Polimorfismo -219 G/T en el gen APOE en relación con los niveles de colesterol y la enfermedad aterosclerótica en Argentina.

Virginia Bañares^1,2, Diego Wyszynski ³, Laura Schreier⁴ y Marcelo Tavella^2,5.

¹Centro Nacional de Genética Médica, Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud ¨Dr. Carlos Malbrán¨, Buenos Aires, ²Programa de Prevención del Infarto en Argentina (PROPIA), Universidad Nacional de La Plata, Comisión de Investigaciones Científicas (CIC), Provincia de Buenos Aires, La Plata, ³Genetics Program, Boston University School of Medicine, Boston, Massachusetts, USA, ⁴Laboratorio de Lípidos y Lipoproteínas, Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires e ⁵Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata, La Plata. Argentina. 

Autor de correspondencia: Virginia Gabriela-Bañares. Santa Rosa 2801 UF6, 1644, Victoria (San Fernando), Buenos Aires, Argentina. Fax: (54 11) 4801-4428/2326/4745-1882. Correo electrónico: vgbaniares@hotmail.com.

Resumen. El alelo ε4 del gen APOE se asocia con riesgo aumentado de Enfermedad Cardiovascular Aterosclerótica (ECA) y con mayores concentraciones de colesterol total (CT) y de LDL (c-LDL) en plasma; sin embargo, algunos estudios no reprodujeron esos resultados. Esta controversia señala que otros factores, genéticos y/o ambientales podrían actuar sobre estas asociaciones. Variaciones cuantitativas en los niveles de expresión del gen originadas por polimorfismos en el promotor, como el -219G/T, podrían tener un rol como factor de riesgo de la enfermedad. Previamente los autores del presente trabajo hemos reportado la asociación entre el alelo ε4 y la presencia de lesiones ateroscleróticas en varones. En este trabajo se investiga si hay asociación entre el polimorfismo APOE -219G/T, la ECA y los niveles de lípidos en plasma. Se estudiaron 380 muestras de ADN de pacientes con estudios angiográficos realizados, provenientes de la zona sur de la provincia de Buenos Aires. El análisis con regresiones logísticas mostró diferencias no significativas en las distribuciones del alelo T y del alelo G entre casos y controles, aún después de estratificar por sexo y por edad. Con regresiones lineales se observó que: hay diferencias no significativas entre los niveles de CT y c-LDL y la presencia/ausencia del alelo T, pero el alelo G se asoció con valores más elevados de CT (p=0,001) y de c-LDL (p=0,020) en varones. Entre mujeres no hubo diferencias significativas. Estos resultados señalan que el alelo G del polimorfismo -219 del gen APOE se asocia con valores mayores de CT y LDL-c en varones, pero este polimorfismo no actuaría como un factor de riesgo de ECA en la población argentina.

Palabras clave: Apolipoproteína E, factores de riesgo, aterosclerosis, colesterol. 

APOE -219G/T Polymorphism related to serum lipid levels in atherosclerotic patients from Argentina.

Abstract. APOE ε4 allele is associated with increased risk for Coronary Artery Disease and higher concentrations of total-cholesterol and low-density-lipoprotein-cholesterol; however, some studies could not reproduce these results. This fact suggests that other genetic or environmental factors are acting on these associations. Quantitative variations of gene expression, conferred by polymorphisms in the promoter area, as -219G/T, could play also a role as a risk factor for CAD. Since, in a previous study, we found an association between the APOE ε4 allele and atherosclerotic lesions in males of our population, we investigated now whether the APOE promoter polymorphism -219 G/T is also associated with the presence of atherosclerotic lesions and plasma lipid levels. Genotypes were obtained from 380 DNA samples from patients undergoing an angiography study. Logistic regression analysis showed no significant associations between T allele, or G allele, and the presence of atherosclerotic lesions. Lineal regression analysis showed association between G allele and higher TC (p=0.002) and LDL-c (p=0.022) levels. After stratified by sex: TC (p=0.001) and LDL-c (p=0.020) for males, females showed no significant differences. For cases and controls groups, the allele G has still been associated with higher levels of TC (p=0.007, p= 0.048 respectively). No associations for T allele were observed. We conclude that G allele of polymorphism -219 on the promoter of APOE gene is associated with higher TC and LDL-c levels in males, but this polymorphism is not acting as a risk factor of CAD in our population.

