Potencial de oxidación de las Lipoproteínas de baja densidad en una población normal y en una población con diabetes mellitus tipo 2

O Obregón¹, M del C Lares², J Castro³ y G Garzazo⁴.

¹ Coordinador de Docencia e Investigación del Instituto Venezolano del Seguro Social. Director y Fundador del Postgrado de Endocrinología del Hospital Militar "Dr. Carlos Arvelo" avalado por la UCV. Presidente de la ILIB Venezuela. Vice-Presidente del Colegio Venezolano de Endotelio.

² Biólogo del Laboratorio de Investigaciones de Endocrinología y Enfermedades Metabólicas del Hospital Militar "Dr. Carlos Arvelo" y Profesora de la Escuela de Nutrición y Dietetica de la Facultad de Medicina de la UCVenezuela y del Postgrado de Endocrinología del Hospital Militar "Dr. Carlos Arvelo" avalado por la UCV. E-mail: marylares@hotmail.com

³ Biólogo del Laboratorio de Investigaciones de Endocrinología y Enfermedades Metabólicas del Hospital Militar "Dr. Carlos Arvelo" y Profesor del Postgrado de Endocrinología del Hospital Militar "Dr. Carlos Arvelo" avalado por la UCV.

⁴ Biólogo Jefe del Laboratorio de Investigaciones de Endocrinología y Enfermedades Metabólicas del Hospital Militar "Dr. Carlos Arvelo".

RESUMEN

La peroxidación de los lípidos es un proceso complejo, en donde los ácidos grasos insaturados reaccionan con el oxígeno molecular mediante un mecanismo de reacción en cadena vía radicales libres, y forman hidroperóxidos los cuales son degradados a una variedad de productos, los cuales pueden ser cuantificados por diferentes metodologías, como el caso del malondialdehido (MDA), un producto final de la degradación de los ácidos grasos polinsaturados. La finalidad de este trabajo fue establecer la susceptibilidad de las lipoproteínas de baja densidad a ser oxidadas, en dos poblaciones, una sana (n=30) entre 25-35 años y en una con diabetes tipo 2 (n=25) entre 25-50 años. En ambas poblaciones la lipoproteínas de baja densidad fueron obtenidas por ultacentrifugación, oxidadas in vitro y posteriormente se determinó el MDA por el método de ácido tiobarbitúrico. Los resultados de malondialdehido en la población normal oscilaron entre 0,77 y 1,17mmol/mg y en los diabéticos de 1,47 a 2,11 mmol/mg, encontrándose diferencias estadísticamente significativas entre ambas poblaciones. En conclusión los valores de MDA normales van de 0,77 a 1,17 mmol/mg, valores mayores podrían ser indicativos de riesgo adicional en estos pacientes.

Palabras Clave: Malondialdehido (MDA), Diabetes mellitus tipo 2 y LDL.

ABSTRACT

The lipids peroxidation is a complex process, where unsaturated fatty acids react with molecular oxygen by a mechanism of chain reaction via free radicals, form hidroperoxides which are degraded to a variety of products like alkenals, hidroxialquenals, ketones, alkenos, and others, which can be quantified by different methodologies, like malondialdehyde (MDA), a final product of the degradation of fatty acids. In the present work we determined the susceptibility of low density lipoproteins to be oxidized, in two populations one normal (n=30) between 25-35 years and other with diabetes type 2 (n=25) between 25-50 years, without previous treatment of antioxidant. The extraction of the LDL by ultracentrifugation, oxidized in vitro, and then MDA was determined by the thiobarbituric acid method. The results of malondialdehyde in the normal population was between 0,77 to 1,17mmol/L and in the diabetics population from 1,47 to 2,11 mmol/L with stadistic difference between both population. In conclusion, the normal values of MDA are from 0,77 to 1,17mmol/L, greater values could be indicative of additional risk in these patients.

Key Words: Malondialdehyde (MDA), Diabetes mellitus type 2 and LDL.

