciones de aproximadamente 1 mm de ancho (secciones 1, 2, 3 y 4) y una de 5 mm de ancho (sección 5). Esta última correspondió a la parte más apical de la bellota (figura 1C). Se seleccionaron como explantes las secciones 1-4 de 34 bellotas (16 explantes por bellota). Se mantuvo el material vegetal humedecido con solución antioxidante durante todo el proceso de extracción de los explantes.

Cultivo de los explantes

Método 1: se sembraron los explantes provenientes de 34 bellotas (408 manos) en el medio semisólido usado convencionalmente para la inducción de la embriogénesis somática (Grapin et al., 1996). Esto se hizo 18 a 72 horas después de las recolecciones del material vegetal. En cada recipiente se colocaron tres explantes de posiciones contiguas y se cultivaron por 7 a 9 meses.

Método 2: se sembró un total de 544 explantes (34 bellotas x 16 explantes) en el medio semisólido M1 para la inducción de la embriogénesis somática (Khalil et al., 2002). Las siembras se hicieron 18 a 72 horas luego de las recolecciones del material vegetal. Se colocaron en un mismo recipiente de cultivo los cuatro explantes de cada bellota que correspondían a la misma sección (sección 1, 2, 3 ó 4). Siguiendo este orden de siembra, cuarenta días después, se transfirieron las flores a medio M1 fresco, manteniendo separadas las flores de explantes diferentes. Estas flores se mantuvieron en M1 por 7 a 9 meses.

Los callos blancos compactos producidos a partir de las flores transferidas a medio M1 fresco se cultivaron durante cuatro meses en el medio semisólido MM1 (Khalil et al., 2002), colocando 1 a 5 callos en cada recipiente.

Los medios de cultivo utilizados se dispensaron en frascos de vidrio de 160 mL de capacidad, a razón de 25 mL por frasco. Los recipientes se taparon con papel de aluminio y Envoplast^® y se mantuvieron en oscuridad a 27±4ºC durante todo el cultivo.

Evaluación del grado de oxidación de los explantes

Se describió el grado de oxidación de los explantes a los 40 a 42 días de cultivo, usando escalas cualitativas basadas en la intensidad de la oxidación observada macroscópicamente en los explantes. Se utilizó una escala para las porciones de brácteas (figura 2A), una para la bases de las manos (figura 2B) y dos escalas para las flores (figura 3). En estas escalas el grado I correspondió a ausencia de oxidación u oxidación leve, el grado II a oxidación moderada y el grado III a oxidación intensa.

Todos los explantes sembrados fueron observados cada dos semanas durante 7 a 9 meses para determinar la formación de callos blancos, amarillos o embriogénicos.

Análisis estadístico

Se realizaron análisis descriptivos de frecuencias simples para los datos relacionados con el grado de oxidación del explante. Además, se hicieron análisis descriptivos de frecuencias cruzadas para estudiar la asociación de comportamientos de la distribución de frecuencias entre pares de variables. Se confrontó, para cada grado de oxidación (I, II o III), la variable presencia de oxidación con la variable posición de la mano (método 1) o con la variable sección del segmento de la bellota (método 2).

En todos los análisis se usó el programa de computación Statistical Analysis System (SAS), relense 8.01, año 2000.

Resultados y discusión

Se observó aumento de tamaño en todos los explantes cultivados (métodos 1 y 2). Esto también fue registrado dos o tres semanas después de iniciar el cultivo de flores masculinas inmaduras para inducir la embriogénesis somática en los cultivares Gran Enano (Cronauer y Krikorian, 1983), Mas (Musa AA) (Ilker et al., 2007) y Dwarf Brazilian (Khalil et al., 2002).

A los 40 días de cultivo, las porciones de brácteas del 100% de los explantes sembrados según el método 2, presentaron oxidación fenólica de grado II o III en los bordes y de grado I en el resto de la porción (figura 2A). De modo similar, al aplicar el primer método, se observó que el 100% de los explantes presentó oxidación fenólica de grado III en la base a los 42 días de cultivo (figura 2B). Resultados similares fueron obtenidos al sembrar manos de flores masculinas inmaduras del cultivar Mas en un medio semisólido para la inducción de la embriogénesis somática (Cronauer y Krikorian, 1988).

