1. Servicio de Neurocirugía, Instituto Venezolano de los Seguros Sociales, Hospital "Miguel Pérez Carreño".
2. Laboratorio de Neuroquímica, Centro de Biofísica y Bioquímica, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas.

Los cultivos de gliomas malignos se han realizado con el objeto de conocer su biología, estudiar nuevas drogas antineoplásicas y determinar la sensibilidad diferencial a citostáticos. Catorce pacientes con diagnósticos clínico y radiológico sugestivos de tumor cerebral maligno fueron seleccionados de acuerdo a criterios específicos, lo que incluyó la evaluación según el esquema de Karnofsky, el cual determina el estado funcional independiente del paciente. Se realizó la resección quirúrgica, se efectuó el estudio histopatológico y se tomó una muestra del tumor para cultivo en monocapas. La confluencia celular se alcanzó entre 15 y 45 días y los cultivos fueron expuestos a los citostáticos (1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosouréa, cisplatino o vincristina por una hora. Se determinó la integridad de la membrana mediante la exclusión del colorante azul de Tripán. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las drogas utilizadas y entre los tumores, incluso con el mismo diagnóstico histopatológico, lo cual indica la existencia de resistencia diferencial de las células tumorales a los citostáticos utilizados. Este estudio constituye un ensayo que sustenta la realización de evaluaciones a largo plazo con el fin de emplear una quimioterapia específica en pacientes en los que probablemente se combine ésta con la radioterapia.

Palabras Clave: Cultivo de tumores, Sensibilidad a citostáticos, Tumores cerebrales.

Malignant glioma cell cultures have been done for studying the biology of the tumors, the efficiency of antineoplasic drugs, and for determining the differential sensitivity to cytostatics. Fourteen patients with clinical and radiological diagnostics of malignant brain tumor were selected according to specific criteria, including the evaluation by Karnofsky scale, which determines the functional independence of the patient. After surgical resection of tumors, histopathological study was done and a sample was taken for monolayer cultures. Confluence was reached 15 to 45 days after plating and the cultures were exposed to (1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, cisplatin or vincristine for one hour. Integrity of cell membranes was evaluated by the exclusion of Tripan blue. There were statistical significant differences between drugs and between the tumors, including those with the same histophatological diagnostic, indicating a differential resistance of the tumoral cells to the cytostatics used. The results of this study support the viability for further evaluations in order to suggest specific antineoplasic treatments probably in combination with radiotherapy for patients having malignant brain tumors.

Key Words: Brain tumors, Sensitivity to cytostatics, Tumor cultures.

Los gliomas malignos constituyen un porcentaje elevado de los tumores primarios del cerebro. Estos tumores están compuestos por poblaciones malignas y variadas de células, entre ellas células no malignas^(1,2). La interacción con el portador y entre las células del tumor no puede ser completamente reproducida en estudios en cultivo⁽³⁾. Sin embargo, se han utilizado tres técnicas principales para el estudio de gliomas in vitro: cultivo de órganos, que consiste en la implantación de fragmentos del tumor en una matriz inerte^(4,5); cultivos tridimensionales en forma de esferoides^(6,7); y cultivos en monocapas que han sido usados en varios estudios^(8,9).

La resistencia a la administración de la quimioterapia es uno de los mayores problemas en el tratamiento de los gliomas⁽¹⁰⁾. Con el objeto de determinar la resistencia diferencial a las drogas se han diseñado técnicas de ensayos in vitro para evaluar la sensibilidad específica cuantitativa de células en cultivo. Estas determinaciones han sido sugeridas como indicadoras de la respuesta in vivo y posiblemente como una directriz en la escogencia de la quimioterapia selectiva^(3,11). Existen estudios que señalan que este tipo de tumores responde a la radioterapia más que a la quimioterapia⁽¹²⁾, sin embargo, se plantea una terapia combinada con radio y quimioterapia. De manera que sería deseable contar con una orientación en relación a la sensibilidad específica de un tumor particular a ciertas drogas.

Además del tratamiento con radioterapia y con quimioterapia, enfoques inmunológicos también han sido propuestos para el tratamiento de estos tumores^(13,15), incluso, una de las aproximaciones terapéuticas más recientes consiste en el uso de inhibidores de la cinasa proteica C, la cual se encuentra elevada en las líneas celulares de gliomas malignos⁽¹⁶⁾. Las nuevas alternativas son de especial interés para tumores no abordables de forma quirúrgica que, debido a su mal pronóstico, y a la debilitación de la quimioterapia clásica, ameritan la búsqueda de tratamientos diferentes.

