Efecto de la hiperviscosidad seminal sobre la integridad acrosómica y la movilidad espermática antes y después de la criopreservación.

Effect of seminal hyperviscosity on acrosomal integrity and sperm motility before and after cryopreservation.

 

Ricardo Lozano-Hernández ^1,2, Javier Gualdrón ², Daniel Nava² y Mary Alejandra Rojas Lozano ².

¹ Cátedra de Fisiopatología de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela. Correo electrónico: ricardolozanoh@hotmail.com.

² Centro Diagnóstico de Infertilidad y Enfermedades Ginecológicas “Dr. Giovanny Vivas Acevedo” (CEDIEG). Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela.

Resumen.

La criopreservación del semen es una herramienta útil en la reproducción asistida, la cual puede tener impacto en las características espermáticas durante el congela miento y el descongelamiento. El objetivo de este estudio fue valorar la integridad del acroso ma y la movilidad de los espermatozoides criopreservados y descongelados provenientes de muestras hiperviscosas y no viscosas. Se realizó el espermograma, la integridad del acrosoma, el espermocultivo y los niveles de los marcadores de glándulas accesorias en 60 muestras de semen. Cada alícuota de semen fue inmersa en un crioprotector comercial para congelar a -196°C. Transcurridos 30 días, éstas fueron descongeladas y en el sedimento celular espermá ticesuspendido se evaluó la movilidad y la integridad acrosómica, disminuyendo significa tivamente la movilidad progresiva (p<0,05), la vitalidad espermática (p<0,005) y la integridad acrosómica (p<0,05); dicho descenso fue más evidente en las muestras hiperviscosas. La viscosidad del semen fresco se relacionó inversamente con la movilidad y la integridad del acrosoma antes y después del congelamiento (p<0,05). En veinte muestras de semen se iden tificó la presencia de microorganismos y de anticuerpos IgA anti C. trachomatis , de las cuales quince muestras en la reproducción hiperviscosas. El aumento de la viscosidad seminal y los niveles de ácido cítrico están asociados con disfunción prostática, baja movilidad espermática y reacción prematura del acrosoma, lo que puede reducir la capacidad fecundante de un esper matozoide. La etiología de la hiperviscosidad sigue siendo compleja; sin embargo, para pre servar la movilidad y la integridad del acrosoma, previamente deben investigarse sus causas en las muestras seminales que van a ser sometidas a la criopreservación.

Palabras clave: criopreservación; integridad acrosómica; espermograma; glándulas accesorias; viscosidad seminal.

Abstract.

Semen cryopreservation is a useful tool in assisted reproduction, which may have impact on sperm characteristics during freezing and thawing. The aim of this study was to assess the integrity of the acrosome and motility of cryopreserved and thawed spermatozoos in hyperviscous and no viscous samples. In semen samples spermiogram, glandular markers, acrosome integrity, culture and the levels markers accessory glands were measured. Each ali quot of semen was immersed in cryoprotectant and maintained in a commercial freezer at -196 ° C. After 30 days, these were thawed and in the cell pellet resuspended, spermatic motility and acrosomal integrity were evaluated. In thawed samples, there were significant decreases in progressive motility (p <0.05), vitality (p <0.005) and acrosome integrity (p <0.05) with respect to fresh sperm, this decline was most evident in hyperviscous samples. The viscosity of fresh semen was inversely related to motility and acrosome integrity before and after freezing (p <0.05). Twenty semen samples showed the presence of microorganisms and C. trachomatis IgA antibodies, of which fifteen showed hyperviscosity. Biochemical analysis demonstrated that semen samples with low levels of citric acid had less acrosomal integrity both before and after freezing (p <0.05). The viscoelasticity and citric acid levels are associated with prostate dys function, low sperm motility and premature acrosome reaction, which can reduce the fertilizing capacity of sperm. The etiology of hyperviscosity remains complex; however, to preserve mo tility and acrosome integrity, its causes must be investigated previously in the seminal samples to be subjected to cryopreservation.

Key words: cryopreservation; acrosome integrity; spermiogram; male accessory glands; semen hyperviscosity.

Recibido: 11-10-2015 . Aceptado: 02-06-2016

INTRODUCCIÓN

Los estudios de la reproducción humana han aumentado notablemente con las técnicas de reproducción asistida como la inseminación intrauterina, fertilización in vitro , inyección in tracitoplasmática del espermatozoide y criopre servación de muestras seminales, entre otras (1).

