Susceptibilidad antimicrobiana de bacilos gramnegativos  anaerobios facultativos oxidasa positiva.

Bravo Fariñas Laura¹, Majano Mendoza Amanda², Fernández Abreu Anabel¹, Martínez Motas Isabel³, Núñez Fidel¹, Mederos Cuervo Lilian¹, Ramírez Álvarez Margarita¹, Castro-Escarpulli, Graciela⁴.

¹Laboratorio Nacional de Referencia de Enfermedades Diarreicas Agudas, Instituto de Investigaciones en Medicina Tropical “Pedro Kouri” (IPK), La Habana, Cuba.

² Instituto Salvadoreño del Seguro Social, Laboratorio Clínico de la Unidad Médica Zacamil, San Salvador, El Salvador. *Correspondencia a: DrC. Laura Bravo Fariñas (e-mail: laura@ipk.sld.cu)

Resumen

El carácter autolimitado de las infecciones entéricas provocadas por los bacilos gramnegativos anaerobios facultativos oxidasa positiva reserva la terapia antimicrobiana para los casos de disentería severa, enfermedad parecida al cólera o en las diarreas prolongadas, para los pacientes inmunocomprometidos con enfermedades subyacentes y ante una evidencia de infección extraintestinal. En esta investigación se estudió la susceptibilidad antimicrobiana de 89 cepas de bacilos gramnegativos anaerobios facultativos oxidasa positiva aislados de pacientes con enfermedad diarreica aguda enviados al Laboratorio Nacional de Referencias de Enfermedad Diarreica Aguda del Instituto de Medicina Tropical Pedro Kouri aislados de heces de pacientes con enfermedad diarreica aguda, frente a 23 antimicrobianos utilizando el método de Bauer-kirby con el fin de conocer en nuestro país la susceptibilidad antimicrobiana de estos microorganismos. El estudio de la susceptibilidad antimicrobiana mostró elevados porcentajes de resistencia de Aeromonas spp. frente a la cefazolina, cafalotina y cefalexina, la mayoría de las cepas de Vibrio cholerae no-01 y Plesiomonas shigelloides fueron resistentes al trimetoprim sulfametoxazol y cefazolina, respectivamente. Mientras que, la resistencia a la ampicilina fue común para los tres géneros. No se observaron cepas de Vibrio cholerae no-01 multirresistentes. Los resultados obtenidos señalan la importancia de implementar una continua y sistemática vigilancia microbiológica de estos agentes.

Palabras clave: Susceptibilidad antimicrobiana, Aeromonas, Vibrio, Plesiomonas.

Summary

The self limit character of the enteric infections caused by the gramnegative bacilli anaerobes medical oxidasa positive reservation the therapy antimicrobiana for the cases of severe dysentery, similar illness to the cholera or in the lingering diarrhoeas, for the patient inmunocomprometidos with underlying illnesses and before an evidence of infection extraintestinal. In this investigation the susceptibility antimicrobiana of 89 stumps of bacilli gramnegativos isolated anaerobes medical positive oxidasa was studied of patient with illness diarrheic sharp correspondents to the National Laboratory of References of Illness Sharp Diarrheic of the Institute of Tropical Medicine Pedro isolated Kouri of grounds of patient with illness sharp diarrheic, in front of 23 antimicrobianos using the method of Bauer-kirby with the purpose of knowing in our country the susceptibility antimicrobiana of these microorganisms. The study of the susceptibility antimicrobiana showed high percentages of resistance of Aeromonas spp. in front of the cefazolina, cafalotina and cefalexina, most of the stumps of Vibrio cholerae no-01 and Plesiomonas shigelloides went resistant to the trimetoprim sulfametoxazol and cefazolina, respectively. While, the resistance to the ampicilina was common for the three goods. Strains of Vibrio cholerae were not observed no-01 multirresistentes. The obtained results point out the importance of implementing a continuous and systematic surveillance microbiological of these agents.

Words key: antimicrobial susceptibility , Aeromonas, Vibrio, Plesiomonas.

Recibido: 10/02/2009 Aceptado: 04/03/2009

Introducción

Las infecciones gastrointestinales pueden estar asociadas a los bacilos gramnegativos anaerobios facultativos oxidasa positiva, constituyendo la diarrea el síntoma principal, la que puede ser liquida (secretoria) o de forma disentérica. Todas las formas de diarrea se desarrollan después de un corto periodo de incubación que muchas veces no supera las 48 h., aunque las infecciones subagudas o crónicas pueden persistir durante periodos prolongados (14 días-3 meses)¹. Generalmente, la diarrea liquida se presenta como una afección leve y autolimitada. No obstante pueden existir casos con un cuadro clínico similar al del cólera, con un máximo de 30 deposiciones en el pico de la enfermedad. En ocasiones los casos con diarrea leve o severa se acompañan de dolor abdominal, fiebre o vómitos. Estos bacilos pueden estar también asociados con celulitis, colecistitis, endoftalmitis, osteomielitis, peritonitis, pseudoapendicitis, piosalpingitis, pancreatitis y abscesos hepáticos². La mayoría de las infecciones causadas por estos bacilos son autolimitadas y no requieren de terapia antimicrobiana. Pero en algunos pacientes con infecciones intestinales severas, la terapia antimicrobiana es beneficiosa. En estos casos, las fluoroquinolonas y el trimetroprim sulfa se consideran una buena opción y que acortan el curso de la diarrea. En contraste con las infecciones intestinales en las extraintestinales el tratamiento antimicrobiano se requiere de forma urgente³.