Key words: Apolipoprotein E, APOE, risk factor, cholesterol, genetics. 

Recibido: 10-12-2008. Aceptado: 08-07-2009. 

INTRODUCCIÓN 

En Argentina, las cifras de morbi-mortalidad causadas por enfermedades cardiovasculares están entre las más altas de América (1). 

El fin del estudio genético de la Enfermedad Cardiovascular Aterosclerótica (ECA) es determinar las variaciones en el genoma que puedan ser utilizadas para predecir el riesgo del individuo de presentar la enfermedad, su grado de progresión y su severidad (2). Los factores de riesgo de tipo genético pueden mejorar la predicción de riesgo de ECA y al no modificarse con la progresión de la enfermedad pueden brindar una valoración más precisa. 

La apolipoproteina E (apo E) tiene un rol esencial en el control homeostático de la concentración del colesterol (3, 4). En los humanos, apo E es un componente estructural tanto de los quilomicrones como de los remanentes de las VLDL (lipoproteínas de muy baja densidad) y también está presente en las HDL (lipoproteínas de alta densidad) interviniendo en el transporte reverso del colesterol. En las células de las lesiones ateroscleróticas humanas hay expresión del gen APOE (5) y ésta influye en la excreción del colesterol de estas células (6). El gen APOE fue estudiado en varias poblaciones y más allá de las contradicciones de algunos reportes (7), hoy hay una nutrida evidencia de la asociación entre el alelo e4 y el aumento en el riesgo y la severidad de la Enfermedad Cardiovascular Aterosclerótica (8-10) y con los niveles de lípidos en plasma (11, 12). También hay resultados opuestos respecto de la relación entre el genotipo de APOE y la respuesta lipoproteica a las modificaciones en la dieta (13-16). Estas discrepancias que surgen entre distintos estudios, sugieren que otros factores genéticos y/o ambientales están actuando sobre estas asociaciones. 

En la zona reguladora del gen APOE hay polimorfismos genéticos descriptos que presentan distinta actividad transcripcional basal para sus variantes polimórficas o alelos (14). Se observaron distintas concentraciones de apoproteina E en plasma para los dos alelos, G y T, del polimorfismo -219, y distinta respuesta a la dieta (15). El alelo T se asoció con el aumento de riesgo de sufrir un infarto de miocardio en la población francesa (15) y de enfermedad coronaria en la población finlandesa (16). 

Se puede esperar, que además de las modificaciones cualitativas de los alelos e sobre la estructura de las proteínas, variaciones cuantitativas en la expresión del mRNA también jueguen un rol como factor de riesgo de enfermedad coronaria. 

En el trabajo actual se investiga si el polimorfismo -219 G/T, en la zona reguladora de este gen, se asocia con la enfermedad cardiovascular aterosclerótica y con los niveles de lípidos plasmáticos en una muestra de la población Argentina. 

