- Hibridación cromogénica in situ (CISH). Esta hibridación cromogénica es un método descrito para la detección de la amplificación de un gen, combinando características de la técnica de FISH e immunohistoquímica. La CISH, al igual que la FISH, permite cuantificar el número de copias de un gen e identificar translocaciones en los cromosomas. La diferencia radica en que la CISH usa reacciones convencionales con peroxidasa a partir de tejidos fijados en formol o embebidos en parafina (71).

- Hibridación genómica comparada. En los tumores sólidos, la obtención de metafases de calidad es a menudo complicada, por lo que se desarrolló una nueva técnica de citogenética molecular denominada hibridación genómica comparada o CGH en ingles. Esta técnica emplea ADN del tumor y no analiza metafases, obviando la necesidad de células en crecimiento, siendo una técnica de citogenética molecular derivada del FISH. Ella permite detectar cambios numéricos de secuencias de ADN en un tejido tumoral, como lo son pérdida, deleciones, ganancias y amplificaciones. Dicha técnica hibridiza el ADN tumoral y de un ADN control, ambos marcados con fluorocromos de distinto color sobre metafases normales. La CGH tiene particular interés en el análisis de cambios numéricos de secuencias de ADN tanto en tumores sólidos como en neoplasias hematológicas de índice proliferativo bajo, al no ser necesaria la obtención de metafases. Así mismo es de gran utilidad en aquellos casos que presentan cariotipos complejos con numerosos cromosomas marcadores dobles diminutos (DM) y regiones de tinción homogénea (HSR). Esta técnica nos permite detectar translocaciones, inversiones y otras alteraciones de tipo equilibrado que no comportan ganancia o pérdida de material genético (72, 73).

Con el mismo fundamento que la HGC recientemente ha surgido una técnica denominada array-CGH o matrix-CGH, que en lugar de hibridar sobre portaobjetos con metafases hibrida lo hace sobre matrices con oligos que puede cubrir todo el genoma (74). La CGH ha contribuido significativamente al conocimiento actual de las alteraciones genómicas en las neoplasias humanas proporcionando información para la identificación de nuevos genes implicados en estas enfermedades. Actualmente esta técnica se utiliza sobre todo para detectar alteraciones cromosómicas en tumores sólidos, con el inconveniente, siempre presente, de la obtención de metafases, que presenta muchas dificultades técnicas (75). En neoplasias hematológicas, la CGH está casi restringida a síndromes linfoproliferativos crónicos, ya que en éstos, el índice mitótico de las células tumorales es generalmente muy bajo (76).

C. Pruebas por Northern blot, Western blot, Southern blot

Northern blot. Es utilizado para analizar ARN, bien sea total o purificado, separándose de acuerdo con su tamaño en un gel de agarosa y se transfiere posteriormente a una membrana. Los ARNs se revelan con una sonda marcada con radioactividad o fluorescencia, la cual es una secuencia de ácido nucleico específica y complementaria para el ARN de interés. Esta técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes supresores tumorales en células cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales (77, 78).

Western blot o inmunoblot. Esta prueba se emplea para identificar proteínas específicas mediante técnicas inmunológicas, las cuales se separan por electroforesis en geles de poliacrilamida y se transfiere a una membrana. La membrana se expone a un anticuerpo que reconoce a la proteína, pudiéndose estudiar, de esta forma, la presencia de la proteína y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas (79, 80).

Southern blot. Esta técnica se basa en el empleo de enzimas de restricción que corta las hebras de ADN y generan una serie de fragmentos de distinta longitud, los cuales se separan mediante una electroforesis. El ADN se transfiere a una membrana, y se expone a sonda marcada que es complementaria de la secuencia de interés, el patrón de bandas formado indicará el número y el tamaño de los fragmentos complementario con la sonda. Si la población de células en estudio posee alteraciones o deleciones en la secuencia genómica, las enzimas de restricción cortan en otros sitios y se generan fragmentos de ADN de longitudes diferentes respecto a las células normales. La comparación de los bandeos de genoma de células normales y del tejido en estudio, se pone de manifiesto la presencia o ausencia de fragmentos anómalos, y así puede inferirse la existencia o no de alteraciones genéticas (81, 82).