El objetivo de este trabajo fue determinar la susceptibilidad antimicrobiana de bacilos gramnegativos anaerobios facultativos oxidasa positiva aislados de pacientes con enfermedad diarreica aguda en Cuba, para asi contribuir al mejor conocimiento de las medidas terapeuticas a emplear en los procesos infecciosos causados por estos microorganismos.

Materiales y Metodos

El presente trabajo se realizo en el Laboratorio Nacional de Referencia de Enfermedades Diarreicas Agudas del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourih" (LNR/EDA/IPK), La Habana, Cuba.

Se estudiaron 89 cepas de bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos oxidasa positiva, aisladas de heces de pacientes con enfermedad diarreica aguda (EDA), procedentes de nueve Centros Provinciales de Higiene y Epidemiologia (CPHE) de Cuba; recibidas y conservadas en el LNR/EDA/ IPK en el periodo comprendido desde agosto del 2007 a marzo del 2008. Las 89 cepas se encontraban conservadas en el medio de conservacion para enterobacterias "Pasteur", se inocularon en caldo Cerebro-Corazon y se incubaron en aerobiosis a 370 C (18-24 h). Posteriormente, una azada del cultivo en caldo se sembro por agotamiento en placas de agar MacConkey y agar sangre con 5% de sangre de carnero incubandose con las mismas condiciones ya descritas anteriormente. Al dia siguiente se seleccionaron al menos tres colonias translucidas, convexas y de bordes regulares en el agar MacConkey; y del agar sangre se tomaron tres colonias hemoliticas o no, convexas y de bordes regulares, aislamientos que se inocularon por puncion y estria en los medios de diferenciacion primaria: agar hierro y dos azucares de Kligler (AHK) y agar Hierro Lisina (AHL), ambos se incubaron en aerobiosis a 370 C, de 18 a 24 h. y transcurrido ese periodo de tiempo se seleccionaron los cultivos que mostraron las siguientes imagenes: en el AHK: Utilizacion de la glucosa oxidativa y fermentativamente, presencia o no de gas, produccion o no de acido sulfidrico, utilizacion o no de lactosa oxidativa y fermentativamente; y en AHL: Descarboxilacion o no de la L- lisina, produccion o no de acido sulfidrico^4,5.

A todas las cepas se les investigo la presencia de la enzima citocromo oxidasa, segun el metodo de Kovacs⁶, se les realizo la coloracion de Gram. Todas las cepas fueron caracterizadas en genero segun los metodos de clasificacion bioquimica utilizados en la bacteriologia convencional^6,7.

La susceptibilidad antimicrobiana se determino por el metodo de difusion en agar con discos Bauer- Kirby⁸.

Se investigo la susceptibilidad de las cepas frente a 23 antimicrobianos⁹ recomendados por el Instituto de Estandares de Laboratorio Clinico (CSLI)10, siguiendo la metodologia descrita para los microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae (Aeromonas spp. Y Plesiomonas sp.) y Vibrionaceae (Vibrio spp.). Las caracteristicas de cada uno de los farmacos estudiados se muestran a continuacion: acido nalidixico (NAL) 30 mg ; amikacina (AK) 30 mg; ampicilina (AMP) 10 mg; aztreonam (ATM) 30 mg; cefalotina (CF) 30 mg; cefazolina (KZ) 30 mg; ceftazidima (KAZ) 30mg; ceftriaxona (CRO) 30 mg; cefalexina (CL) 30 mg; cefoxitina (FOX) 30 mg; cefoperazona (CFP) 75mg; ciprofloxacina (CIP) 5 mg ; cloranfenicol (C) 30 mg; doxiciclina (DO) 30 mg; gentamicina (CN) 10 mg; Imipenem (IPM) 10 mg; meropenem (MEN) 10 mg; nitrofurantoina (F) 300 mg; norfloxacina (NOR) 10 mg; kanamicina (K) 30 mg; tetraciclina (TET) 30 mg; trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) 1,25/23,75 mg; sulfonamida (S3) 250 mg.

