Efecto del diltiazem sobre los lipidos sericos y lesiones ateroscleroticas en conejos hipercolesterolemicos

Marysabel Torres, Maira Carrizales, Rosalía Sutil, Mercedes Márquez, Marielena Muñoz, Aldo Reigosa* y  Víctor  Barrios**.

Departamento de Farmacología, Facultad de Ciencias de la Salud , Escuela de Medicina, Instituto Oncológico Miguel Pérez Carreño*, CIMBUC**, Universidad de Carabobo, Valencia.

Dirigir correspondencia a Marysabel Torres: Urbanización El Bosque, Av. 114 ( La Ceiba ), Residencias Vulcano, Torre A, Apto 3D, Valencia, Edo. Carabobo. Teléfono  Oficina: 02418666530, Habitación: 02416172739, Celular: 04144368392

Correo electrónico: mtorresr@uc.edu.ve

Este trabajo fue financiado por el Proyecto 96-008 del CDCH de la Universidad de Carabobo.

Resumen

El propósito de este estudio fue evaluar si la administración de diltiazem (30mg/día/vía oral), disminuye la hipercolesterolemia e inhibe la aterosclerosis en 38 conejos machos hipercolesterolemicos. Control: Conejarina por doce semanas, A: dieta rica con 0,3% de colesterol(DH)  por doce semanas. B: DH por doce semanas y desde la tercera semana hasta la dodécima diltiazem. Grupo C: DH por dos semanas y Conejarina + diltiazem desde la tercera semana hasta la duodécima y D: DH por dos semanas y Conejarina desde la tercera hasta la duodécima semana. Se determinaron Colesterol Total (CT), LDL-colesterol (LDLc) y Triglicéridos (Tg) por métodos enzimáticos. A la duodécima semana, se sacrificaron los conejos y el estudio histológico fue realizado por los siguientes métodos: 1. Hematoxilina Eosina evaluó la presencia de lesiones, 2. Gomori′s: evaluó la profundidad de las lesiones  3. Computarizado: midió la extensión de las lesiones. En el grupo A y B aumentaron significativamente el CT, LDLc y Tg en relación al control en todos los periodos, a excepción de los Tg a la duodécima semana. Respecto a las lesiones ateroscleróticas, los grupos A  y B presentaron lesiones tipo II, III, IV y V, el porcentaje promedio de área lesionada fue: Grupo A: 47,20%, Grupo B: 57,60%. Estos resultados permiten concluir que el diltiazem ejerce un efecto hipolipidemiante cuando se administra junto con una dieta rica en 0,3% colesterol, se confirma que una dieta adecuada es una buena estrategia para prevenir las dislipidemías y que el diltiazem no previno, ni indujo regresión de las lesiones ateroscleróticas.

Palabras claves: diltiazem, hipercolesterolemia, conejos.

Abstract

Effects of diltiazem on seric lipids and atherosclerotics lesions in hypercholesterolemics rabbits.

The purpose of this study was to evaluate whether the  administration of dilltiazem (30mg/day/oral route) decreases hypercholesterolemia and inhibits atherosclerosis in 38 male hypercholesterolemic rabbits. Control rabbits were given a standard diet for twelve weeks; Experimental rabbits were given: Group A: 0.3% cholesterol-enriched diet (HD) for twelve weeks. Group B:  HD for 12 weeks and diltiazem from week 3 until week 12. Group C: HD for  two weeks and  standard diet + diltiazem  from week 3 until week 12. Group D: HD for two weeks and standard diet from week 3 until week 12. Biochemical assays of Total Cholesterol (TC), LDL-cholesterol (LDLc) and Triglycerides (Tg) were done by enzymatic methods. The rabbits were sacrificed at week 12 and a histological study was carried out using the following methods: 1. Hematoxylin-eosin for determined the presence of lesions. 2. Gomori´s:  determined depth of lesions. 3. Computarized: determined extent of lesions. In groups A and B, TC, LDLc and Tg increased significantly in relation to control in all periods, with the exception of Tg at  week 12. Regarding atherosclerotic lesions, groups A and B presented Type II, III, IV and V; average percentages of lesion extent were : Group A: 47.20% and Group B: 57.60%. These results suggest that diltiazem exerts a hypolipidic effect when administered in conjunction with a 0.3% cholesterol-enriched diet. It was confirmed that an adequate diet is a sound preventive strategy against dyslipidemia, and that diltiazem does not prevent or induces regression of atherosclerotic lesions.