Algunos de los estudios realizados predicen una respuesta clínica a agentes quimioterapéuticos clásicos del orden del 50 al 70%^(3,17). Sin embargo, las aproximaciones experimentales presentan múltiples problemas tanto técnicos como teóricos. Por otro lado, aun conscientes de las limitaciones de los cultivos celulares, estos podrían ser de utilidad clínica ya que no existe un estudio prospectivo que verifique a mediano plazo la relación entre la sensibilidad in vitro y la respuesta in vivo. Por esta razón el objetivo de este trabajo consistió en la estandarización de técnicas de cultivo en monocapas y la evaluación de la sensibilidad a citostáticos mediante la determinación de la integridad de la membrana con azul de Tripán como abordaje inicial para un estudio a largo plazo que cubra aspectos básicos y clínicos del tratamiento de los gliomas.

Los pacientes seleccionados cumplieron los siguientes criterios: diagnósticos clínico y radiológico altamente sugestivos de tumor cerebral maligno, menores de 60 años, sin patología médica incapacitante, sin tratamiento previo, buen estado neurológico evidenciado por tomografía axial computarizada de cráneo y en algunos casos de resonancia magnética nuclear, confirmación histológica mediante biopsia extemporánea, con evaluación médica preoperatoria satisfactoria, y sin alteraciones en las pruebas de rutina de laboratorio. Las evaluaciones se realizaron en el Hospital Miguel Pérez Carreño. Se utilizó el esquema de Karnofsky, el cual evalúa el estado funcional del paciente, y se consideró incluir un puntaje no menor de 60, que consiste en sólo requerir asistencia ocasional. Se realizó la resección quirúrgica en forma radical y con la precaución de evitar la producción o el empeoramiento de las deficiencias neurológicas. En la toma de los fragmentos de tejido para cultivo se evitaron zonas de necrosis o edema periférico, luego se lavaron con abundante solución fisiológica estéril y fueron colocados en frascos con solución Hank libre de calcio y magnesio en presencia de 20 U/ml de penicilina cristalina y mantenidos en una estufa a 37°C hasta la mañana siguiente cuando fueron trasladados al Laboratorio. Se obtuvieron catorce muestras de tumores, cuatro fueron utilizadas para la estandarización inicial, dos se contaminaron en el traslado y ocho fueron evaluadas mediante las pruebas de sensibilidad.

Los fragmentos fueron colocados en una cápsula de Petri, seccionados con tijera y sometidos a digestión enzimática en una solución de tripsina al 0.25% en Medio Mínimo Esencial Eagle (MEM). Estos fueron incubados a 37°C durante 20 min y luego pasados por una malla estéril (105 mm). Las células obtenidas se centrifugaron a 3000 rpm por 5 min, fueron lavadas con medio fresco y sembradas en frascos de cultivo con 2 ml de MEM ajustado a pH 7.4 con hidróxido de sodio, en presencia de 10% de suero fetal bovino y los siguientes antibióticos: 20 U/ml de penicilina cristalina, 0.01 mg/ml de gentamicina y 0.02 mg/ml de bacitracina. Los frascos de cultivo fueron cubiertos previamente con poli-L-lisina, 1 mg/ml, y lavados con MEM antes de la siembra (viabilidad del 92-96% medida por exclusión de azul Tripán). El cultivo se realizó en estufa a 37°C en atmósfera humidificada con una concentración de 5% de CO₂ y 95% de aire hasta obtener confluencia celular (15-45 días).

Se utilizaron (1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosouréa (BCNU), (SP-4-2)diaminedicloroplatino (cisplatino, CPL) y 22-oxovincaleukoblastina (vincristina, VNC), en concentraciones de 0.045, 0.15 y 0.015 mg/frasco, respectivamente^(3,18). El procedimiento empleado se describe a continuación: el medio se extrajo y se añadió el citostático a frascos por duplicado en 3 ml de MEM, seguidamente se incubaron a 37°C por una hora, se extrajo el medio con el citostático, se realizó un lavado suave con solución salina y se procedió a evaluar la integridad de la membrana mediante la exclusión de azul de Tripán (50%). El BCNU se disolvió previamente en 200 ml de metanol. Las células teñidas con el colorante fueron contadas en un microscopio invertido y fueron corregidas o normalizadas con los resultados de frascos controles a los que se añadió sólo medio y se sometieron al mismo proceso de incubación. Un total de 200 a 300 células fueron evaluadas por este método.

Se realizó la prueba de Chi cuadrado y se consideró un valor de alfa de 0.05 para la significación estadística.