MATERIAL Y MÉTODOS 

Se recolectaron muestras de sangre de pacientes de ambos géneros, con indicación de estudio angiográfico, residentes en la zona sur de la provincia de Buenos Aires, reclutados consecutivamente entre los años 1998 y 2000 en el Servicio de Hemodinamia del Instituto del Tórax de La Plata, Buenos Aires. En todos los casos se obtuvo el consentimiento informado acorde a los lineamientos institucionales locales. La indicación del estudio se realizó, tanto por sospecha clínica de enfermedad cardiovascular aterosclerótica, como por evaluación prequirúrgica en casos de cirugías valvulares. Todos los estudios angiográficos se realizaron con el mismo aparato y con el mismo equipo de trabajo. Según el informe de la cineangiocoronariografía se clasificaron como casos, aquellos que presentaron estenosis arterial mayor o igual al 50% y como controles, aquellos con informe de angiografía normal (17, 18). Los pacientes con estenosis menor al 50% fueron excluidos. Las muestras de sangre se extrajeron de pacientes con 8 a 12 h de ayuno, en dos tubos de plástico, uno de ellos con EDTA como anticoagulante para la extracción del ADN y el otro sin anticoagulante para separar posteriormente el suero. Se almacenaron a –20°C hasta su procesamiento. Sobre 390 muestras recolectadas, 263 fueron casos: 68 (25,9%) mujeres, 195 (74,1%) varones y las restantes 127 fueron controles: 62 (48,8%) mujeres y 65 (51,2%) varones. 

El ADN se purificó a partir de 390 muestras de sangre anticoagulada con EDTA con la técnica de ¨Salting Out¨ descripta por Miller y col. (19). Los genotipos se obtuvieron en 380 muestras con PCR-RFLP. Se utilizó un ¨primer¨ con un cambio de base para introducir un sitio de corte para la enzima Bstzn I cuando el alelo G estuviese presente. Los segmentos de ADN se separaron en gel de poliacrilamida al 15%, a 4°C y tampón TBE 1X. Se visualizaron por tinción con plata. 

Los valores de colesterol total (CT), colesterol de LDL (c-LDL) y de colesterol de HDL (c-HDL) se determinaron con métodos estandarizados en 339 muestras de suero. 

El análisis estadístico se realizó con el software Stata, version 9.2 (Stata Corporation, 2006). Se realizaron regresiones múltiples, regresión logística para obtener ¨odds ratios¨ (OR) y sus intervalos con un 95% de confianza para evaluar casos y controles y regresión lineal para examinar los valores de lípidos plasmáticos. En ambos casos los genotipos se agruparon por un lado, según la presencia/ausencia del alelo T (número de individuos con genotipo TT o GT vs. número de individuos con genotipo GG) y por otro lado, por la presencia/ausencia del alelo G (número de individuos con genotipo GG o GT vs. número de individuos con genotipo TT). En el cálculo de las medias lipídicas se eliminaron los datos de los individuos que tomaban hipolipemiantes. Las edades se compararon mediante la prueba de ANOVA. 

RESULTADOS 

Las características generales de la muestra están presentadas en la Tabla I. La comparación entre casos y controles reveló que entre los casos hubo mayor proporción de fumadores, p=0,008 (OR=2,12 95% IC 1,21-3,71); mayor proporción de varones p< 0,0001 (OR=2,74 95% IC 1,75-4,26); y valores más elevados de colesterol total (p= 0,0108) y colesterol de LDL (p=0,0042) y menor valor de colesterol de HDL (p=0,0020).

TABLA I

CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DE LA MUESTRA ESTUDIADA 

* Sujetos con enfermedad cardiovascular aterosclerótica.    IC intervalo de confianza. 

La distribución de los genotipos, del alelo T y del alelo G del polimorfismo -219 G/T, entre casos y controles, para varones y mujeres está resumida en la Tabla II. El análisis estadístico mostró diferencias no significativas en la presencia/ausencia del alelo T entre casos y controles, ajustado por sexo y edad, p=0,732 (IC 95%, 0,559 -1,502). Al agrupar por la presencia/ausencia del alelo G, también se observaron diferencias no significativas, p=0,471 (IC 95%, 0,720-2,029). Al estratificar la muestra por sexo y por edad se obtuvieron diferencias no significativas.

TABLA II

DISTRIBUCIÓN ALÉLICA Y GENOTÍPICA DEL POLIMORFISMO -219 G/T EN EL GEN APOE 

Se indica el número de individuos observado y el porcentaje. 

