Efectos de los lípidos de la dieta sobre la contracción del músculo liso vascular y  la concentración de derivados del óxido nítrico en el plasma de ratas

Candelaria Alfonso-Pérez¹, Holger Ortiz², Miguel Rodríguez³, Juan De Sanctis⁴

¹Profesores Agregado. Sección de Investigaciones Cardio-Renales, Instituto de Medicina Experimental, Facultad de Medicina. UCV

²Profesor Agregado. Cátedra de Bioquímica, Escuela de Enfermería, Facultad de Medicina, UCV. Adscrito al Instituto de Medicina Experimental.UCV

³Profesor Agregado.Cátedra de Farmacología, Escuela Luis Razetti. Facultad de Medicina 

⁴Profesor Asociado. Instituto de Inmunología, Facultad de Medicina. UCV

Instituto de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela

Candelaria Alfonso. Instituto de Medicina Experimental, Sección de Investigación Cardio-Renales. Facultad de Medicina. UCV. alfonsoc@ucv.ve. No hay separatas disponibles.  

Agradecimiento: Este trabajo fue financiado parcialmente por el CDCH-UCV, mediante los proyectos Nº 09.33.5385.04 y 09.00.5704.04

Resumen

Determinamos el efecto de los lípidos de la dieta en la contracción de anillos de aorta y en la concentración de derivados del NO• en el plasma. Se utilizaron ratas Sprague-Dawley machos alimentadas por 6 semanas con una de las 3 dietas: ratarina, ratarina más 5% de aceite de soya ó  ratarina más 5% de aceite de oleína de palma + soya. Anillos de aorta torácica se fijaron en un baño de superfusión y se determinó el porcentaje de fuerza de contracción a  dosis crecientes de norepinefrina (1 x 10^-10 hasta 1 x 10^{- 5 M ).} Se analizaron los nitritos, nitratos y nitrotirosina como derivados del NO•. La dieta con oleína+soya presentó el mayor porcentaje del ácido graso C18:1,n-9 y el grupo que la ingirió presentó el menor porcentaje de la fuerza de contracción, la mayor concentración de nitrotirosina y menor concentración de nitratos en el plasma (p<0,05). Concluimos que el tipo de aceite vegetal ingerido modula la vasoconstricción aórtica y modifica la concentración de derivados del NO• que está relacionado con el estrés oxidativo.

Palabras claves: Oleína, aorta, nitrotirosina, rata

Abstract

We determined the effect of lipids diet in the aorta ring contraction and NO• derivatives in the plasma. Male rats Sprague-Dawley were fed during 6 weeks with one of the 3 diets: rat chow, rat chow more 5% of soy oil or rat chow more 5% of olein palm + soy oil. The aorta thoracic ring stuck at superfusion bath and percent of the contraction force to different doses from norepinephrine (1 x 10^-10 to 1 x 10^{- 5 M ) were determined. The NO•  derivatives analyzed were nitrite, nitrate and nitrotirosine. The diet with olein + soy presented the greater percentage of the fatty acid C18:1,n-9. The consumed of the olein + soy oil decrease the percent of the contraction force of aorta thoracic, increase the concentration of nitrotirosine and decrease the concentration of nitrates in the plasma (p<0,05). We concluded that the type of ingested vegetal oil modulates the aortic vasoconstriction and modifies the concentration of NO• derivatives, related to oxidative stress.}