La edad de los catorce pacientes sometidos a cirugía fue de 2 a 51 años. Los ocho pacientes procesados se encontraban entre 41 y 51 años. El 78% de los pacientes consultaron a los 6 meses o más después de iniciar la sintomatología. Los síntomas más frecuentes fueron cefalea, vómitos, náuseas y deficiencias motoras. Dos pacientes presentaron convulsiones y alteraciones de conducta. Un paciente presentó alteración del control de esfínteres, disminución de la agudeza visual, deficiencias del lenguaje y disminución de la memoria. Al ingreso los síntomas predominantes se relacionaron con el aumento de la tensión endocraneana, tales como cefalea, vómitos y náuseas. Antes de la intervención quirúrgica se realizó tomografía axial computarizada a ocho, resonancia magnética nuclear a uno y ambas a cinco pacientes. Estos estudios reportaron con mayor frecuencia desplazamiento de la línea media, edema perilesión y colapso del ventrículo ipsilateral. Se evidenció lesión de ocupación de espacio: frontal en cinco, parieto-occipital en tres y del III ventrículo en dos de los casos. Los diagnósticos anatomopatológicos fueron los siguientes: diez de los tumores correspondieron a astrocitomas, los cuatro restantes fueron méduloblastoma, ependimoma, craneofaringioma y adenocarcinoma tiroideo. Los tumores 1, 3, 4, 7 y 8 fueron astrocitomas, el 2 un craneofaringoma, el 5 un méduloblastoma y el 6 un tumor metastásico tiroideo.

En la Tabla 1 se muestran los porcentajes de células muertas en cada una de las condiciones para los cultivos ensayados. El análisis de Chi cuadrado de tablas de contingencia para comparar el número de células teñidas y no teñidas con azul de Tripán, que incluyó todos los grupos por cada tumor (cuatro filas correspondientes a control y tres drogas, y dos columnas correspondientes a células teñidas y no teñidas) resultó estadísticamente significativo para todos los tumores (P < 0.001, Tabla 2). El análisis que correspondió a los resultados obtenidos con los citostáticos (tres filas correspondientes a las tres drogas, y dos columnas correspondientes a células teñidas y no teñidas) se señala en la Tabla 2 y las diferencias fueron estadísticamente significativas para los tumores 4, 5, 6 y 7. El análisis de Chi cuadrado del control y de cada una de las drogas para todos los tumores (ocho filas correspondientes a los ocho tumores, y dos columnas correspondientes a células teñidas y no teñidas) fue el siguiente: Control 23.55, P < 0.01; BCNU 36.87, P < 0.001; CPL 27.75, P < 0.001; VNC 102.17, P < 0.001. Se compararon los tumores con el mismo diagnóstico histopatológico que correspondieron a los astrocitomas (Tumores 1, 3 y 8), que fue el más frecuente y se obtuvo el siguiente resultado: Control 6.40, P < 0.05; BCNU 20.29, P < 0.001; CPL 10.09, P < 0.01; VNC 4.41, no significativo. Los valores de Chi cuadrado y la significancia de combinaciones de dos drogas entre sí (dos filas correspondientes a las dos drogas comparadas, y dos columnas correspondientes a células teñidas y no teñidas) se realizó para cada tumor y están reportados en la Tabla 3. Existió una respuesta diferencial significativa para los Tumores 2, 4, 5, 6 y 7. La media aritmética del número de células muertas para cada una de las condiciones y todos los tumores (n = 8) fue estadísticamente significativa con respecto al control (P < 0.001), pero no hubo diferencias entre las drogas.

DISCUSIÓN

En los estudios que evalúan la efectividad de drogas citostáticas para el tratamiento de tumores se confrontan múltiples dificultades. Evidentemente no existe una preparación ideal in vitro que reproduzca las condiciones del tumor in situ, pero una aproximación experimental podría contribuir al mejor enfoque terapéutico de los tumores cerebrales, especialmente los gliomas malignos que ocurren con elevada frecuencia y cursan con deficiencias neuropsiquiátricas graves. No sólo interesa la sobrevida, sino la oferta de una calidad de vida adecuada. La dificultad común a todos los enfoques experimentales corresponde a la farmacocinética del tratamiento con drogas citostáticas. Las medidas evalúan concentraciones en plasma, aunque éstas no se corresponden con las alcanzadas en el tejido, que siempre son menores. Si esto es así, también resulta difícil realizar estimaciones de las concentraciones de drogas a usar en condiciones de cultivo^(3,11,19). En el presente trabajo se escogieron concentraciones de drogas relacionadas con dosis efectivas cincuenta señaladas en la literatura⁽³⁾, aunque consideramos que sería deseable realizar curvas de dosis-respuesta que pudieran constituir una mejor guía para el tratamiento. A pesar de los inconvenientes que pueden señalarse, que no son diferentes a los que podrían relacionarse con un antibiograma de cualquier tipo, el hecho de encontrarse respuestas diferenciales a las drogas en un mismo tipo de tumor, hace que se tome en consideración una quimioterapia racional y dirigida. Por ejemplo, el Tumor 4, que corresponde a un glioblastoma multiforme, presentó comportamientos estadísticamente diferentes entre el BCNU y el CPL, así como entre el CPL y la VNC. En base a esto probablemente el clínico neurocirujano y el oncólogo no escogerían el BCNU ante una mayor eficiencia del CPL y la VNC. Sin embargo, sólo estudios prospectivos con un número adecuado de pacientes podrían determinar el valor de los resultados obtenidos en cultivo.