El valor medio de la edad, agrupando por cada genotipo resultante fue: 57,97 ± 8,88, 56,36 ± 9,24 y 56,60 ± 9,27 años entre los casos y 54,12 ± 11,14, 57,95 ± 8,83 y 54,87 ± 11,87 años entre los controles para los genotipos GG, GT y TT respectivamente. La prueba de ANOVA mostró que las diferencias no fueron significativas (p=0,467) para los casos ni (p=0,177) para los controles. 

Los valores medios de CT, c-LDL y c-HDL para portadores y no portadores del alelo T mostraron diferencias no significativas, p=0,483 (IC 95%, -7,735 – 16,333), p=0,630 (IC 95%, -8,994 – 14,822) y p=0,309 (IC 95%, -5,011 – 1,593) respectivamente. 

Al agrupar por la presencia/ausencia del alelo G, los valores de CT y c-LDL fueron significativamente más altos, p=0,002 (IC 95%, -33,199 – -7,509) y p=0,022 (IC 95%, -28,699 – -2,207) respectivamente cuando el alelo G está presente. Al estratificar por el género, solo en el grupo de los varones las diferencias resultaron significativas, CT, p=0,001 y c-LDL, p=0,020 (Tabla III). Al estratificar por edad, CT, p=0,044 y c-LDL, p=0,046 para los menores de 61 años, mientras que para los mayores de 60 años, CT, p=0,001 y c-LDL, p=0,08. Los valores medios de c-HDL entre los portadores y no portadores del alelo G mostraron diferencias no significativas, p=0,305 (IC 95%, -5,324 – 1,669).

TABLA III

VALORES MEDIOS DE COLESTEROL TOTAL (CT), COLESTEROL DE LDL (c-LDL), COLESTEROL DE HDL (c-HDL) EN VARONES Y MUJERES PORTADORES Y NO PORTADORES DEL ALELO G 

Valores expresados en mg/dL.    DE: desviación estándar.    n: número de muestras.    NS: no significativo. 

DISCUSIÓN 

La finalidad de este estudio fue evaluar si el polimorfismo -219 G/T en la zona promotora del gen APOE actuaría como factor de riesgo de enfermedad cardiovascular aterosclerótica en la población argentina. La población de este estudio mostró las características propias de una muestra de este tipo (20), entre los casos hubo mayor proporción de varones, 3 por cada mujer, más fumadores, valores mas elevados de colesterol total y de LDL y menor valor de colesterol de HDL. 

La distribución del polimorfismo entre individuos con lesiones ateroscleróticas (casos) fue semejante a la de los individuos sin lesiones (controles). Esta semejanza se mantuvo cuando se evaluaron sólo los varones, solo las mujeres o cuando se seleccionaron grupos por edad, menores de 61 años y mayores de 60. Entonces, este polimorfismo no actuaría como un factor de riesgo de aterosclerosis en esta muestra de nuestra población. Esta afirmación concuerda con el hecho de que las edades medias de los individuos agrupados por los genotipos, tanto entre los casos como entre los controles, fueron semejantes. Cuando un alelo se asocia como un factor de riesgo para una enfermedad, se puede esperar que la edad a la cual se manifieste la enfermedad sea menor entre los portadores de dicho alelo. 

