Mycoplasmas and antibodies anti-Chlamydia in semen of infertile men and their relationship with seminal quality and markers of male accessory sex glands.

Abstract.

Male infertility may be due to inflammation or infection of the genital tract among other causes. Male accessory sex glands and sperm function may also be involved in the problem of infertility. This study tries to associate the most frequent bacteria in semen of infertile men including Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum with the seminal characteristics and levels of fructose, citric acid and a-neutral glucosidase as markers of the accessory glands. Detection of antibodies anti Chlamydia trachomatis indicated that it was the most prevalent germ. Antibodies (Ab) anti-Chlamydia, Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum were associated with a decrease of the glandular markers fructose and a-neutral glucosidase. On the other hand, there were increased pH and leukocytospermia in men positive for antibodies anti-Chlamydia. Microbiological and biochemical evaluation of semen could orient more about the spread of infection and allow for the selection of the most effective therapy. We find that microbiological and glandular accessory markers assessments in semen are important to diagnose and to treat infections.

Recibido: 20-09-2011. Aceptado: 17-05-2012

INTRODUCCIÓN

La prevalencia de la infección de las glándulas sexuales accesorias masculinas ha tomado importancia en las últimas décadas, aunque sus efectos sobre los parámetros seminales clásicos y sobre el tracto reproductor femenino ha sido también tema de discusión (1-4). 

La infección puede localizarse en una o más de las glándulas sexuales accesorias masculinas a nivel de epidídimo, vesículas seminales o próstata, tanto unilateral como bilateralmente (5). La infección masculina se ha asociado con cambios seminales como descenso en el volumen, la concentración y la movilidad espermática; además de cambios en los marcadores químicos de glándulas sexuales accesorias e incremento de las especies oxígeno reactivas (EROS) (6). 

La infección de vesículas seminales se ha relacionado con: alteración de los niveles de fructosa, volumen seminal, y movilidad espermática (7, 8). Se ha demostrado que en infección prostática los niveles de ácido cítrico disminuyen (9) y guardan relación inversa con la elastasa leucocitaria (10). Por otra parte se ha asociado descenso de marcadores prostáticos con oligoastenoteratozoospermia (10, 11). La epididimitis puede producir astenozoospermia y los productos secretados por esta glándula tienden a ser bajos, sin mostrar cambios en la concentración de leucocitos (11). El descenso de un importante marcador epididimario como la actividad de a-glucosidasa neutra (AGN) se ha asociado con obstrucción del transporte espermático entre epidídimo y conducto eyaculatorio, en hipoandrogenismo, y durante o después de un estado de infección/inflamación (12, 13). 

Se han encontrado diversos microorganismos en los cultivos seminales de hombres infértiles con y sin leucocitospermia donde se destacan Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Chlamydia trachomatis, E. coli, Klebsiella, Proteus, Enterococcus, Staphylococcus y Neisseria gonorrheae entre otros (14-16). 

A menudo las infecciones causadas Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum son asintomáticas e inespecíficas (17-20). Se ha considerado a Chlamydia trachomatis (Cht) el microorganismo más común en las enfermedades de transmisión sexual hasta en un 40% de las parejas infértiles (21-22). Los anticuerpos anti-Chlamydia trachomatis (Ac-antiCht) del iso-tipo IgA se han asociado con una respuesta inflamatoria del tracto genital masculino, pero no con alteraciones de los parámetros seminales (23). Se han encontrado títulos altos de IgA (Ac-antiCht) en suero de hombres infértiles; la IgG (Ac-antiCht) se ha correlacionado con baja movilidad, baja concentración espermática, teratozoospermia, y leucocitospermia (24-25). 

Entre las especies de Mycoplasma se considera que Ureaplasma urealyticum afecta el contaje espermático y la movilidad, generando infertilidad (14, 26, 27), mientras que el impacto del Mycoplasma hominis sobre los parámetros seminales y la fertilidad han sido tema de discusión (14, 27). 