La criopreservación de espermatozoides se lleva a cabo mediante congelamiento de las muestras seminales con el empleo de nitróge no líquido hasta alcanzar una temperatura ex trema de -149°C tratando de mantener después del congelamiento su integridad fisiológica (2), en especial la movilidad espermática (3). Para preservar la integridad celular ante un cambio tan brusco de temperatura se requiere del uso de crioprotectores adecuados para minimizar la pérdida de agua dentro del espermatozoide y la formación de cristales intracelulares que daña rían las estructuras de la célula (4). Cualquier muestra destinada para criopreservación, debe someterse a pruebas y controles de calidad seminal, entre ellas están la prueba de movilidad espermática, concentración espermá tica e integridad de estructuras fundamentales del espermatozoide como la cromatina, la membrana plasmática y el acrosoma (5), pero muy pocos estudios toman en cuenta el efecto de la hiperviscosidad seminal en la criopreservación.

La hiperviscosidad del semen (HVS) se ha asociado con reducción de la movilidad esper mática que impide la progresión normal de los espermatozoides a través del tracto genital fe menino. (6).

Del mismo modo, la HVS conduce a difi cultades técnicas en el manejo de las muestras; por ejemplo, cuando se capacita la muestra de semen en la fertilización in vitro (FIV) (7). Un estudio demostró que las muestras seminales hi perviscosas tenían niveles de fructosa reducidos y se asociaban con disfunción de las vesículas seminales (8). La HSV se ha asociado con cambios en la secreción de proteínas del epidídimo, vesículas y de próstata, que generan aumento en la filancia, la cual se incrementa a medida que se extiende la inflamación en las glándulas accesorias (prostatitis <prostato-vesiculitis <pros tato-vesículo-epididimitis) (9). En un estudio se evidenció que la presencia de algunos microor ganismos en semen se asociaba con disfunción de las glándulas accesorias masculinas y des censo en sus marcadores bioquímicos glandula res. La medida de los marcadores fructosa, ácido cítrico y alfa- glucosidasa neutra de manera oportuna junto al diagnóstico microbiológico, permiten orientar más acerca de la propagación de la infección y la selección de la terapia más eficaz (10).

Uno de los aspectos más importantes del espermograma es la movilidad espermática, la cual depende del movimiento flagelar del esper matozoide y se ha correlacionado directamente con la fertilidad, lo que le permite avanzar pro gresivamente a través del cuello uterino y am polla del oviducto para penetrar en el ovocito y fecundarlo (11). La movilidad espermática se ha encontradeducida en muestras con elevada viscosidad con reducción en los niveles de mar cadores bioquímicos glandulares (12,13).

Por otra parte, la integridad del acrosoma espermático está asociada con la capacidad fe cundante del mismo, y es indispensable para la reacción acrosómica que permite el ingreso del material genético del espermatozoide al interior del óvulo (14,15). Pocos estudios se han enfo cado en el proceso de reacción del acrosoma del espermatozoide humano y su relación con las infecciones. Se ha reportado que las infeccio nes por C. trachomatis alteran la capacitación espermática y la reacción del acrosoma (16). También se ha demostrado que la presencia de microorganismos patógenos inducen la reacción prematura del acrosoma a través de un mecanis mo dependiente de calcio (17).

Otros hallazgos afirman el hecho de que la criopreservación de los espermatozoides hu manos disminuye la movilidad, la vitalidad y la integridad del acrosoma, entre otros (18). En virtud de lo expuesto se establecieron como objetivos comparar la integridad acrosómica y movilidad espermática antes y después de la criopreservación, así como comparar la integridad del acrosoma, la movilidad, los marcadores bioquímicos de glándulas accesorias y la pre sencia de microorganismos en muestras semi nales con y sin hiperviscosidad.

PACIENTES Y MÉTODOS

Se realizó un estudio de tipo trasversal en 60 individuos subfértiles que acudieron al Cen tro de Infertilidad referidos de la consulta de infertilidad y de urología para la evaluación seminal. Las características seminales se evaluaron de acuerdo al 5° Manual de la Organi zación Mundial de la Salud (OMS) (19). Los pacientes firmaron el consentimiento siguiendo los lineamientos establecidos en la Declaración de Helsinski para investigación en humanos reseñados en el código de Bioética y Bioseguridad del FONACIT (20). Como criterios de exclusión se consideraron muestras con oligozoospe mia severa, azoospermia, hemospermia, crip tozoospemia, hipospermia, necrozoospermia y astenozoospermia severa.