Cuarenta días después del inicio del ensayo se observó que de los explantes sembrados de acuerdo al método 2, el 27,39% carecía de flores y estaba conformado sólo por brácteas, debido a que tales explantes correspondían a la parte apical de las bellotas. Estos explantes se descartaron, considerándose para la descripción del grado de oxidación de las flores el 72,61% restante (395 explantes). De estos explantes, al final del cultivo el 90,63% presentó en las flores una oxidación leve o ausencia de oxidación (grado I), 9,12% tuvo oxidación moderada (grado II) y sólo el 0,25% mostró flores oxidadas intensamente (grado III) (figura 3A).

Con el método 1, a los 42 días de cultivo se obtuvieron los resultados siguientes: las flores del 92,83% de los explantes tuvieron oxidación leve o no estaban oxidadas, la oxidación moderada de las flores ocurrió en el 1,65% de las manos y el porcentaje de explantes con flores oxidadas intensamente fue 7,35% (figura 3B).

El bajo porcentaje de explantes con oxidación intensa en las flores registrado al usar los métodos 1 y 2 es un resultado positivo, ya que las oxidaciones fenólicas pueden constituir un serio problema en el establecimiento de explantes in vitro (Laukkanen et al., 1999).

La oxidación fenólica provoca un fenómeno de ennegrecimiento que ocurre por acción de enzimas tipo polifenoloxidasas y tirosinasas que se liberan o sintetizan cuando los tejidos sufren heridas (Ramírez, 1998), como por ejemplo, las heridas que se ocasionan al realizar cortes para extraer los explantes (Anderson y Ievinsh, 2002). Estas enzimas, contenidas en el citoplasma y las vacuolas (Laukkanen et al., 1999), actúan sobre los polifenoles y la tirosina, oxidándolos a quinonas que son fitotóxicas, sustancias que a su vez pueden polimerizarse y afectar a las proteínas, y en consecuencia, inhibir el crecimiento y la viabilidad de los explantes (Ramírez, 1998).

En este sentido, es importante destacar que aunque en el presente estudio todos los explantes tuvieron oxidación de grado III en la base (método 1), los mismos fueron viables, pues sus flores continuaron creciendo luego de producirse esta oxidación. La oxidación moderada o intensa en los bordes de las brácteas (método 2) tampoco afectó la viabilidad de los explantes.

Los resultados obtenidos en relación a la oxidación de grado III en las flores al usar los métodos 1 y 2, probablemente fueron debido al mantenimiento en solución antioxidante de las bellotas reducidas y al humedecimiento del material vegetal con esta solución durante la extracción de los explantes. También es posible que el cultivo de los explantes en oscuridad evitara una mayor oxidación (Jiménez, 1998).

Como se observa en la figura 4A, la oxidación de grado II en las flores se obtuvo para manos de las posiciones 5, 9, 11, 12, 13, 15 y 16. El mayor porcentaje de explantes con este grado de oxidación (0,74%) correspondió a la posición 5 (manos pequeñas: >0,5 mm), mientras que para el resto de las posiciones, es decir, para manos medianas (0,5-2 mm) y grandes (<2 mm) el porcentaje registrado fue 0,25%.

Con el método 2 la oxidación moderada de las flores ocurrió en explantes de las secciones 1, 2 y 3. El mayor porcentaje de explantes con este grado de oxidación se presentó para la sección 1 (2,94%), donde se encontraban las flores más grandes. En general, se observó que el porcentaje de explantes con oxidación moderada en las flores tendió a disminuir conforme aumentaba el número de la sección, es decir, conforme disminuía el tamaño de las flores.