Una estandarización estricta es imprescindible para el buen manejo y comparación adecuada de los cultivos primarios de células de gliomas⁽²⁰⁾. Sin lugar a dudas los sistemas de cultivo celulares son la herramienta experimental más usada para comprender la biología de los gliomas⁽⁵⁾. La duración del cultivo determina las características celulares del mismo, por ejemplo, células positivas a la proteína acídica fibrilar glial son frecuentes en cultivos tempranos, sin embargo, existe gran variación en la expresión de marcadores celulares específicos con respecto al tiempo de permanencia en cultivo⁽²⁰⁾ y también en relación a la interacción de factores tróficos y células gliales⁽²¹⁾. Entre los marcadores bioquímicos se han señalado evidencias de relación de efectos de la sustancia P y la secreción de interleucinas por el tumor⁽²²⁾, de la presencia de una proteína liberadora de dopamina⁽²¹⁾, y sobre la secreción de prostaglandina E₂ por células de glioblastoma que puede regular las respuestas inmunológicas desencadenadas por el tumor⁽²³⁾. Aunque la significación de estos hallazgos no está clara hasta el presente, la duración del cultivo puede resultar en diferencias de la respuesta a los citostáticos, dado la heterogeneidad temporal que se puede encontrar. Una manera de reducir esta diferencia es mediante el establecimiento de criterios en la estandarización, que en el presente estudio correspondió a la confluencia celular.

El uso de cultivos a corto plazo de material derivado de tumores se utiliza para la identificación de nuevas drogas citotóxicas^{(8,24,25,26,27)}, esto debido a la relativa resistencia de los gliomas malignos a la quimioterapia. Si estas preparaciones son útiles para el mapeo de nuevas drogas, como una prueba biológica de sensibilidad apreciable, y realmente la combinación de drogas en quimioterapia antitumoral se realiza a ciegas, un enfoque racional de la misma no dejaría de tener utilidad, y podría hacerse a un costo relativamente alcanzable. Los cultivos de células derivadas de astrocitomas también han sido empleados en el estudio de sensibilidad a radiaciones⁽²⁸⁾. De manera que la comprensión de la diferenciación celular glial mediante avances en técnicas inmunológicas, de cultivo de tejido, y de biología molecular ha contribuido al desarrollo de la neurooncología⁽¹⁹⁾.

Con respecto a la sensibilidad diferencial de quimoterapéuticos conocidos, algunos estudios en líneas celulares señalan, por ejemplo, que el CPL ejerce su efecto antitumoral por la inhibición del activador de plasminógeno del tipo uroquinasa, sin embargo, el BCNU no tiene ese efecto⁽²⁹⁾, por lo que el CPL podría tener más propiedades antiinvasivas que el BCNU, al menos en las líneas estudiadas. Esta evidencia indica más caminos interesantes de estudio diferencial sobre drogas citostáticas en preparaciones in vitro.

Como ha sido previamente considerado⁽¹¹⁾, el valor predictivo de estos ensayos presenta dificultades, tales como la heterogeneidad celular en el tumor y por ende en los cultivos, y las modificaciones inherentes al estudio in vitro, que no reproduce la situación in situ. Se ha considerado que, más que la sensibilidad a drogas, estas pruebas son útiles para determinar la resistencia a las mismas. Sin embargo, un estudio prospectivo en el que se analice la respuesta a citostáticos de células tumorales en el cultivo con respecto a la respuesta terapéutica en astrocitomas grado 1 y 2, más que en 3 y 4, en los que ya hay deterioro, sería necesario para sustentar la utilización específica de los cultivos celulares.

Este estudio fue financiado por el FONACIT S1-2000-493 y por fondos para Investigación Aplicada del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. Agradecemos la asistencia secretarial de la Sra. Isabel Otaegui.

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