Key words: diltiazem, hypercholesterolemia, rabbits

Recibido: 31/03/2007        Aceptado: 15/05/2007

Introducción

En los últimos treinta años, se han acumulado evidencias tanto experimentales como clínicas que sugieren que los calcio antagonistas poseen un significativo efecto antiaterosclerótico, independiente de sus propiedades antihipertensivas¹. La enfermedad arterial coronaria es una de las consecuencias de la aterosclerosis, y se considera un desorden vascular que conduce a  incapacidad y muerte en la mayoría de los países desarrollados². Entre los cambios celulares asociados a una mayor vulnerabilidad de la placa aterosclerótica esta la perdida de la regulación del calcio y el hecho ha generado interés acerca del posible potencial efecto antiaterogénico de los calcio antagonistas^3,4.

Los antagonistas de calcio son considerados fármacos de primera línea en el tratamiento de la hipertensión, su efecto protector contra la isquemia miocárdica y potencial efecto antiaterogénico  ha sido demostrado en varios modelos experimentales, lo que podría contribuir a su efecto preventivo en el proceso inicial aterosclerótico⁵, sin embargo, los resultados son inconsistentes y controversiales, así, un estudio llevado a cabo hace mas de dos décadas en conejos hipercolesterolemicos concluye que el diltiazem (2mg/Kg/día), el isradipino (2,5 mg/Kg/día) y el verapamil (0.25 mg/Kg/día) disminuyen el contenido de calcio y magnesio de la aorta, sin embargo, el efecto antiaterogénico sólo fue observado con el verapamil⁶. En contraposición, otro estudio realizado en 1996, en hámsters hipercolesterolemicos muestra que la administración de 45 mg/Kg/día de diltiazem concomitantemente con la dieta rica en colesterol por un mes produjo una reducción en la severidad de las lesiones ateroscleróticas a nivel de las válvulas aorticas, arterias coronarias y arco aortico, postulándose que el diltiazem actúa en las primeras fases de la aterosclerosis bloqueando el transporte de lípidos y su acumulación en el espacio subendotelial; mientras que el tratamiento con otro calcio antagonista la nifedipina, no suprimió el efecto aterogénico de una dieta rica en grasa, lo que sugiere que no todas las drogas calcio antagonistas poseen el mismo mecanismo de acción  sobre la aterogenesis⁷.

Estudios recientes han renovado el interés acerca del potencial efecto estabilizador que poseen los calcio antagonistas de tercera generación, tal como la amlodipina, sobre la placa aterosclerótica⁸, así mismo, se ha reportado que la lacidipina disminuye la progresión y número de lesiones por paciente, postulándose que esta acción antiaterosclerotica es independiente de su efecto antihipertensivo⁹. Basados en lo anteriormente expuesto, se planificó el siguiente trabajo cuyo objetivo fue estudiar el efecto del tratamiento con diltiazem sobre los niveles séricos de lípidos y las lesiones ateroscleróticas de conejos hipercolesterolemicos Nueva Zelanda.

Métodos

Diseño experimental: Se emplearon treinta y ocho conejos machos Nueva Zelanda, de 8 a 10 semanas de edad, adquiridos en el Bioterio del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), fueron cuidados según las normas establecidas por el Instituto Nacional de Salud y la Oficina de Salud Publica de los Estados Unidos de América¹⁰. El Comité de Ética de Investigaciones de la Universidad de Carabobo aprobó el estudio.

Los animales fueron colocados en jaulas individuales bajo luz controlada y climatizados antes de empezar el estudio. El alimento se pesó antes de suministrarlo a los animales y 24 horas después,  se determinó que la dieta diaria a recibir cada grupo seria un promedio de 150 g/ día. El aporte de agua fue ad-libitum. El periodo de experimentación fue de 12 semanas.