Las cepas de V. cholerae se investigaron solamente frente a los siguientes antimicrobianos: ampicilina, tetraciclina, trimetoprim- sulfametoxazol, sulfonamida y cloranfenicol, recomendados por el CSLI¹⁰.

Se utilizaron las siguientes cepas controles, segun las recomendaciones de CSLI (2007):Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 35218,Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Se considero como multirresistente a las cepas que mostraron resistencia a tres o mas familias de los antimicrobianos investigados¹¹.

Resultados

Como resultado de la caracterizacion fenotipica de las 89 cepas de bacilos gramnegativos anaerobios facultativos oxidasa positiva, se identificaron: Aeromonas spp. 73 cepas (82,0%), Vibrio spp. 9 cepas (10,1%) y Plesiomonas shigelloides 7 cepas (7,9%).

En relacion a la susceptibilidad antimicrobiana de las cepas Aeromonas analizadas durante el periodo en estudio se demostro que el 100% de las cepas resultaron resistentes al menos a un antimicrobiano de los estudiados (73/73). El analisis de la resistencia antimicrobiana obtenida en este trabajo puso en evidencia un porcentaje elevado de cepas resistentes a la cefazolina (94,5%), mientras que a la cefalexina y cefalotina el numero de cepas resistentes fue menor (58,9 y 53,4%), respectivamente. El 100% de cepas de Aeromonas resulto sensible al meropenem y a la gentamicina, observan dose también porcentajes de sensibilidad elevados (superiores o iguales al 90%) frente a los siguientes antimicrobianos: ceftriaxona, tetraciclina, cefoperazona, cloranfenicol, nitrofurantoina, ceftazidima, imipenem, ciprofloxacina, aztreonam, norfloxacina, amikacina y kanamicina (Tabla 1).

La multirresistencia se observó en el 78,1% (57/73) de los aislamientos. Las cepas mostraron la resistencia combinada en 12 patrones. Se observó que los patrones con mayor porcentaje de representabilidad resultaron: CF-, SXT-, AMP- (77,19%); CF-, IPM-, SXT-,AMP- y CF-, NAL-, SXT-,AMP- (ambos con 3,53%) (Tabla 2).

Los bacilos pertenecientes al género Vibrio spp. fueron identificados como Vibrio cholerae no-01 y el 100% de estos aislamientos resultaron sensibles a la tetraciclina y al cloranfenicol. La resistencia fue observada en el 66,6% (4/6) de los aislamientos. Se detectó que los mayores porcentajes de resistencia de las cepas en estudio, se observaron en: ampicilina y trimetoprim sulfametoxazol con un 55,5% y un 44,4% respectivamente. No se observaron cepas multirresistentes. (Tabla 3).

Cuando se analizó el comportamiento de P. shigelloides frente a los antimicrobianos investigados, se constató que el 100% de las cepas resultaron sensibles a los siguientes fármacos: cefoxitina, cloranfenicol, nitrofurantoina, ácido nalidixico, meropenem, imipenem y ciprofloxacina. Los valores más altos de resistencia se observaron en: cefazolina y ampicilina con un 57.1 y 42.8% respectivamente (Tabla 4).

Tomando en consideración el patrón establecido para catalogar las cepas como multirresistentes, la misma se presento en 3 (42.8%) de las cepas de P. shigelloides en este estudio. Se detectaron tres patrones de multirresistencia diferentes (tabla 5).

Discusión

El empleo de los antimicrobianos para el tratamiento de las infecciones gastrointestinales causadas por microorganismos pertenecientes a los géneros Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas es controversial, debido a que la mayoría de pacientes se recupera sin tratamiento antimicrobiano especifico. El empleo de los mismo en el tratamiento de la enfermedad diarreica aguda causada por estos agentes esta indicado en los casos de enfermedad diarreica prolongada no autolimitada y en individuos inmunocomprometidos¹².

Por ser la multidrogorresistencia común en las cepas de Aeromonas aisladas de pacientes con procesos infecciosos intestinales y extraintestinales, realizar estudios de susceptibilidad antimicrobiana es una herramienta necesaria y valiosa para proveer una terapia exitosa¹³.

La sensibilidad de las cepas investigadas en este trabajo coincidió con los descritos en un estudio realizado en Barcelona, España, por Vila y colaboradores14 estudio que señala porcentajes de sensibilidad elevados en el género, frente a los aminoglucósidos gentamicina y amikacina. Resultados similares al nuestro obtienen Guglielmetti y colaboradores¹⁵, quienes en un estudio de susceptibilidad antimicrobiana realizado en cepas de Aeromonas aisladas de niños con EDA en Siena, Italia, muestra la sensibilidad de las mismas frente a las cefalosporinas de segunda y tercera generación, trimetoprim- sulfametoxazole, ácido nalidixico y norfloxacina. De igual forma en Guadalajara, España¹⁶, describen un número elevado de cepas de Aeromonas spp. aisladas de infecciones extraintestinales sensibles a gentamicina, amikacina, ciprofloxacina e imipenem. Sin embargo, frente a la ampicilina y la cefazolina los porcentajes de sensibilidad fueron inferiores.