U. urealyticum se ha detectado en el 33,7% de las muestras de semen de hombres infértiles, en las cuales se observó descenso de la a-glucosidasa neutra y de la calidad espermática, sin cambios en el volumen seminal, la fructosa ni la fosfatasa ácida (28). En otro estudio se observó teratozoospermia con aumento en la concentración de leucocitos y de especies oxígeno reactivas asociados a la presencia de U. urealyticum (29). 

Los objetivos de este estudio fueron evaluar la calidad seminal y los niveles de marcadores químicos de glándulas sexuales accesorias en hombres infértiles positivos y negativos para la presencia de Mycoplasmas, otros gérmenes y anticuerpos anti- Chlamydia. 

PACIENTES Y MÉTODOS 

Se estudiaron 300 hombres infértiles de edades comprendidas entre 20 y 57 años. Se consideraron infértiles porque no habían logrado concebir durante el transcurso de un año manteniendo relaciones sexuales frecuentes (2 a 3 veces por semana) sin el uso de métodos anticonceptivos. Los individuos asistieron por infertilidad primaria o secundaria al Centro de Diagnóstico de Infertilidad y Enfermedades Genéticas (CEDIEG) de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de Los Andes, Mérida-Venezuela, para ser evaluados. Cada participante fue informado sobre la naturaleza, importancia, objetivos y alcances de la investigación. A aquellos que decidieron participar voluntariamente se les solicitó el consentimiento informado por escrito. Para el estudio se excluyeron pacientes clínicamente evaluados con hipogonadismo, varicocele, hidrocele o diabetes. El estudio fue realizado siguiendo los lineamientos establecidos en la Declaración de Helsinki para investigación en humanos reseñados en el Código de Bioética y Bioseguridad del FONACIT (30). 

Tanto las muestras de semen como de suero sanguíneo de los 300 hombres fueron muestras individuales de cada paciente. Se determinó la frecuencia de los microorganismos en semen y su relación con los parámetros seminales. Se compararon los marcadores químicos glandulares en los grupos con Ac-antiCht, M. hominis, U. urealyticum y sin infección.

Obtención y procesamiento de las muestras 

Espermograma: las muestras de semen fueron obtenidas por masturbación siguiendo las pautas establecidas por el quinto manual de la Organización Mundial de la Salud para el análisis de semen (31). 

Seguida la licuefacción del semen se tomaron 1,5 mL de cada muestra, 1,0 mL se sometió a centrifugación 1500 g durante 10 minutos para obtener plasma seminal y se guardaron en dos alícuotas de 200 µL c/u a –20°C para (A) la determinación de fructosa, ácido cítrico y 1,4 a-glicosidasa neutra. (B) Los 0,5 mL de semen restante se destinaron para cultivo en placa de bacterias aeróbicas y microaerófilas facultativas, cultivo en pozos para Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Candida albicans y Trichomonas sp y (C) medición de los anticuerpos (Ac) IgA. 

Los pacientes con volúmenes seminales muy bajos (<0,5 mL) se evaluaron en dos fases, primero el análisis seminal y los marcadores glandulares, y en la segunda fase se solicitó una nueva muestra para el análisis microbiológico y detección de Ac IgA antiCh.t en un transcurso <15 días.

Marcadores de glándulas sexuales accesorias masculinas 

Fructosa: se determinó mediante la prueba de Seliwanoff, para lo cual empleamos resorcinol al 0,5% y HCL concentrado y se expresó en mmol/eyaculado (32, 33).

Ácido cítrico: se determinó mediante reacción colorimétrica establecida en el método de Chambón y Roe que consistió en incubar el plasma seminal con anhídrido acético al 82% y piridina al 18% al frío, el producto de condensación de citrato en medio anhídrido se midió espectrofotométricamente y la concentración se expresó en mmol/eyaculado como indicador de la función prostática (34).