Los valores de colesterol total, de LDL y colesterol de HDL para los portadores del alelo T y los no portadores fueron semejantes. Estos resultados concuerdan con los hallados en otras poblaciones, finlandesa (16, 21) y francesa (15). Cuando se agruparon considerando la presencia o no del otro alelo, el G, los valores de colesterol de HDL no mostraron diferencias, sin embargo los niveles de colesterol total y de LDL fueron más elevados en los portadores del alelo G. Las diferencias en los valores de colesterol total se mantuvieron cuando se consideró la edad y la enfermedad, pero al separar por el sexo sólo los varones conservaron las diferencias. Esta relación entre colesterol más alto asociado al alelo G en este estudio es llamativa. Este alelo se asoció con mayor actividad transcripcional y mayor expresión de apo E por lo cual se esperarían menores niveles de colesterol. Sin embargo, hay que tener presente que esos estudios se realizaron en cultivos de tejidos provenientes de pacientes con Enfermedad de Alzheimer (17). Por otro lado Lambert también encontró un resultado llamativo, observó mayor concentración de apo E plasmática sin variación en los niveles de colesterol entre pacientes que sufrieron infarto de miocardio (15). Los presentes resultados se asemejan a los del estudio de Ye y col. (22) en la población inglesa con aterosclerosis y los de Viiri y col. (21) en la población general finlandesa, porque en ambos los valores de colesterol fueron mayores en los individuos con genotipo GG respecto del TT, aunque esas diferencias no alcanzan la significancia y no hay datos de agrupación por el alelo G ni de concentración de apo E plasmática. 

En el estudio ECTIM en la población francesa Lambert y col. (15) propusieron que el alelo T aumenta el riesgo de infarto de miocardio en asociación con menores concentraciones de apo E plasmáticas, pero no encontró diferencias en los niveles de colesterol. Este estudio y el presente tienen varias diferencias: en el actual se analizan ambos géneros mientras que en el de Lambert solo incluyeron varones; las edades de la muestra actual presentaron un rango más amplio (30-80 años) que las del trabajo mencionado (25-64 años), aunque nosotros estratificamos por género y por edad en el análisis. La principal diferencia es que Lambert y col. (15) estudiaron pacientes sobrevivientes de infarto de miocardio, es decir que sufrieron un evento trombótico, mientras que nuestra muestra fue de pacientes con estenosis mayor o igual al 50%. Como señalaron los autores, los mecanismos por los cuales este polimorfismo actuaría sobre un evento trombótico no se conocen y deben ser investigados, pero dado que los niveles de lípidos no estaban elevados esos mecanismos podrían ocurrir en la pared de las arterias e influir en la progresión y/o la estabilidad de las placas ateroscleróticas y no involucrarían necesariamente el metabolismo lipoproteico y los niveles de colesterol plasmático. 

Ye y col. en el estudio de Southampton en la población inglesa (22), observaron que entre los casos con aterosclerosis más severa, expresada por el número de vasos con estenosis, el alelo T era más frecuente que entre los casos más leves, por lo cual propuso una relación de asociación entre el alelo T y la severidad de la enfermedad coronaria, pero esa relación no involucraría los niveles plasmáticos de colesterol porque no observó diferencias en ellos. Este estudio y el actual tienen una gran diferencia, en ese trabajo solo se evalúa la severidad de la enfermedad, mientras que en el nuestro sólo se evalúa presencia o ausencia de la enfermedad o enfermos vs. ¨sanos¨ (sin aterosclerosis). De todos modos, se puede pensar que si en nuestro caso el alelo T también estuviese influyendo sobre la evolución de las lesiones ateroscleróticas se tendría un enriquecimiento en la frecuencia del alelo entre las más severas y disminución de la misma entre las más leves, como esos dos grupos no se separaron esas diferencias se compensarían y no se detectaría su efecto. A nivel funcional una posible explicación sería que el polimorfismo no tendría influencia en el inicio de la enfermedad, pero una vez iniciada sí podría tener efecto en su progresión. 

Es de esperarse que otros factores de riesgo estén influyendo y modulando tanto sobre el inicio como sobre el progreso de las lesiones ateroscleróticas. En este sentido se evaluó la prevalencia de la hipertensión arterial y la diabetes, entre los genotipos y se observó mayor proporción de pacientes con hipertensión y con diabetes entre los que tenían genotipo GG respecto de los otros genotipos, pero sólo en el caso de los diabéticos esas diferencias fueron significativas (p=0,044) (datos no mostrados). 