Preparación de la dieta hipercolesterolemica: se preparó semanalmente, añadiendo a la Conejarina (dieta estándar), 0.3% de Colesterol (Sigma, St. Louis, MO)  y fue almacenada a 4^oC hasta su uso. La dosis de diltiazem (Parke-Davis, Venezuela) utilizada fue de 30 mg diarios por vía oral la cual se administró finamente dividida con el alimento. Los animales se dividieron en cinco grupos distribuidos al azar(Tabla 1)

Recolección de la muestra: Fueron extraídos 5ml de sangre de la vena marginal de la oreja de cada conejo, previo ayuno de 14 horas. Se realizaron dos tomas de básales de sangre, (antes de comenzar la administración de la dieta hipercolesterolemica, con un intervalo de una semana entre ellas). Después de comenzar la administración de la DH se realizaron tomas de sangre a las dos, seis, nueve y doce semanas.

Determinación de los lípidos séricos: Las determinaciones de los lípidos séricos colesterol total (CT), colesterol de las lipoproteínas de muy baja densidad (LDLc), y triglicéridos (Tg) se llevaron a cabo en el suero obtenido de la muestra de sangre. El CT y Tg se determinaron por el método enzimático colorimétrico directo (CHOD-PAP, Merck), la LDLc   mediante la técnica modificada¹¹ que consiste en la precipitación selectiva de las LDL con heparina (Merck) en ausencia de cationes divalentes como Mg⁺⁺, Ca⁺⁺  y   Mn⁺⁺, manteniéndose el pH del plasma en 5,2; quedando las VLDL y las HDL en el sobrenadante.

Estudio histopatológico: Al final de la duodécima semana, los conejos se sacrificaron, previa anestesia con ketamina (60mg/Kg), procediéndose a la remoción de la arteria aorta abdominal. El material se lavo inmediatamente en NaCl 0.15 M a temperatura ambiente y se fijó en solución neutra de formalina al 10% por 24 horas. Las preparaciones se deshidrataron en etanol en grado creciente (70 y 100%), se incluyeron en parafina, se hicieron cortes transversales de 4 mm de espesor y se tiñeron con hematoxilina-eosina y la técnica de Gomori′s, la cual se emplea para teñir las fibras elásticas, permitiendo evaluar la profundidad de la lesión¹². Las preparaciones se observaron al microscopio de luz con aumentos progresivos desde 2.5 hasta 40 x 10 y las lesiones se tipificaron según la clasificación de la American Heart Association¹³.

Extensión de las lesiones: Sobre las aortas preservadas en formalina al 10% se colocó papel transparente, se dibujó el contorno de las arterias y las lesiones con un marcador para acetato, luego se tomaron fotografías de cada una de ellas con una cámara digital, para luego trasladar la información a una computadora^14,15; posteriormente utilizando el programa Paint para Windows, se dibujaron por separado, los contornos y las lesiones y se grabaron en archivos separados, los cuales fueron procesados en un programa de computación diseñado (SDIAP) en la Unidad de Imágenes Medicas, CIMBUC, Facultad de Ciencias de la Salud , Universidad de Carabobo para calcular la extensión de las lesiones con relación a la magnitud total de la aorta.

Análisis estadístico: Los resultados obtenidos con relación al CT, LDLc y Tg se presentan como medias ± el error estándar (ES) y las comparaciones a los diferentes periodos se realizaron por ANOVA de una vía y el test de Tukey-Kramer (InStat, versión 3.0 for Windows). Las lesiones ateroscleróticas se agruparon según el tipo y número de lesiones, se les realizó la prueba de Fisher’s, para esto, se asociaron las lesiones que presentaron los grupos, de la siguiente forma: 1. Lesiones tempranas: se sumaron las Tipo II y III. 2. Lesiones avanzadas: se sumaron las Tipo IV y V, la comparación entre los porcentajes de lesiones de los grupos se realizo mediante una “t” no pareada. La probabilidad estadística de p<0.05 fue considerada significativa en todos los casos.

Resultados

La administración de una dieta rica en 0.3% de Colesterol incremento significativamente el CT, LDLc y Tg desde las  dos semanas (dato no mostrado).