1,4-aglicosidasa neutra (AGN): se midió de acuerdo al método fotométrico (35, 36). La actividad de AGN se calculó midiendo el producto de hidrólisis paranitrofenol tras 2 horas de incubación a 37°C pH 6,8 y se expresó en UI/eyaculado.

Evaluación microbiológica 

Cultivos en placas: a fin de determinar la presencia de cocos y bacilos aeróbicos y microaerófilos facultativos se realizaron cultivos del sedimento seminal en placas de agar para el descarte de Enterobacterias, Neisseria gonorroheae, Streptococcus sp y Staphylococcus sp. Se utilizaron 0,2 mL de semen fresco en 1,8 mL de solución salina fisiológica estéril, cada muestra fue mezclada se centrifugó a 1.500 g por diez minutos para remover el plasma seminal, se descartaron 1,8 mL del sobrenadante y 0,2 mL del sedimento obtenido fue resuspendido para el cultivo en placa con asa calibrada. El sedimento libre de plasma seminal fue empleado con el objeto de remover sustancias bacteriostáticas propias del semen (37). Los sedimentos se sembraron en 4 placas de agar: sangre 5% (5%CO₂), chocolate (5%CO₂), Thayer-Martin, manitol salado y Mc Conckey, y se incubaron a 37°C durante 48 horas. A los cultivos positivos se les realizó su antibiograma específico (38). 

Cultivos en pozos de Mycoplasmas M. hominis y U. urealyticum: El semen fue diluido 1:10 en solución salina fisiológica estéril (0,2 mL+1,8 mL) y sembrado en pozos con medio enriquecido A7 (Mycoplasma System Plus, Diagnostici Liofilchem). El estuche contenía pozos de identificación para M. hominis y U. urealyticum; con pozos individuales. La identificación, cuantificación de colonias y susceptibilidad se realizaron siguiendo las instrucciones de los fabricantes del estuche de diagnóstico. El estuche comercial contenía adicionalmente un pozo TR/Y con medio de cultivo para el descarte de Candida albicans y Trichomonas sp., mediante la observación microscópica de clamydiosporas, hifas o trofozoitos a las 48 h de incubación.

Determinación de anticuerpos (Acs) anti Chlamydia

Anticuerpos locales IgA Ac-antiCht: Se usó un estuche comercial (Sero ELISA; El Diagnóstico de Savyon, Beer-Sheva, Israel). El procedimiento se realizó según las instrucciones del fabricante. Los controles positivos y negativos fueron incluidos en cada ensayo.

Anticuerpos en sangre periférica IgG Ac-antiCht: A cada paciente se le extrajeron 3 mL de sangre venosa. Post coagulación los sueros se obtuvieron por centrifugación a 1500 g durante 15 minutos y se guardaron a –20°C hasta el momento del análisis, siguiendo las mismas pautas sugeridas por el estuche comercial para IgG Ac-antiCht (Sero ELISA; El diagnóstico de Savyon, Beer-Sheva, Israel). 

Valores de absorbancia por encima del límite para anticuerpos IgG (periféricos) e IgA (locales) se consideraron positivos para C. trachomatis. 

El análisis descriptivo de las variables categóricas se realizó a través de frecuencias simples y porcentajes simples. Se empleó la prueba de t-student para el análisis inferencial, tomando en cuenta un valor de p < 0,05. Para el análisis estadístico se utilizó el programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS) versión 10.0. 

RESULTADOS

El estudio de las muestras obtenidas de los 300 pacientes determinó que 141 de ellos (46,9%) tenían cultivos positivos o la presencia de Ac-antiCht IgA y/o IgG. Los Ac-antiCht estaban presentes en un 21,3% de los 300 pacientes. De los 64 pacientes positivos para Ac-antiCht 42,3% presentaron las isoformas IgA, 18,7% la forma IgG y ambas un 39%. En los cultivos de semen se identificaron 8 microorganismos diferentes cuya distribución se encuentra en la Tabla I. Diez de estos 300 pacientes fueron positivos para dos o más gérmenes (³2) simultáneamente mientras que cinco presentaron Ac-antiCht simultáneamente con otro microorganismo.