Antes del congelamiento cada muestra fue evaluada de la siguiente manera:

Espermograma: A) análisis macroscópico (licuefacción, aspecto, volumen y pH) (19). La viscosidad se evaluó semicuantitativamente una hora después de la eyaculación mediante el as pirado suave del semen en una pipeta Pasteur, midiéndose la filancia del semen al gotear, asig nando el valor de 0 cuando era nula o menor a 2 cm; 1: leve (longitud de hilo> 2 cm y ≤ 4 cm), 2 moderada (> 4 cm y ≤ 6 cm) y 3 severa (> 6 cm) (21). B) Análisis microscópico (movilidad, concentración y vitalidad espermática) (19). Evaluación microbiológica del semen libre de plasma seminal para el des carte de cocos y bacilos aeróbicos y microaerófilos facultativos: A). siembra en placas de agar para el descarte de Entero bacterias, Neisseria gonorroheae , Streptococcus sp y Staphylococcus sp. B) Cultivos en pozos de Mycoplasmas M. hominis y U. urealyticum : El semen fue diluido 1:10 en solución salina fi siológica estéril y sembrado en pozos con me dio enriquecido A7 (Mycoplasma System Plus, Diagnostici Liofilchem).

Determinación de anticuerpos (Acs) anti Chlamydia: anticuerpos locales IgA con un estuche comercial (Sero ELISA; Sav yon, Beer-Sheva, Israel) (22).

Análisis bioquímico de marcadores glandulares: fructosa, fructosa corregida verdadera, 1,4 α-glucosidasa neutra y ácido cítrico (23).

Integridad acrosómica: se determinó usando el colorante comercial Sperm stain™-Fertipro nv, en un fino frotis con semen sin diluir, considerándose positivos aquellos que mantenían el acrosoma intacto y negativos aquellos que no presentaban membrana acrosomal externa porque habían tenideacción prematura del acrosoma (Fig. 1). El recuento celular se llevó a cabo, por duplicado, en 200 células en cada paciente (24).

Para la congelación del semen se utilizó un crioprotector comercial Quinn ́s Advantage® Sperm Freeze, siguiendo las instrucciones del fabricante (25). La descongelación de los viales se realizó a los 30 días, en un baño de María a una temperatura de 30 a 35 °C. Se mezcló 1:1 semen descongelado con buffer PBS pH 7,2; las mezclas se centrifugaron a 800 rpm. duran te 7 minutos, y del sobrenadante se extrajo el crioprotector quedando el sedimento en el fon do, el cual fue resuspendido hasta 1 mL con el buffer. Se les realizó el análisis microscópico (concentración, movilidad y recuperación de es permatozoides móviles: REM) (26) y se realizó un frotis de la suspensión de espermatozoides fijar, colorear y cuantificar la integridad acrosómica.

Estadística

Se utilizó el sistema estadístico IBM SPSS Stadistics 21 con una significancia estadística de 0,05; se realizó análisis de varianza ANOVA, t de Student y coeficiente de Pearson para relacionar diversas variables aleatorias cuantitativas.

RESULTADOS

Después del proceso congelamiento-des congelamiento de las muestras sometidas a criopreservación se observó una disminución significativa de la movilidad espermática en las siguientes categorías: Progresivos PR: (54,4 ± 15,4 a 28,9 ±14,9; p ≤ 0,05); No-progresivos NP: (7,1 ± 3,9 a 5,2 ±3,1; p ≤ 0,05); Vitalidad: (73,6 ± 11,1 a 46,8 ±11,1; p ≤ 0,05), e Integridad del acrosoma: (57,4,6 ± 17,5 a 47,6 ±15,9; p ≤ 0,005). Estos resultados reflejaron, simultáneamente, un aumento de los espermatozoides inmóviles (IM). (Fig. 2).

Con respecto a la frecuencia de la HVS de las 60 muestras analizadas, 22 de estas (36,6%) mostraron hiperviscosidad HVS(+), mientras que 38 muestras (63,4%) tenían viscosidad nula HVS(-). En 22 muestras con HVS(+) se iden tificaron microorganismos en 15 casos, siendo C. trachomatis y U. urealyticum los gérmenes más frecuentes; en las 38 con HVS(-) se iden tificaron microorganismos en 5 casos, siendo más frecuente la presencia de Staphylococcus sp (Tabla I).

En la Fig. 3 se muestran los valores prome dio de movilidad (progresiva y no progresiva) y la vitalidad en los grupos HVS(+) y HVS(-) entre los cuales no se observaron diferencias; no obstante, al evaluarse la integridad del acro soma (Spermac stain) se encontró que en las muestras HVS(+) fue más baja que en las mues tras HVS(-) (p≤0,005).