TÉCNICAS BASADAS EN LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR

La técnica de reacción en cadena de la polimerasa o PCR en inglés fue creada en 1983 por Kary Mullis, la cual implica una reacción de amplificación durante el ensayo. El término “reacción en cadena” se refiere a los varios ciclos de copiado de un fragmento específico de ADN a partir de un ácido nucleico diana. La región amplificada se caracteriza por dos o más oligonucleótidos cortos y dos cebadores que son complementarios con las regiones de ADN que flanquean la secuencia diana. Utilizando una ADN polimerasa termoestable, que no resulte desnaturalizada durante el ciclo de calentamiento, es posible copiar la secuencia de ADN entre los dos cebadores. Repitiendo de 20 a 40 veces el régimen de ciclos de calentamiento, se obtendrá una cantidad de ADN diana copiado que será suficiente para operaciones ulteriores, tales como la detección, el clonado y la secuenciación. La sensibilidad de diagnóstico de la PCR es muy alta, ya que se producen varios millones de copias de la diana seleccionada, pudiendo ser también muy alta la especificidad de la reacción debida a las secuencias nucleotídicas específicas formadas por los oligonucleótidos (cebadores). Los cebadores están diseñados para detectar secuencias nucleotídicas específicas en los genomas de las dianas seleccionadas (83).

1. Amplificación del ADN. Si el genoma es ADN, se realiza la ampliación de forma directa, con o sin purificación previa del ADN diana (84).

2. Amplificación del ARN. Esta técnica acopla la transcripción reversa de ARN y PCR, consistente en la amplificación de pequeñas moléculas de ARN, tanto total como mensajeros, en forma de cadenas complementarias de ADNc mediante una enzima llamada transcriptasa inversa o reversa. Esta enzima tomando como base o modelo una cadena de ARN es capaz de colocar las bases nucleótidas complementarias para crear una hebra de ADN. Posteriormente, la nueva cadena de ADN creada se amplifica mediante el método de PCR.

Es una técnica rápida que puede realizarse con una pequeña cantidad de muestra, pero es cualitativa indicando presencia o ausencia de la secuencia específica del ADN, lo cual es una limitación a la hora de monitorizar la enfermedad mínima residual. La sensibilidad es de 10⁶-10⁷ y su elevada sensibilidad puede ser causas de falsos positivos, hecho que puede minimizarse mediante la técnica RT-PCR cuantitativa (85, 86).

A continuación se ofrecen algunos ejemplos de técnicas PCR utilizadas en la actualidad.

- El PCR a tiempo real o PCR cuantitativa. En esta prueba los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea y además, mediante la detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento. Ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado, ello permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación. Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo real incorporan un lector de fluorescencia para medir la fluorescencia emitida por la amplificación, y los datos son analizados mediante un software informático (87). La utilidad de la PCR a tiempo real se caracteriza por: la rapidez; el mayor número de ensayos; la utilización de sistemas cerrados por lo que el riesgo de contaminación disminuye; ello permite cuantificar la concentración inicial del ácido nucleico presente en la muestra de manera sencilla y precisa que por los procedimientos convencionales, y adicionalmente permite la determinación de mutaciones puntuales. Hoy por hoy esta técnica es el estándar en la cuantificación de la expresión genética (88, 89).

- Prueba de PCR anidada. Es una técnica muy sensible en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando se tiene el primer amplicón se pueden unir los cebadores, y se hace de nuevo una amplificación dentro del amplicón inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad mas gran especificidad, la cual aumenta porque como es amplificación de un amplicón obtenido previamente, los cebadores sólo van a hibridar en un sitio dentro de la molécula y el resultado será una única banda. Así se evitan posibles hibridaciones inespecíficas de los cebadores. La desventaja de ésta técnica es que no nos permite cuantificar la muestra (90, 91).