TABLA I. FRECUENCIA DE BACTERIAS Y DE ANTICUERPOS ANTI-Chlamydia IDENTIFICADOS EN LOS PACIENTES 

Al comparar las características seminales de los grupos Ac-antiCht, Mycoplasmas (M. hominis + U. urealyticum) y el grupo denominado positivo para otros patógenos (Staphylococcus sp + Streptococus sp + E. coli + Klebsiella sp + Enterobacter sp) con el grupo sin infección, no se encontraron diferencias significativas en cuanto al valor promedio de volumen, producción espermática, morfología ni movilidad. En el grupo positivo para Ac-antiCht la concentración de leucocitos fue significativamente más alta (p<0,001). Los pacientes con infección por dos o más gérmenes no se incluyeron en este estudio (Tabla II). 

TABLA II. CARACTERÍSTICAS SEMINALES EN HOMBRES INFÉRTILES SIN INFECCIÓN Y POSITIVOS PARA MYCOPLASMAS, OTROS PATÓGENOS Y ANTICUERPOS ANTI-Chlamydia trachomatis 

^a P<0,001.    Valores promedio ± error estándar (EE).    Morfología (% de formas normales); espermatozoides móviles progresivos: rápidos + lentos.    Pacientes positivos para Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum [Pos(+) Mh y Uu]; otros patógenos y con Anticuerpos anti-Chlamydia (Ac-antiCht) IgA y/o IgG comparados con pacientes sin infección: a p<0,001 t-student no pareado de una cola.

La valoración bioquímica de los marcadores glandulares reveló que el marcador de vesículas seminales (fructosa) se encontró disminuido cuando estaban presentes los Ac-antiCht (p<0,001) y los Mycoplasmas (p<0,01); el marcador prostático (ac. cítrico) no presentó diferencias significativas en ninguno de los grupos; el marcador epidimario (a-glucosidasa) estaba significativamente reducido en el grupo con Ac-antiCht (p<0,001) y Mycoplasmas (p<0,005); y se observó aumento significativo del pH en el grupo con Ac-anti Cht al ser comparados con el grupo sin infección. Los pacientes con ³2 gérmenes no se incluyeron en estos grupos (Tabla III).

TABLA III. MARCADORES GLANDULARES Y pH EN HOMBRES INFÉRTILES SIN INFECCIÓN Y POSITIVOS PARA MYCOPLASMAS, OTROS PATOGENOS Y ANTICUERPOS ANTI-Chlamydia trachomatis 

Valores promedio ± error estándar (EE).     Concentración de fructosa y ácido cítrico en µmol/eyaculado, actividad de a-glucosidasa en Unidades/eyaculado (U/eyac).     Pacientes positivos para Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum, otros patógenos y con Anticuerpos anti-Chlamydia (Ac-antiCht) IgA y/o IgG comparados con pacientes sin infección: ^ap<0,01; ^bp<0,005; ^cp<0,001 t-student no pareado de una cola.

DISCUSIÓN

La determinación de anticuerpos IgG e IgA Ac-anti Cht como indicador de que los pacientes han estado o están expuestos a este patógeno, y la detección de otros patógenos por cultivo de semen, demostró que la mayor incidencia en pacientes infértiles positivos para infección correspondía a la presencia de anticuerpos anti Ch.t (64/141), coincidiendo con otras investigaciones con similares resultados. Cht no fue detectada directamente sino por la determinación de sus anticuerpos, considerando su importancia diagnóstica porque demuestran si el paciente ha estado en contacto reciente o pasado con Cht. Especialmente la exposición pasada al patógeno (IgG antiCht) se ha asociado con efectos negativos en el tracto genital masculino (24, 25).