 

Al analizar la concentración espermática/ mL y la concentración de espermatozoides pro gresivos/mL, no se encontraron diferencias entre los grupos HVS(+) y HVS(-). Al congelarse y descongelarse las muestras de semen, en el se dimento libre de criopreservante se determinó la recuperación de espermatozoides móviles, siendo significativamente menor en las muestras HVS(+) con respecto a las HVS(-) (p≤0,005).

Al comparar los marcadores bioquímicos glandulares en los grupos con y sin hipervis cosidad, no se observaron diferencias entre los grupos con respecto a los marcadores de vesí culas seminales (fructosa y FCV) ni en las de epidídimo El ácido cítrico (marcador de prósta ta) fue el único marcador glandular que se en contró significativamente inferior en las mues tras con HVS (p≤0,002) (Tabla II).

Se midieron en los grupos HSV(+) y HSV (-) el número de espermatozoides/mL (118,0 ± 64,8 vs. 108,1± 60,1), la concentración de cé lulas redondas/mL (2,90 ± 2,8 vs. 2,2± 1,4) y la concentración de leucocitos/mL (1,33±1,30 vs. 0,96 ±0,72) sin encontrarse diferencias esta dísticamente significativas entre ambos. Se ob servó aumento de los leucocitos en las muestras HVS(+), pero el valor de sus desviaciones es tándares redujeron su diferencia estadística; sin embargo, al asociarse por separado la integridad del acrosoma con los parámetros del espermo grama (concentración/mL, células redondas/mL y leucocitos/mL), se encontró que la integridad del acrosoma guardaba relación directa con la

concentración de espermatozoides/mL, mien tras que la viscosidad mantenía una relación inversa con los acrosomas, íntegros tanto antes como después del congelamiento (Tabla III).

 

En cuanto a los marcadores de las glándulas accesorias y su relación con la integridad acro sómica, se encontró que el marcador bioquími co de vesículas seminales, fructosa, no guardó relación con la integridad del acrosoma en se men recién eyaculado ni después de ser descon gelado; los niveles de ácido cítrico (marcador de próstata) si mostraron relación significativa con la integridad del acrosoma en espermatozoides frescos y descongelados. Con respecto a la acti vidad de la α-glucosidasa neutra, ésta no guardó relación con la integridad acrosómica antes ni después del proceso de criopreservación (Tabla IV).

DISCUSIÓN

En este estudio se evaluaron las características seminales que reducen la recuperación espermática en los procesos de congelamiento y descongelamiento seminal. Al descongelarse las muestras de semen se observó reducción significativa del porcentaje de espermatozoides progresivos (PR), no-progresivos (NP) y via bles en todas las muestras; dichos resultados concuerdan con otros estudios que reportan el impacto de la baja temperatura sobre la calidad del semen humano (18). Cabe destacar que la membrana mitocondrial involucrada en el siste ma motriz del flagelo espermático se ve afecta da por la refrigeración (27,28). La bacteriospermia tanto por microorganis mos saprofíticos como patógenos es más fre cuente en las muestras hiperviscosas.

Aunque el screening infeccioso ha sido ampliamente sugerido en los bancos de semen para el des carte de los microorganismos más comunes de infecciones de transmisión sexual, tales como: Treponema pallidum y los virus de inmunode ficiencia humana y hepatitis (B y C), la detección de otros patógenos bacterianos en semen es subestimada, pudiendo estar presentes otros microorganismos saprofíticos y patógenos en los procesos de criopreservación seminal (29), especialmente en las muestras hiperviscosas, las cuales pueden estar infectadas por bacterias patógenas. Se ha demostrado que la viscosidad seminal a menudo se asocia con infección prostática por Chlamydia trachomatis la cual reduce la movilidad espermática aunque no se alteran los demás parámetros del espermograma; tales cambios logran ser revertidos si son tratados adecuadamente con antibióticos (30).

El manejo terapéutico de la HVS con el uso de antibió ticos ha mostradesultados favorable en el la mayoría de los casos al erradicar la infección. Por lo general la HVS asociada a prostatitis cró nica puede revertirse, aumentando además la movilidad espermática y descendiendo la con centración de leucocitos y de citocinas proin flamatorias. Cerca de un tercio de los casos de HVS que nesponden al tratamiento pueden tener concentraciones bacterianas muy elevadas o con compromiso de otras glándulas que no mejoran la movilidad espermática con la anti bióticoterapia (21,31).