Colesterol total y LDL-colesterol (LDLc): En los gráficos 1, 2 y 3 se observan los valores de Colesterol total y LDL-c a las seis, nueve y doce semanas de experimentación, los parámetros mencionados en los grupos A (Conejarina + 0.3% de Colesterol por 12 semanas) y B (Conejarina + 0,3% de Colesterol por 12 semanas y a partir de la tercera semana, administración de diltiazem hasta la duodécima semana) mostraron un incremento significativo (p<0.001) en relación con el grupo control en los periodos ya citados, los grupos C (Conejarina + 0.3 % de Colesterol por 2 semanas, y a partir de la tercera semana suspensión de la dieta hipercolesterolemica y administración de diltiazem hasta la duodécima semana) y D (dieta hipercolesterolemica por dos semanas y a partir de la tercera semana Conejarina hasta la duodécima semana) no mostraron cambios a las seis, nueve y doce semanas, con relación al control, ni entre ellos. A las seis, nueve y doce semanas, los valores de CT y LDLc en los grupos A y B fueron significativamente mayores que C y D (p<0.001), y significativamente mayores en A que en B (p<0.001), en todos los periodos, excepto las LDLc que a las seis semanas no mostró diferencias entre los grupos A y B ,

Triglicéridos: En el gráfico 4, se observa que a las seis, nueve y doce semanas de experimentación el grupo A presentó, con respecto al control un incremento significativo de los niveles de Tg (p<0,001), el grupo B fue significativamente mayor que su control a la sexta (p<0,001) y novena (p<0.05) semana, mientras que a la duodécima semana no mostró diferencias, a las seis, nueve y doce semanas, el grupo B, fue significativamente menor que en el grupo A (p<0,001), los niveles de Tg en el grupo A fueron significativamente mayores a los de los grupos C y D a la sexta, novena y duodécima semana (p<0,001), los valores de Tg del grupo B fueron mayores que los del grupo C (p<0,01) y que los del grupo D (p<0,001), a las seis y nueve semanas. A las doce semanas no hubo diferencias entre B y C y el grupo B fue mayor que D (p<0,001), a las seis, nueve y doce semanas no se observaron cambios entre los grupos C y D al compararlos con su control, cuando se comparan los grupos C y D, sólo se observó que a las 12 semanas, los Tg en el grupo C fueron significativamente mayores que en el grupo D (p<0.01).

   

FOTO 1: Lesión Tipo II en la que se observan  células espumosas y estrías lipídicas (Tinción hematoxilina-eosina. 200X)

FOTO 2: Lesión Tipo III la cual se caracterizan por células espumosas rodeadas de pequeñas gotas de lípidos intracelulares en escasa cantidad. (Tinción hematoxilina-eosina. 200X)

FOTO 3: Lesión Tipo IV: (Ateroma): donde se aprecia una densa acumulación de lípidos extracelulares y dentro de los macrófagos, que junto con las células del músculo liso proporcionan agregados de células espumosas que se observan como rayos de grasa o focos lipídicos. (Tinción hematoxilina-eosina. 100X)

FOTO 4: Lesión Tipo V: (fibroateroma): Se observa una proliferación celular considerable y formación de tejido fibroconectivo, para originar las placas fibrosas o fibroateroma. (Tinción hematoxilina-eosina. 100X)

Lesiones ateroscleróticas: el estudio anatomopatológico (Tabla 2) reportó que los grupos control, C (Conejarina + 0.3 % de Colesterol por 2 semanas, y a partir de la tercera semana, suspensión de la dieta hipercolesterolemica y administración de diltiazem hasta la duodécima semana) y D (dieta hipercolesterolemica por dos semanas y a partir de la tercera semana Conejarina hasta la duodécima semana) no presentaron lesiones a nivel de las arterias, mientras que los grupos, A ( Conejarina + 0,3% de Colesterol durante las doce semanas) y el B (Conejarina + 0,3% de Colesterol por 12 semanas y a partir de la tercera semana, administración de diltiazem hasta la duodécima semana) evidenciaron por medio de la tinción hematoxilina-eosina lesiones tipo II, III, IV y V las cuales se observan en las Fotos 1, 2, 3 y 4 respectivamente. En cuanto a la profundidad de las lesiones observadas en los grupos A y B, a través de la tinción de Gomoris, se observa disminución y hasta desaparición de las fibras elásticas de la capa muscular subyacente a la placa, con disrupción de dicha capa muscular y cúmulos de material lipídico, esto se presentó en todas los tipos de lesiones, acentuándose a medida que progresaban las lesiones, tal como se observa en la Foto 5, donde aparece una lesión tipo II (1) y tipo V (2). Se calculó el área de lesión de cada arteria (Tabla 2), mediante un programa computarizado SDIAPP y se determinó que los grupos A y B presentaron en gran parte de su superficie lesiones ateroscleroticas, el Grupo A presentó un promedio de 47,42% de superficie ocupada por placas ateroscleroticas y el Grupo B un 57,6% de área lesionada, no siendo esta diferencia significativa.(t=1.004, p=0.3353). Los resultados de la prueba de Fisher´s (intervalo de 95% de confianza: 0.784 a 2.466, usando la aproximación de Katz), arrojan que cuando se comparan las lesiones tempranas y avanzadas de los grupos A y B la diferencia entre las fracciones fue 0.1923, por lo que no hubo diferencias significativas entre estos.