De los 64 pacientes positivos para Ac-antiCht, 52 presentaron el isotipo IgA, lo que indicaría una respuesta inmunológica activa a nivel local, tal como lo han señalado otros autores en poblaciones de hombres infértiles (21, 22). Los Ac-anti Cht tipo IgA se han asociado con una respuesta inflamatoria del tracto genital masculino, pero no con los parámetros seminales (23, 24, 39), lo que se confirma con lo observado en este estudio. La evaluación seminal en este grupo reveló diferencias significativas en lo que se refiere a leucocitospermia y alteraciones de pH; ambos parámetros se asocian a presencia de infecciones en el tracto genital masculino y a una activación de la respuesta inmunológica (36). Por otra parte los grupos de pacientes positivo para Ac-anti Cht y para Mycoplasmas demostraron tener valores significativamente más bajos en los marcadores químicos de las glándulas accesorias correspondientes a fructosa y a-glucosidasa, lo que indicaría alteraciones sobre las secreciones provenientes de vesículas seminales y el epidídimo. El daño tisular causado por infección o por inflamación puede alterar la función secretora de las glándulas accesorias que a su vez repercutirían en la fisiología espermática (39, 40).

La incidencia de M. hominis y U urealyticum alcanzaron un 8 y 6% respectivamente. Este grupo analizado en conjunto y en comparación con el grupo negativo para infección, demostró que no existían diferencias significativas en sus parámetros seminales, lo que coincide con los resultados obtenidos por Sweih en 2011 (41); sin embargo, al igual que en los pacientes positivos para Ac-anti Cht los valores de fructosa y a-glucosidasa fueron significativamente más bajos que en el grupo negativo para infección, los cuales se asocian con baja función glandular, en particular epidídimo y vesículas seminales. Si los parámetros seminales: volumen, concentración, morfología, movilidad resultan ser normales, existe el riesgo de que la infección pase desapercibida si no se miden los valores de marcadores de glándulas accesorias y no se procede de rutina al despistaje de infecciones en el tracto genital masculino, tal como re realizó en este estudio.

La secreción de las glándulas accesorias y probablemente la función espermática pueden verse afectadas por la presencia de M. hominis, U. urealyticum y la presencia Ac-anti Cht. 

El diagnóstico junto al antibiograma permitiría controlar la resistencia a los antibióticos. Adicionalmente, en muchos de estos casos los antimicrobianos han tenido limitada eficacia porque se trata de compartimientos anatómicos con barreras que pueden limitar su alcance como por ejemplo la hemato-prostática (42); las lesiones tisulares son mayores a medida que avanza el tiempo, por ejemplo las prostatitis responden más rápido al tratamiento que las prostato-vesiculitis y prostato-vesículo-epididimitis, es decir, se comprometen más glándulas a medida que avanza el tiempo (6). Además, algunos microorganismos tienden a encapsularse o se adhieren con más fuerza al glicocálix de la matríz extracelular de la glándula, o probablemente los cambios de pH local de vesículas seminales (alcalino) o próstata (ácido) (43-45) limitan la eficacia antimicrobiana. 

Se demostró que el 42,3% de las muestras seminales de pacientes infértiles eran positivas para diferentes patógenos en el tracto genital masculino. Este hallazgo justifica plenamente la necesidad de incluir en la evaluación del hombre infértil el despistaje de infecciones y la determinación de marcadores químicos de las glándulas sexuales accesorias masculinas para aplicar la terapia más adecuada y eficiente. 

En conclusión, los cambios seminales sugestivos de infección sugieren la necesidad de un protocolo de diagnóstico de espermograma, marcadores químicos de glándulas sexuales masculinas, con un cultivo microbiológico adecuado, donde se descarten M. hominis, U. urealyticum y anticuerpos anti-Chlamydia trachomatis como gérmenes frecuentes asociados a infertilidad. 

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