INTRODUCCIÓN

En las tres últimas décadas, el estudio de la reacción de peroxidación de los ácidos grasos insaturados ha adquirido relevancia en el campo de la biología y de la medicina por su implicación en varios estados patológicos como la aterosclerosis, el cáncer, la artritis reumatoidea(1,2,3). Entre estas patologías se encuentra la diabetes mellitus.

En los pacientes que padecen de diabetes se producen cambios en indicadores bioquímicos que evidencian una situación de estrés oxidativo: disminuyen las concentraciones plasmáticas de vitaminas antioxidantes como la A, C y E,(4,5) se incrementa la concentración sanguínea de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), se incrementa la susceptibilidad de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) a la oxidación, menor capacidad antioxidante total del plasma y se daña el material genético(6,7).

La peroxidación de los lípidos es un proceso en donde los ácidos grasos insaturados reaccionan con el oxígeno molecular mediante un mecanismo de reacción en cadena vía radicales libres, y forman hidroperóxidos los cuales son degradados a una variedad de productos como los alcanales, alquenales, hidroxialquenales, cetonas y alcanos entre otros, los cuales pueden ser cuantificados por diferentes metodologías, como el caso del malondialdehido un dialdehido producto avanzado de la oxidación(8,9,10).

También es importante señalar que la peroxidación de las lipoproteinas de baja densidad (LDL), es quizás la mayor contribución de los radicales libres a la génesis y agravamiento de la lesión aterosclerótica(11,12,13,14). La multiplicidad de los daños que la peroxidación de la LDL puede producir en la pared arterial se sintetizan básicamente en: a) Sobrecarga de colesterol en macrófagos y otras células de la pared arterial, esta sobrecarga está mediada por el receptor inespecífico y por los receptores CD36 y CD68. De esta entrada anormal, son responsables alteraciones tanto en los componentes lipídicos como en el componente proteico; b) Su capacidad de inducir muerte celular, especialmente, en células que están proliferando. Esta capacidad está ligada a ciertos fragmentos de ácidos grasos y a formas oxidadas de colesterol; c) La actividad biológica de los lípidos sometidos a la peroxidación. Muchos de éstos se comportan como verdaderas citoquinas y desencadenan una multiplicidad de respuestas celulares que incluyen la activación de las células endoteliales para producir factores quimiotácticos y de adherencia para monocitos (MCP-1 y X-LAM); sobre expresión de moléculas de adhesión como la VCAM-1 y la ICAM-1 que interactúan también, con neutrófilos; sobreproducción de Factor de crecimiento derivado de plaquetas; producción de interleucina IL-1, entre otros(15,16).

El presente trabajo fue conducido con la finalidad de establecer el potencial de oxidación de las lipoproteínas de baja densidad en la población sana y en una población con diabetes tipo 2, para tal fin se determinó la concentración de malondialdehido (MDA) como un factor de riesgo.

MÉTODOS

Este estudio fue realizado en una población sana, entre 25-45 años (n=30) donantes voluntarios de la Escuela de Enfermería del Hospital Militar "Dr. Carlos Arvelo", normoglicémicos, normotensos, con historia médica y examen físico normal y sin antecedentes familiares, no fumadores y sin tratamiento previo de antioxidante y una población diabética: entre 25-50 años (n=25) de pacientes de la consulta del Servicio de Endocrinología y Enfermedades Metabólicas del Hospital Militar "Dr. Carlos Arvelo", no fumadores y sin tratamiento previo de antioxidante. Dichos individuos fueron escogidos al azar de un universo representado por todos los pacientes diabéticos que acuden a dicho centro en un período de 6 meses. La condición de diabetes fue definida mediante los criterios de la American Diabetes Association(17). El promedio de evolución de la diabetes en este grupo de pacientes fue de 5 a 10 años, y la terapia era de Hipoglicemiantes orales (Sulfonilureas).