Key words:  olein, aorta, nitrotirosine, rat

Introducción

En los humanos, los lípidos de la dieta modifican el riesgo cardiovascular, posiblemente porque los ácidos grasos con diferente grado de instauración y número de carbonos modulan la función vascular. El ácido linolénico (C18:3,n-3) en relación al ácido esteárico (C18:0) produjo menor inhibición de la relajación dependiente del endotelio en anillos de aorta; mientras que, los ácidos grasos incrementan la inhibición con el aumento de número de carbonos, desde C12:0 hasta C18:0¹. En cultivos de células endoteliales arteriales del pulmón de porcino, el ácido linoleico en relación al ácido oleico, aumentó la concentración de nitrotirosina y la [Ca²⁺]i, con lo cual, Saraswathi y col (2004) relacionaron la [Ca²⁺]i con la respuesta inflamatoria en el tejido endotelial, ya que, el aumento de la [Ca²⁺]i estimula la formación de óxido nítrico (NO^•) sustancia vasodilatadora, que en presencia del radical superóxido (O₂^•) forma peroxinitrilo (ONOO^-)². La nitración en residuos esenciales Tir294 y Tir295 de la SERCA 2a (ATPasa Ca²⁺ del RS) inhibe la acción enzimática en el músculo estriado, por lo tanto, la nitrotirosina en plasma es considerada un marcador del daño tisular agudo o crónico³. La nitrotirosina está relacionada con los procesos proinflamatorios, a través del factor nuclear Kappa-B (NF-kB) que activa genes relacionados con la formación de sustancias quimiotácticas, 1COX-2 y moléculas de adhesión⁴. Los lípidos parecen ser mediadores de la respuesta inmune; ya que, ratones de la cepa DC-1 sometidos a dietas deficientes de ácidos grasos esenciales fueron resistentes a sufrir diabetes inducida por estreptozotocina inyectada vía intraperitoneal en múltiples dosis por 5 días (40 mg/Kg de peso) con respecto a los ratones controles⁵. El transporte y utilización de los ácidos grasos en el músculo cardiaco, dependen en gran parte  de la actividad metabólica del músculo. Los lípidos de la dieta producen cambios en el perfil de los ácidos grasos en los fosfolípidos, que podrían modular la actividad de receptores y canales iónicos de las membranas⁶.

En la pared arterial, los radicales libres del oxígeno se producen en las células del músculo liso y en los fibroblastos en respuesta a la angiotensina II, que estimula la actividad NADPH oxidasa de membrana y del endotelio⁷. Fridovich en 1978 señaló que  los radicales del oxígeno se originan con la producción del O₂•⁸. Una producción elevada de O₂• inactiva al NO•, pues al reaccionar producen ONOO- ⁹, que al aumentar su concentración nitrifica a las proteínas integrales y solubles, en los carbono 3 del anillo aromático de los residuos de L-tirosina cercano a un glutamato que se encuentra en la estructura externa de las proteínas, formando la nitrotirosina¹⁰.

El objetivo de este trabajo fue evaluar los efectos de dietas enriquecidas con aceites de oleína+soya o soya  en la fuerza de contracción a dosis crecientes de norepinefrina en la aorta de ratas, así como, en la producción de nitrotirosina, sustancia relacionada con los procesos inflamatorios.

Métodos

Se utilizaron ratas Sprague-Dawley machos alimentadas por 6 semanas con una de las 3 dietas: ratarina (grupo control), ratarina más 5% de aceite de soya ó ratarina más 5% de aceite de oleína de palma + soya (N = 5 por grupo). Los animales en ayuna de 12 h fueron anestesiados vía intraperitoneal con thiopental sódico (50 mg/kg de peso). La muestra de sangre heparinizada se extrajo por la cola de la rata y se practicó toracotomía mediana. Se extrajo la aorta torácica y se colocó en cápsula de petri que contenía solución Krebs-Henseleit (NaCl 119mM; KCl 4,7 mM ;  MgSO₄ 1,2 mM ; KH₂PO₄ 1,2 mM ; NaHCO₃ 25 mM ; CaCl₂ 2,5 mM y Glucosa 11 mM ), burbujeada con 95 % de O₂  y 5 % de CO₂, pH 7,4 a 37 ºC . Se eliminó los tejidos conectivo y  adiposo adheridos a la pared externa de la aorta.  Anillos de aorta 3 a 5 mm de longitud se colocaron en uno de los estribos conectado verticalmente en el fondo del baño de superfusión y el otro extremo al transductor de fuerza-desplazamiento FT0 3C (Grass instruments®) con un preamplificador Grass® modelo 7C . La tensión aplicada fue 2 g y se dejó estabilizar por 2 h, lavando cada 30 min con solución Krebs-Henseleit. Los registros de las contracciones isométricas se obtuvieron en un polígrafo Grass® modelo 7C a 2,5 mm/min. Se efectuó una prueba de respuesta de contracción a acetilcolina (1x10^{- 6 M} ) de la preparación precontraída con norepinefrina (1x10^{- 7 M ) a fin de asegurar la presencia de endotelio. La preparación es lavada con solución Krebs-Henseleit y estabilizada por 30 min. Se determinó el porcentaje de fuerza de contracción a diferentes dosis de norepinefrina (1 x 10-10} hasta 1 x 10^{- 5 M )11,12}. 