- Prueba de PCR múltiple o “PCR multiplex”. Es un tipo de PCR en el cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción, en este tipo de PCR se utilizan múltiples pares de primers, hasta 8, lo que da una serie de productos. Los amplificados pueden verse como múltiples bandas en un gel. Esta técnica ofrece la ventaja dar información sobre varios locus en una sola reacción (92, 93).

Para el estudio de la enfermedad mínima residual se pueden utilizar, como marcadores moleculares, dianas localizadas tanto en el ADN como en el ARN.

I. Marcadores para el ADN

1. Anomalías cromosómicas. translocaciones, delecciones, aneuploidías (94).

2. Hipermetilación de CpG. Un mecanismo de regulación de la transcripción, y por tanto de la expresión génica, es el control de la metilación de los genes. La adición de grupos metilo (CH₃) a las bases del ADN en las regiones reguladoras (promotores) ocasiona generalmente inhibición de la transcripción génica. En tumores se ha visto que la metilación causa frecuentemente la inhibición de la expresión del gen. Los factores que conducen a la metilación de las islas CpG son desconocidos, aunque obviamente puede estar implicada la expresión inadecuada o la actividad de enzimas metilantes del ADN (ADN-metiltransferasas) (95).

3. Mutaciones puntuales en determinados genes. Cerca del 50% de todos los carcinomas contienen alguna mutación del gen supresor tumoral p53, por lo que y como consecuencia de la pérdida de funciones críticas, se producirían re-arreglos cromosómicos y daños genómicos irreparables. La presencia de formas aberrantes de la proteína p53 se correlaciona con parámetros de índole clínico, como serían: mayor agresividad, desarrollo de metástasis y menor supervivencia de los pacientes (96).

4. Pérdida de heterocigosidad. Normalmente las células poseen dos copias de cada uno de los genes, por lo que, la eventual pérdida de las funciones de un gen supresor, por ende de su producto proteico, determinará un crecimiento celular exagerado y fuera de control, que es característico del cáncer. Por lo general, las delecciones involucran la pérdida de uno de los alelos, fenómeno conocido como pérdida de heterocigosidad (97).

5. Inestabilidad de microsatélites. La inestabilidad de microsatelites en células de cáncer humano se asocia a alteraciones en ciertos genes, los cuales son homólogos a los que en los microorganismos codifican para las proteínas que reparan los errores ocurridos durante la replicación del ADN al formarse pares de bases erróneos. Son los genes de reparación de errores de replicación o genes MMR, siglas en ingles de MisMatch Repair genes. La inestabilidad de los microsatélites sirve como un indicador de híper-mutación génica (98).

II. Marcadores para el ARN

1. Transcritos con un patrón de expresión específico. Es ejemplo el ARN mensajero (ARNm) del gen mamaglobina para la detección de células tumorales circulantes en el cáncer de mama (99).

2. Fusión de transcritos. En la leucemia se utiliza como marcador el MLL/AF4. Esta fusión de genes se debe a una translocación entre el cromosoma 4 y 11(100).

La PCR presenta algunas limitaciones

En referencia a su gran sensibilidad, la contaminación y amplificación de fragmentos de ADN extraño puede originar resultados falsos positivos, además puede existir una mayor facilidad de contaminación cuando se utiliza el ARN. La pérdida de sensibilidad también puede ocurrir cuando se utilizan marcadores moleculares de reordenamientos de los genes de las inmunoglobulinas, ya que pueden emergen subclones que predominan sobre el clon original. También, adicionalmente, la alteración de la secuencia del clon IgH debido a mutaciones que impedirían una correcta hibridación, lo cual podría provocar una recurrencia de la enfermedad al no poder ser detectado con las mismas sondas utilizadas para detectar el clon inicial (101, 102).