Para la evaluación del potencial de oxidación, a los pacientes se le extrajo 10 ml de sangre periférica en ayunas de 14 horas, (en tubos vacutainer con EDTA 0,15 p/v) y fueron centrifugados a 3.000g por 20 min. En ambas poblaciones se determinaron valores basales en suero de glucemia, colesterol, triacilglicéridos, HDL-Colesterol (ROCHE Diagnostic), y LDL-Colesterol utilizando la fórmula de Friedwald: LDL-Colesterol = Colesterol total – (triglicéridos / 5) – HDL-Colesterol.

Obtención de las fracciones de lipoproteínas LDL

Las diferentes fracciones de lipoproteínas del plasma fueron obtenidas por ultracentrifugación diferencial por flotación, de la siguiente manera: se tomaron 4 ml de plasma y se le agregó un volumen igual (1:1) de solución de NaCl densidad d = 1,006 gr/ml (NaCl 0,195 M) centrifugándose a 26.000g por 30 min a temperatura ambiente. Se tomó la fracción infranadante del tubo, y se le añadió un volumen igual de solución d = 1.006 gr/l (NaCl 0,95 M; NaBr 2,44 M) y se centrifugó a 105.536g por 18 horas. Al infranadante obtenido de esta fracción, se le agrega un volumen igual (1:1) de solución d = 1,182 gr/l (NaCl 0,195M; NaBr 7,65 M), y se centrifugó a 105.536g por 20 horas, luego del cual se obtuvo en el sobrenadante la fracción de LDL.

Desalinización de las lipoproteínas de baja densidad (LDL)

La desalinización de la fracción de LDL aislada, se realizó por exclusión molecular, empleando un columna de Sephadex G-25M, (Sigma Chemical Co.) utilizando el siguiente método, se equilibro la matriz de la columna con 25 ml con buffer TBS (Trizma base 10 mM; NaCl 0,14 M, pH 7,2), se coloca en la parte superior de la columna un volumen de muestra de 2,5ml y se descarta el efluente. Eluir los componentes de elevado peso molecular con 3,5 ml de buffer. Después de filtradas las muestras de lipoproteínas, se almacenan para su uso a 4°C, por un período no mayor de 8 días.

Determinación de proteínas

Una vez desalinizadas las fracciones de lipoproteínas, se determinó la concentración de proteínas de cada una de las muestras por el método propuesto por Lowry et al, en 1951(18).

Oxidación in vitro de la fracción lipoproteínas de baja densidad (LDL)

Las fracciones de LDL fueron oxidadas in vitro por el método propuesto por Thomas et al, en 1990(19).

Determinación de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (SRATB)

La determinación del grado de oxidación de las lipoproteínas de baja densidad se efectuó por el método propuesto por Kosugi H, et al, en 1991(20). El grado de oxidación de las lipoproteínas LDL, es expresado como mmol de MDA/mg de proteína.

Análisis estadístico

A los valores de los análisis realizados a las muestras de pacientes diabéticos se les calculó el valor promedio y desviación estándar y se comparó con la media obtenida para las muestras de suero normal. La prueba estadística utilizada fue la t de Student.

RESULTADOS

A continuación, en la tabla 1, se muestran los valores (promedios) en ayunas de las variables bioquímicas determinadas en el laboratorio para las poblaciones sanas y la población diabética, y en la tabla 2, se muestran los valores (promedio) de malondialdehido o sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico obtenido experimentalmente para las poblaciones anteriormente señaladas.

Tabla 1

Determinación de la química sanguínea en una población sana y en una población diabética

   Los resultados están expresados como la media y la desviación estándar.

   * Diferencias significativas con una p < 0,01

Tabla 2

Determinación del malondialdehido en una población sana y en una población diabética por el método del ácido tiobarbitúrico

                                          Los resultados están expresados como la media y la desviación estándar.

                                          * Diferencias significativas con una p < 0,01

En la tabla 1, se observa que los distintos parámetros de laboratorios determinados para la población diabética presentaron diferencias significativamente con el grupo sano (p < 0,01), así como los resultados experimentales de oxidación (tabla 2) expresados como sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, donde se encontraron valores de malondialdehido significativamente elevados (p < 0,01) en la población diabética (1,79 mmol/mg MDA) que representan aproximadamente al doble del valor obtenido para la población normal (0,97 mmol/l MDA).