La concentración de nitrotirosina en plasma se determinó mediante una prueba de ELISA tipo sándwich¹³. La concentración de nitritos se determinó mediante el método colorimétrico de Griess con pequeñas modificaciones¹⁴. Los nitratos fueron reducidos a nitritos utilizando la enzima nitrato reductasa, para luego aplicar el método de Griess modificado¹⁴.

El porcentaje de ácidos grasos se analizó por cromatografía en fase gas-líquida, previa extracción de los lípidos con cloroformo-metanol en proporción 2:1 (v/v) y agua¹⁵. Como antioxidante se utilizó 10 mg de butil-hidroxi-tolueno (BHT)/100 ml de solvente. Los lípidos se transesterificaron a ésteres metílicos de ácidos grasos utilizando 5 ml de la mezcla anhídrica metanol: tolueno: ácido sulfúrico en proporción 90:10:1 (v: v: v) en reflujo a 80 º C por 1 h. Los ésteres metílicos se extrajeron con 5 ml de hexano. La fase orgánica se lavó con agua a 4 ºC y se filtró sobre papel Whatman® número 1. Los ésteres metílicos de las ácidos grasos se analizaron en un cromatógrafo marca Hewlett- Packard® modelo 6890, con detector de llama, columna capilar de 30m x 0,25mm con INOWAX® de 0,25 µm a 200º C. La fase móvil fue H₂. Los ésteres metílicos se identificaron utilizando el tiempo de retención de patrones Sigma®.

Resultados

En la tabla Nº 1 se observa el porcentaje de los ácidos grasos de las dietas suplementadas con 5 % de aceite de oleína+soya o de soya y del grupo sin suplemento de aceite (control). La dieta con oleína+soya presentó mayor porcentaje de ácido palmítico (C16:0) y ácido oleico (C18:1,n-9) respecto a la dieta con soya (p<0,05); mientras que el porcentaje del ácido linoleico (C18:2,n-6) fue mayor en la dieta con soya (p<0,05).

En la figura Nº 1 se muestra el porcentaje de contracción de los anillos de aorta de rata, en respuesta a dosis creciente de norepinefrina. Los anillos de aorta del grupo oleína+soya presentaron menor porcentaje de contracción (p< 0,05) a dosis de norepinefrina entre   1x10^-7 y  1x10^{- 8 M respecto a los grupos control y soya.}

Figura 1.- Curva  dosis - respuesta a la norepinefrina en anillos de aorta de rata con dietas suplementadas con 5 % de diferentes aceites. N = 5 para cada grupo. Media  ± EE. Los anillos de aorta del grupo oleína+soya presentaron menor porcentaje de contracción (p< 0,05)

En la figura Nº 2 se observa la concentración de nitrotirosina en el plasma de ratas con dietas suplementadas con 5 % de diferentes aceites. El grupo suplementado con aceite oleína+soya presentó aumento significativo (p<0,05) de la nitrotirosina con respecto a los grupos control y soya. En la tabla Nº 2 se reporta la concentración de nitritos y nitratos en plasma de ratas, el grupo suplementado con oleína+soya presentó menor concentración de nitratos respecto a los grupos control y soya (p<0,05), pero no hay diferencia significativa (p>0,5) en la concentración de nitritos.

Figura 2.- Concentración de nitrotirosina en el plasma de ratas con dietas suplementadas con 5 % de diferentes aceites. N = 5 para cada grupo,  Media ± EE.