En la bibliografía hay estudios donde observaron relación entre este polimorfismo, los niveles de colesterol y la dieta, la cual a su vez también es un factor de riesgo de ECA. En individuos sanos los niveles de colesterol varían en forma diferente en respuesta a distintas dietas según los alelos presentes y según el género (15). Los mecanismos de acción no se conocen y estas observaciones se realizaron en individuos sanos y jóvenes. 

Viitanen y col. (16) observaron que entre pacientes con aterosclerosis prematura el alelo T era más frecuente respecto de la población general finlandesa, sin embargo no encontraron relación entre el alelo y los niveles plasmáticos de colesterol. En ese trabajo y el presente, las frecuencias genotípicas del alelo T entre los casos son muy similares, pero cuando se observan los grupos controles de ambos estudios, en el actual hay mayor presencia del alelo T. Es decir que las diferencias entre ambos resultados podrían deberse a posibles diferencias entre los grupos controles. Los controles de este estudio fueron pacientes con angiografía normal, a quienes en general se les indicó el estudio antes de una cirugía valvular, mientras que el grupo control del otro trabajo fue de la población general. Ambos estudios contienen varones y mujeres, evaluación angiográfica de los casos y si bien las edades fueron más amplias, en el análisis de los datos se realizó estratificación por edad. Una diferencia importante a tener en cuenta es que en el estudio de Viitanen y col. (16) los casos provenían de familias con antecedentes de enfermedad coronaria prematura, mientras que en el actual ese no fue un criterio de inclusión en la selección de la muestra. Por otro lado, los ambientes de ambos estudios, expresados principalmente por las dietas y las costumbres de ambas poblaciones fueron distintos. 

El estudio presente tiene la limitación de no contar con un gran número de muestras, pero hay que resaltar la alta homogeneidad de las mismas, en especial por su procedencia, una zona geográfica única y pequeña, la zona sur de los alrededores de la Ciudad de La Plata en la provincia de Buenos Aires, con individuos de condiciones culturales y socio-económicas muy semejantes. El rango de edades amplio (30 a 80 años) sumado a un tamaño muestral reducido también limita en la posibilidad de construir haplotipos con los alelos épsilon de este gen (datos disponibles en parte de un estudio previo) con el fin de evaluar posibles efectos sinérgicos entre ambos loci. Esta limitación se exacerba en especial si tenemos presente que el alelo e4 actúa como un factor de riesgo de la enfermedad en forma dependiente de la edad (9, 23), por esta razón no se realizó ese análisis y solo se evaluó el polimorfismo -219 G/T que actúa en forma independiente de los alelos épsilon (18, 24). 

En la bibliografía no hay reportes en los cuales se evalúe directamente al alelo G de este polimorfismo, con excepción de un estudio reciente en la población belga en el cuál se asoció al alelo G con la ocurrencia de accidente cerebrovascular pero no con la severidad de la aterosclerosis (24), los autores especularon que el polimorfismo podría actuar a nivel de la estabilidad de las placas ateroscleróticas intracraneales. 

La enfermedad aterosclerótica es una afección multifactorial con un fuerte componente ambiental, los mecanismos involucrados aún no están comprendidos y es de esperarse que en distintos contextos, generados por diferencias geográficas y culturales, más allá de la etnia, el peso de cada uno de ellos sea distinto. 

En conclusión el alelo G del polimorfismo -219 en el promotor del gen APOE se asociaría en la población argentina a valores más elevados de colesterol total y LDL en varones, independientemente de la edad pero no actuaría como un factor de riesgo en el desarrollo de la enfermedad cardiovascular aterosclerótica. 

AGRADECIMIENTOS 

A la Fundación Alberto J. Roemmers que apoyó económicamente esta investigación. 

A la Méd. Fabiana Quesada por su enorme dedicación y colaboración en el laboratorio. 

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