DISCUSIÓN

Existen varios mecanismos a través de los cuales la actividad oxidativa puede ser incrementada en un paciente diabético, como el caso de la autooxidación de la glucosa que ocurre espontáneamente y produce radicales libres, peróxido de hidrógeno y quetoaldehidos reactivos(21). Por otra parte, también los macrófagos activados, presentes en la superficie vascular en todas las etapas de la aterosclerosis, liberan más superóxidos en la diabetes(22), esto se debe probablemente, a la activación de la vía de la pentosa por hiperglicemia e hiperinsulinemia, la cual al suplir la NADPH, favorece la producción de superóxido, que en presencia del oxido nítrico, reacciona rápidamente para formar peroxinitrito, esta reacción no solo limita la actividad biológica del óxido nítrico sino que también puede conducir a la formación del radical hidroxilo, que es el que desencadena la peroxidación de los ácidos grasos, con la consecuente formación de radicales libres en los pacientes diabéticos(23).

En la población diabética del estudio, se observaron valores significativamente más elevado de malondialdehido, así como diferencias significativas de los parámetros de laboratorio clínicos determinados (colesterol, triacilglicéridos, HDL-Colesterol y LDL-Colesterol), con respecto a la población sana. Los pacientes con diabetes tipo 2, usualmente presentan niveles elevados de triacilglicéridos y niveles disminuidos de HDL-Colesterol, a pesar de que la concentración de LDL-Colesterol en estos pacientes no difiere de los individuos normales. Sin embargo, la secreción de VLDL en el estado postabsortivo es mayor, posiblemente debido a la imposibilidad de la insulina para inhibir la lipólisis y reducir la síntesis hepática de VLDL. También se ha descrito una disminución en la depuración de estas partículas probablemente por una disminución de la afinidad de las VLDL por la lipoproteína lipasa. Por lo que estos pacientes pueden tener una preponderancia a partículas de LDL pequeñas densa, predominantes en el patrón B de las LDL, aun si los valores absoluto de concentración de colesterol de las LDL no estén significativamente elevados(24,25).

Diferentes estudios retrospectivos, han demostrados una asociación entre los niveles de lipoproteínas pequeñas densas y un incremento en el riesgo del desarrollo de enfermedades cardiovasculares(26). Las lipoproteínas pequeñas y densas, poseen un alto contenido de ácidos grasos polinsaturados, así como una baja cantidad de antioxidantes, por lo que estas partículas presentan una alta susceptibilidad a la oxidación. Este incremento en la oxidabilidad de la LDL, así como la baja afinidad al receptor de las LDL(27) y facilidad de penetrar la intima arterial(25), hacen que estas moléculas presenten un alto potencial aterogénico.

Los resultados experimentales obtenidos en este trabajo, concuerdan con otros estudios de oxidación realizados en poblaciones diabéticas y en poblaciones con síndrome coronario agudo(1,28,29,30), y señalan que este tipo de pacientes son individuos sometidos a un estrés oxidativo, que presentan un alto riesgo de desarrollo de enfermedad cardiovascular. La elevación del malondialdehido es un parámetro altamente sensible, de importancia en el diagnóstico clínico de disfunción endotelial, que es uno de los órganos más comprometidos cuando se produce un incremento en las especies reactivas del oxígeno en el organismo diabético. El tratamiento con antioxidantes puede proveer al individuo la protección necesaria contra las especies reactivas del oxígeno, y esta metodología puede ser utilizada para el seguimiento de terapias que restituyan la homeostasis en estos pacientes.

Para finalizar se encontró que el malondialdehido esta significativamente más elevado en los pacientes diabéticos. En conclusión tenemos que los valores de malondialdehido como normales, van de 0,77 a 1,17 mmol/mg, valores mayores podrían ser indicativo de riesgo adicional en estos pacientes.

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