El grupo suplementado con 5 % de aceite oleína + soya presentó diferencia significativa (p<0,05) con respecto a los grupos control y soya

Discusión

En Venezuela, el tipo de aceite que se consume dependen de la disponibilidad en el mercado externo, estos aceites aportan ácidos grasos esenciales necesario para la salud, pero también, contienen ácidos grasos que pueden estar asociados con efectos adversos, ocasionando patologías cardiovasculares^16,17. La formación de nitrotirosina está relacionada con el aumento de la producción de los radicales libres, que ocasionan oxidación de los lípidos de las membranas¹⁸. Los ácidos grasos desempeñan un papel relevante en la disfunción endotelial, sin embargo, el papel exacto de los diferentes ácidos grasos y sus mezclas, particularmente durante la fase  inicial del daño endotelial  no es bien conocido, no obstante, las dietas enriquecidas con ácidos grasos de la serie n-3 reducen el riesgo de desarrollar enfermedad cardiovascular¹⁹, en nuestros resultados el porcentaje de ácidos de la serie n-3 fue mayor en el grupo control cuyo origen puede ser la harina de pescado utilizada en la formulación de la dieta basal. La fracción de oleína del aceite de palma aportó el mayor porcentaje de ácido oleico en la dieta oleína+soya y posiblemente este ácido graso o el porcentaje relativo de los ácidos grasos está involucrado en la disminución de la contracción de los anillos de aorta, que se refleja en un desplazamiento de la curva dosis- respuesta hacia la derecha, con una DE50 de norepinefrina mayor. Además, Herrera y col. han demostrado que el aceite de oliva con alto contenido de ácido oleico contribuye a una menor prevalencia de enfermedades cardiovasculares en la región del mediterráneo²⁰. Los efectos hipolipemiantes de las estatinas mejoran la función endotelial, entre otras razones, por incremento de la óxido nítrico sintetasa endotelial y por una reducción de la expresión de las moléculas de adhesión celular²¹. Cuando analizamos la acción de la hidralazina, un vasodilatador, se observó que el grupo soya disminuyó el efecto máximo de la contracción respecto al grupo control (resultados no publicados), la composición de los lípidos de la dieta modificó la respuesta a agentes vasodilatadores.

Los nitritos (NO₂^-) y nitratos (NO₃^-) son los productos finales del catabolismo del NO• y ONOO- en la actividad microbiana²² y en ciertas patologías. En muestras de líquido cefalorraquídeo, así como, en suero de pacientes con esclerosis múltiple se ha encontrado metabolitos del NO•²³, también se ha reportado niveles altos de nitrotirosina con bajas concentraciones de nitratos y nitritos que varían con el estado y la actividad de la esclerosis múltiple²⁴. No obstante, en nuestros resultados realizado en animales sanos, en el grupo oleína+soya encontramos mayor concentración de nitrotirosina (marcador citotóxico), con disminución significativa (p<0,05) de la concentración de nitratos en el plasma, respecto a los grupos control y soya, que se diferencian en el porcentaje de ácidos grasos y la cantidad de lípidos totales (tabla 1). Hu y col. reportaron que el tipo de ácidos grasos es más influyente que la cantidad total de los lípidos de la dieta en el riesgo de enfermedad coronaria²⁵. El aumento de nitrotirosina indicaría la presencia de un proceso inflamatorio en el grupo que ingirió oleína+soya, que parece estar influenciado por el aumento del porcentaje del ácido oleico, pero debido a la complejidad de la mezcla de los distintos ácidos grasos de las dietas, también puede existir diferencia en la modulación de la reactividad muscular, quizás asociada a la expresión de genes mediante la activación de receptores nucleares, o quizás también a la modulación de canales iónicos a nivel de membrana por los diferentes ácidos grasos. Podemos concluir que: (I) los anillos de aorta de la dieta oleína+soya presentaron menor contracción en presencia de norepinefrina, posiblemente por la modulación de la función de los receptores  o de los canales iónicos a  través de los ácidos grasos de los fosfolípidos o por la acción directa de los ácidos grasos, además, (II) el grupo oleína+soya presentó mayor concentración de nitrotirosina plasmática, lo cual se relaciona a procesos proinflamatorio, posiblemente a través del factor nuclear kappa beta.

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