Nuestros resultados coincidieron con los publicados por Goñi- Urriaza y colaboradores¹⁷, los que al señalar la resistencia de Aeromonas frente a las quinolonas aseveran la existencia de cepas resistentes al ácido nalidixico y susceptibles a la ciprofloxacina por un efecto de mutación del gen gyrA. De igual forma coincidimos con Ko y colaboradores¹⁸ quienes en Taiwán describen la existencia de cepas de Aeromonas aisladas de muestras clínicas con altos porcentajes de resistencia a las cefalosporinas de primera generación y el trimetoprim sulfametoxazol, que junto con la ampicilina resultaron los antimicrobianos que conformaron con mayor frecuencia los patrones de multirresistencia que se observaron en esta investigación. Según la bibliografía consultada, el fenómeno de la multirresistencia en las cepas de Aeromonas comienza a señalarse desde hace algunos años por varios autores¹³.

Las formas severas de infecciones intestinales y extraintestinales producidas por las especies del género Vibrio se solventan con una terapia antimicrobiana temprana y apropiada. Los estudios de susceptibilidad antimicrobiana en este género pueden efectuarse por las técnicas convencionales y las automatizadas. Algunas publicaciones hacen también referencia a la utilización del E-test¹⁹.

Bravo y colaboradores20 realizan un estudio de 10 años en Cuba sobre la susceptibilidad antimicrobiana de V. cholerae no-01 aislado de 422 pacientes con EDA, investigación que muestra resultados similares a los obtenidos en este trabajo con relación a los porcentajes de resistencia a la ampicilina (42,0%), tetraciclina (1,8%), sulfonamida (23%) y cloranfenicol (0%); la principal discrepancia entre ambos se observó con el porcentaje de resistencia al trimetoprim-sulfametoxazol la cual fue del 16,3%.

Mientras que, Junco y colaboradores21, al realizar una investigación en Cuba sobre la susceptibilidad antimicrobiana de cepas de V. cholerae no-01, de origen ambiental, observan que el 87% de las cepas eran sensibles al cloranfenicol, resultado similar al de este estudio.

Las infecciones intestinales provocadas por P. shigelloides son generalmente autolimitadas; los estudios de susceptibilidad antimicrobiana para esta especie se realizan con fines epidemiológicos, así como investigativos, justificándose la terapia antimicrobiana en los casos de diarreas prolongadas donde su efecto acorta la duración de las mismas y el periodo de eliminación del agente al medio²².

Wong y colaboradores, al determinar la susceptibilidad antimicrobiana a la ampicilina en 167 cepas de P. shigelloides aisladas de heces de pacientes con EDA en Honk Kong, describen un 72% de microorganismos resistentes²³, situación que difiere a la obtenida en la presente investigación. Al analizar el comportamiento de P. shigelloides frente a las cefalosporinas se observó que todas las cepas resultaron sensibles a la ceftriaxona, ceftazidima, cefoperazona, cefalotina, coincidiendo así con lo expresado por De Mondito y colaboradores²⁴ en un trabajo realizado en Río de Janeiro, Brasil, aunque su trabajo se realizó en cepas aisladas de muestras ambientales.

Ronald y colaboradores²⁵, realizan un balance quinquenal de la eficacia de los diferentes antimicrobianos utilizados en las infecciones gastrointestinales provocadas por miembros de la familia Enterobacteriaceae en Europa, resaltando la efectividad del imipenem y el meropenem, comportamiento similar se observó en las cepas de P. shigelloides identificadas en este trabajo. Los patrones de multirresistencia observados en este estudio muestran a las cefalosporinas, al trimetoprim-sulfametoxazol y a la ampicilina como los antimicrobianos más frecuentes dentro de los tres patrones de multirresistencia identificados, resultado que difiere del trabajo publicado por Bravo y colaboradores, quienes en el 2000, en Cuba, conducen un estudio en cepas de P. shigelloides aisladas de pacientes con enfermedad diarreica aguda, señalando que el patrón de multirresistencia por ellos identificado incluye también a la amikacina y la kanamicina, entre otros²⁶. Tampoco hubo correlación con los patrones de multirresistencia referidos por Clausell en Cuba, autor que describe patrones con una frecuente participación de la tetracilina²⁷.

Los resultados obtenidos en el presente estudio en relación al monitoreo de la resistencia antimicrobiana de estos géneros bacterianos, permitirán profundizar en el conocimiento de la terapéutica de la etiología bacteriana de la enfermedad diarreica aguda causada por los microorganismos pertenecientes a los géneros Aeromonas, Vibrio y Plesiomonas.

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