Al aplicar el método 1 la oxidación de grado III en las flores se presentó en manos de las posiciones 5 a 14, obteniéndose el porcentaje más alto para la posición 6 (1,72%) y el más bajo para la posición 14 (0,25%) (figura 4B). El porcentaje de explantes con oxidación intensa en las flores fue mayor para las manos de menor tamaño (posiciones 5 a 7). Se ha reportado que las manos de flores masculinas inmaduras de Musa con un tamaño inferior a 0,5 mm se necrosan durante la inducción de la embriogénesis somática, mientras que las manos grandes continúan creciendo (Grapin et al., 1998; Grapin et al., 2000).

Con el método 2 la oxidación de grado III en las flores se presentó sólo en un explante, correspondiente a la sección 1 del segmento de la bellota.

La presencia de oxidación en las bases o en las flores de las manos al inducir embriogénesis somática en Musa se ha mencionado en algunos trabajos (Cronauer y Krikorian, 1988; Grapin et al., 1998; Grapin et al., 2000). Sin embargo, en el presente estudio se detalla tanto para el método 1 como para el 2, el porcentaje de explantes que se oxidaron durante la inducción de la embriogénesis somática y la relación del grado de oxidación con la posición de la mano o el tamaño de las flores.

Durante la inducción del estado embriogénico, la presencia de auxinas puede estimular divisiones mitóticas que dan lugar a callos (Gómez, 1998). Se ha reportado que al utilizarse manos de flores masculinas inmaduras de Musa spp. para inducir la embriogénesis somática, los callos embriogénicos se forman sobre callos compactos nodulares amarillos (Grapin et al., 1998; Navarro et al., 1997; Novak et al., 1989). Al aplicar el método 1, se registró este último tipo de callos en el 46,07% de los explantes; sin embargo, ninguna mano dio origen a embriones. Los callos nodulares amarillos se observaron a partir de las 10 semanas de cultivo, correspondiendo 1,23% a explantes con oxidación moderada en las flores, 0,25% a manos con flores oxidadas intensamente y el resto a explantes con oxidación de grado I en las flores. Es probable que la recolección de las bellotas en una época seca haya desfavorecido la formación de embriones.

En esta investigación, 3,49% de los explantes sembrados inicialmente con el método 2 presentaron callos blancos compactos, correspondiendo el 2,94% y el 0,55%, respectivamente, a explantes con oxidación de grado I o II en las flores. La formación de callos blancos tuvo lugar a partir de las 4 semanas de cultivo y ninguno de estos callos formó embriones. En contraposición, Khalil et al. (2002) señalaron que al usar el mismo método para el cultivar Dwarf Brazilian, el 58,75% de los explantes produjo tejidos embriogénicos. Estos autores refirieron que debían realizarse experimentos adicionales para determinar si el alto porcentaje de callos embriogénicos obtenido se debía al cultivar (Musa AAB) o a efectos estacionales.

Con el método 2, los callos compactos amarillos se formaron en el 11,21% de los explantes iniciales, comenzándose a observar después de doce semanas de cultivo. El 0,2% de estos callos se originó de explantes con flores oxidadas moderadamente y el resto, de explantes con oxidación de grado I en las flores. Los callos embriogénicos se presentaron en el 0,92% de los explantes sembrados inicialmente, formándose sólo sobre callos amarillos provenientes de explantes con oxidación de grado I en las flores.

Los resultados del presente ensayo son de gran relevancia, pues el método 2, propuesto para la extracción de explantes con flores masculinas inmaduras del plátano Dwarf Brazilian, no ha sido reportado para Gran Enano ni para otros cultivares de Musa. Además, este trabajo es el primero en el que se ofrecen todos los detalles para lograr la extracción exitosa de explantes siguiendo tal método.

Conclusiones

La intensa oxidación fenólica en las bases de las manos o en los bordes de las brácteas no afectó la viabilidad de las flores. La oxidación de los explantes extraídos por los métodos 1 y 2 no representó un problema para su establecimiento in vitro.

Agradecimiento

Se agradece al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad del Zulia (CONDES-LUZ) por financiar esta investigación (Proyecto CC-0065-04) y a BANAORO, C.A. por suministrar el material vegetal.

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