MICROARRAYS Y PERFIL DE EXPRESIÓN

El desarrollo tecnológico, junto con el avance de la informática, ha permitido la creación de plataformas que realizan el análisis simultáneo de hasta 40.000 genes de una misma muestra de tejido. Esta tecnología recibe el nombre de microarrays, conocidos tambien como biochips, genochips o genosensores, la cual se puede aplicar al estudio de los niveles de expresión de genes analizando el ARNm de un tejido (103). Sus aplicaciones en estudios sobre la biología del cáncer son de largo alcance, al ser ésta una enfermedad del genoma a nivel celular, ya que los cambios en la expresión de los genes que están implicados en la carcinogénesis pueden ser identificados, a lo cual se suma que diferentes señales de expresión genética pueden ser identificadas para tipos específicos de cáncer. Las señales moleculares pueden permitir la predicción tanto de la evolución de la enfermedad como de la prescripción de tratamientos más eficientes para un determinado tipo de tumor. Una visión de futuro es desarrollar terapias hechas a medida para cada paciente en función del perfil genético de su tumor primario (104, 105).

La técnica que describimos se fundamenta en preparar placas de silicio o vidrio a cuya superficie se han adherido, según una secuencia conocida y ordenada, diversas moléculas de cADN o bien oligonucleótidos de secuencias diferentes, específicas para un determinado gen o una región de ADN de interés. La tecnología empleada permite unir, en cada biochip, entre decenas y cientos de moléculas diferentes, por lo que se puede hacer, de forma simultánea a partir de una muestra muy pequeña, un número elevado de ensayos. Esencialmente se trata de un ensayo de hibridación en el que papel de sonda lo desempeñan las moléculas unidas al biochip, marcando el ADN o ARN de la muestra, la cual, desnaturalizada, se vierte sobre el biochip para que se hibride con las secuencia de éste. Al lavar se detecta en que posiciones aparece el marcaje (106, 107).

Existen varios tipos de microarrays de ácidos nucleicos:

1. Microarrays de cDNA. Las sondas son producidas en laboratorios mediante la amplificación selectiva de cDNAs, 100-3000 nucleótidos por PCR (108).

2. Microarrays de oligonucleótidos. Las sondas son porciones de DNA sintético de cadena simple que pueden ser cortas (15-25 nucleótidos) o largas (50-120 nucleótidos). Estos fragmentos pueden ser pre-sintetizados y depositados en portaobjetos por robots o sintetizados in situ y depositados por ink jet o fotolitografía (DNAchips). Los arrays de cDNA son los más flexibles y usados en investigación porque permiten depositar genes o fragmentos de genes amplificados de cualquier especie, y así diseñar y generar de manera sencilla y menos costosa el grupo de sondas (109).

3. Microarrays de proteínas. Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio, y los blancos son muestras de suero o tejido (110).

4. Microarrays de tejidos (TMA). Llamada también micro-matriz tisular, proporciona un nuevo método de alto rendimiento para estudiar el perfil molecular, expresión de ARNm o el análisis de alteraciones cromosómicas mediante hibridación in situ a partir de tejidos que se encuentran incluidos en bloques de parafina (111).

En conclusión, como hemos visto, la enfermedad mínima residual se caracteriza por la presencia de una pequeña cantidad de células tumorales residuales tras un tratamiento con intención curativa aplicadas a un paciente con cáncer. El objetivo fundamental de esta revisión ha sido dar a conocer las técnicas que se utilizan actualmente en este campo. Por ello se ha dado una visión general y ordenada del problema con el fin informar y ayudar a optimizar las estrategias tendientes a lograr los mejores resultados de tratamiento tanto para los pacientes portadores de esta enfermedad, bien sea localmente avanzada al momento del diagnóstico como con alto riesgo de recurrencia. Para alcanzar tal propósito ello exige conocer las técnicas existentes hasta la fecha, así como los marcadores pronósticos específicos para cada tipo de cáncer, ya que la utilización de los mismos requiere la aplicación adecuada de las técnicas más corrientes, las optimizadas y las más novedosas, muchas de ellas altamente sensibles y específicas.

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