FOTO 5 Lesiones Tipo II (1), y  tipo V (2): se aprecia que hay disminución y hasta desaparición de las fibras elásticas, de la capa muscular subyacente a la placa, con disrupción de dicha capa muscular y acúmulos de material lipídico, esto se presentó en todas los tipos de lesiones, acentuándose a medida que progresaban las lesiones. (Tinción de Gomoris. 200X)

Discusión

El objetivo de esta investigación fue evaluar los posibles efectos hipolipidemiantes y antiaterogénicos del diltiazem a la dosis de 30 mg. diarios. En este estudio, los hallazgos obtenidos indican que la administración de una dieta rica en 0,3% de colesterol incrementó significativamente el CT, LDLc y Tg a las  seis, nueve y doce semanas, por otra parte, la incorporación de diltiazem a las dos semanas de estar recibiendo la dieta rica en 0.3% de colesterol disminuyó significativamente el CT, LDLc  y Tg a las seis, nueve y doce semanas, lo que indica que el diltiazem administrado junto con una dieta enriquecida en 0.3% de colesterol puede contribuir a disminuir la hipercolesterolemia inducida por esta dieta, estos resultados concuerdan en parte con un estudio¹⁶ realizado en hámsters, a un grupo se les administró concomitantemente una dieta enriquecida con 3% de colesterol y 45 mg/kg de diltiazem + 20 mg/kg de enalapril y otro grupo de hámsters, solo recibió enalapril y encontraron que solo en el grupo en que asoció diltiazem mostró efecto hipocolesterolemico, así mismo, un estudio realizado en 1991¹⁷, en conejos con igual dosis de diltiazem a la usada por nosotros, reporta disminución de los lípidos séricos y una correlación positiva de estos con los peróxidos lipídicos plasmáticos y el contenido de calcio en la intima media de la aorta, parámetros que no fueron controlados en esta investigación, igualmente, otro trabajo realizado en 1988, reporta disminución de la LDLc   y del  contenido de calcio de la aorta  a  las  5 y 10 semanas de tratamiento con diltiazem¹⁸.

La disminución de los lípidos séricos observada en este estudio podría estar mediada por la hormona paratiroidea, ya que se ha asociado, el bloqueo de los canales de calcio con disminución de los niveles de esta y menos dislipidemia¹⁹, sin embargo en este estudio no se midieron niveles de la citada hormona.

En contraste con los resultados de esta investigación, dos estudios relativamente recientes, de Tzivoni y Sobal, en el 2001^20,21, no encontraron que el diltiazem tuviese un efecto hipolipidemiante como el que se mostró en este trabajo de investigación.

En este estudio, es necesario resaltar que si bien se observó una disminución del CT y LDLc en los conejos que recibieron diltiazem concomitante con la dieta hipercolesterolemica (grupo B), esta disminución nunca fue superior a la encontrada en el grupo C (Conejarina + 0.3 % de Colesterol por 2 semanas, y a partir de la tercera semana, suspensión de la dieta hipercolesterolemica y administración de diltiazem hasta la duodécima semana), sin embargo, cuando se comparó el grupo C con el grupo D (dieta hipercolesterolemica por dos semanas y a partir de la tercera semana, suspensión de la dieta hipercolesterolemica y Conejarina hasta la duodécima semana), no se observan diferencias significativas, por lo que los resultados del grupo C no se puede atribuir al diltiazem, sino a la suspensión de la dieta hipercolesterolémica, de ahí, que la puesta en practica de adecuados hábitos dietéticos sigue siendo una muy buena medida para evitar las dislipidemías, las cuales constituyen un importante factor de riesgo para enfermedad cardiovascular.