El congelamiento y descongelamiento pue de activar el proceso de reacción acrosómica, lo que ayuda a explicar uno de los mecanismos que disminuyen la capacidad fecundante del es permatozoide por reacción prematura, tal como como ha sido descrito en otros estudios (32,33). Esto podría ser explicado por una desestabilización a nivel de la membrana, producto del con gelamiento, que afecta la composición lipídica de la bicapa, lo cual causaría que el calcio se en cuentre más permeable y, por tanto, entraría al espermatozoide iniciando la capacitación y, en consecuencia, la reacción acrosómica (18,34). El aumento de la reacción acrosómica es sinó nimo de baja tasa de fertilidad, ya sea pre o post descongelado. Dado que el acrosoma contiene las enzimas necesarias para que el espermato zoide pueda penetrar y fertilizar el ovocito, a menor daño acrosomal durante la criopreservación, mayor seria la tasa de fertilidad resultante (35).

Se ha demostrado que la presencia de ciertos gérmenes en semen pueden alterar los marcadores glandulares. La evaluación microbiológica y bioquímica del semen podría orientar más acer ca de la propagación de la infección y permitir la selección de la terapia más eficaz (10). En el presente estudio se encontró una relación di recta entre concentraciones normales de citrato e integridad acrosómica post descongelamiento. El ácido cítrico es un marcador prostático, el cual es regulado por la testosterona y su descen so puede asociarse con infección (36,37).

Los resultados obtenidos indican una relación directa entre la concentración de ácido cítrico en el plasma seminal y la integridad acrosómica en las muestras descongeladas, esto se debe a que en el momento de la criopreservación los espermatozoides se vuelven más per meables al calcio iónico, el cual es el principal inductor de la reacción acrosómica (15,33); si la muestra posee niveles elevado de ácido cítrico, aumenta la captura del calcio iónico y disminu ye la inducción de la reacción acrosómica. El ácido cítrico es uno de los aniones más impor tantes; tiene alta afinidad por el calcio iónico, el magnesio y el zinc de allí su descenso tendría menor efecto contrarregulador en la reacción acrosómica prematura (38,39).

Se ha demostrado un aumento de citocinas proinflamatorias IL-6, TNF-α, IL-10 y EROS en muestras hiperviscosas, sobre todo cuando se inflama más de una glándula como es el caso de la prostato-vesiculitis; así, cuando la inflamación se extiende hacia las vesículas seminales aumenta la viscosidad y la producción de EROS (40). Tambien se ha demostrado que la hiper viscosidad es una causa de infertilidad de tipo post testicular que afecta la movilidad y proba blemente la reacción del acrosoma, aunque no se ha demostrado su relación con cromatina es permática (41).

Se encontró que la movilidad era más baja en las muestras hiperviscosas, estos resultados fueron similares a los encontrados por Layali y col. (42) quienes encontraron, además de la mo vilidad, un descenso significativo en las formas normales y de la concentración espermática con un aumento de la peroxidación lipídica.

A menudo, se ha observado HVS en el se men hombres subfértiles, en los que su movilidad es reducida por un “efecto de captura”; por otra parte, se ha relacionado la HVS seminal con infecciones del tracto genital masculino, mayor mente entre HVS por Ureaplasma urealyticum ; así como también se ha encontradelación con inflamaciones del tracto genital masculino. A pe sar de estas relaciones se ha llegado a la conclusión de que la HVS no se debe solo a un factor etiopatógenico, sino más bien a varios factores (bioquímicos, microbiológicos, obstructivos, enzimáticos y genéticos) que actúan en siner gia para aumentarla (21); conociendo esto es de esperarse que una muestra con HVS, conjunta mente con baja calidad seminal, sea un factor predisponente para que la muestras tengan un bajo porcentaje de integridad acrosómica.

En este estudio se demuestra una relación inversa entre la viscosidad seminal e integridad acrosómica y movilidad en las muestras pre congeladas; es decir, a mayor viscosidad menor integridad acrosómica y menor cantidad de espermatozoides progresivos, por lo tanto se puede considerar el efecto deletéreo de la vis cosidad seminal sobre la calidad del semen, la fisiología espermática y posiblemente sobre su capacidad fecundante; de manera que las mues tras con viscosidad elevada cualquiera sea su causa deben considerarse inapropiadas para la criopreservación y las demás técnicas de repro ducción asistida.

AGRADECIMIENTOS

Nuestro agradecimiento a la Dra. Judith Velasco por los análisis microbiológicos, a la Licenciada Carmen Lozano por su aporte en la detección de Anticuerpos anti Chlamydia trachomatis , al Asistente Héctor Picón por su tra bajo Técnico y a la secretaria Marilú Albarrán por el manejo de la información.

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