En el presente estudio, los grupos A (Conejarina + 0,3% de Colesterol  por 12 semanas) y el B (Conejarina + 0,3% de Colesterol por 12 semanas y a partir de la tercera semana, administración de diltiazem hasta la duodécima semana) no mostraron diferencias en cuanto a la extensión de las lesiones, por lo que no hubo prevención de la formación de lesiones, por otra parte, los grupos C (Conejarina + 0,3% de Colesterol por 2 semanas y a partir de la tercera semana, suspensión de la dieta hipercolesterolemica y administración de diltiazem hasta la duodécima semana) y D (dieta hipercolesterolemica por 2 semanas y a partir de la tercera semana suspensión de la dieta hipercolesterolémica y Conejarina hasta la duodécima semana) no presentaron diferencias en cuanto a las lesiones ateroscleróticas, lo que evidencia que el efecto de regresión observado en estos grupos, no se debe al diltiazem, sino a la dieta y corrobora  que esta es una medida valida para inducir regresión de las lesiones  ateroscleróticas

De ahí que, en relación a la actividad antiaterogenica del diltiazem, los resultados arriba mencionados señalan que no hubo ni prevención, ni regresión de la placa aterosclerótica una vez establecida la misma, lo cual concuerda con otros estudios, uno de ellos²², concluye que ni en las arterias, ni en órganos afectados de conejos hipercolesterolemicos se evidencio prevención de la acumulación del colesterol por los calcio antagonistas, otro estudio in vitro realizado por, Sobal, Menzel y Sinziger, 2001²¹, acerca la acción del diltiazem en la oxidación de las LDLc concluye que este fármaco no previene la formación de  sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS) y por ende no previene la oxidación de las LDLc, el cual es considerado un estimulo aterogénico.

Así mismo, un estudio más reciente plantea que las drogas que carecen de  carga positiva, tales como el diltiazem, felodipina, nifedipina y verapamil no tienen efecto sobre las propiedades de agregación de las LDL y formación de las células espumosas, mientras que las cargadas positivamente como la amlodipina en cambio, si disminuyen la agregación de las LDL, así, las propiedades electrostáticas de los bloqueantes de los canales de calcio podrían representar un novel mecanismo de su acción antiaterosclerotica²³.

En contraste, con nuestros resultados, hay autores como Napoli y col., 1992 que defienden el efecto antiaterosclerótico del diltiazem²⁴, describen que el diltiazem in vitro inhibe la oxidación de las LDLc, el cual puede ser un mecanismo que contribuya al efecto antiaterogénico in vivo de este fármaco, efecto que no se observo en este estudio. En ese mismo orden de ideas, Atkinson en 1997²⁵, indica que el diltiazem presenta un efecto de preservación del endotelio arterial. Mas recientemente²⁶, en un estudio planimetrico e histológico con diltiazem en aortas de pollos ateroscleróticos se encontró una reducción significativa de la deposición de lípidos en la aorta y una disminución en la extensión y distribución de las lesiones ateroscleroticas.

De ahí, que si bien estos resultados muestran que el diltiazem administrado concomitante con una dieta hipercolesterolemica disminuye el aumento de los lípidos inducido por dicha dieta, aunque no mostró efecto antiaterosclerótico, por lo que se hace necesario profundizar en este sentido, y considerar valorar otros parámetros: niveles de la hormona paratiroidea, LDL oxidadas, medición de calcio en la aorta, etc, además, se debería planificar estudios con períodos de experimentación y/o dosis de diltiazem mayores, por supuesto, considerando que no induzcan trastornos cardiovasculares en los animales de experimentación, para de esta manera contribuir a esclarecer el mecanismo hipolipidemiante del diltiazem observado en el presente trabajo y porque este efecto no se acompaño de una acción antiaterosclerótica .

Agradecimientos:

Al CDCH-UC por la subvención para hacer posible este trabajo, al Laboratorio Parke-Davis quien por medio del Señor Carlos Fraile nos proporciono generosamente el diltiazem, a la Técnico Nubia Zurita, quien realizó el procesamiento de las muestras para el estudio histológico, a los señores Robinsón Oviedo y Luis Lara por su valiosa asistencia en el cuidado y mantenimiento de los animales.

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