1. Sección de Lipidología. Instituto de Medicina Experimental.

2. ² Escuela de Enfermería. Facultad de Medicina. UCV.

Palabras Clave: Modificación LDL, Oxidación de LDL, Oxidación HDL, Oxidación fosfolípidos.

Key Words: Modified LDL, Oxidized LDL, Oxidized HDL, Oxidized phospholipids.

Investigaciones recientes sobre los factores de riesgo que podrían estar relacionados con la iniciación de la ateroesclerosis, han atribuido a las lipoproteínas de baja densidad (LDL) oxidadas, un papel relevante en la fisiopatología de la ateroesclerosis⁽¹⁾. La oxidación de las LDL es iniciada por radicales libres que sustraen un átomo de hidrógeno a un ácido graso poliinsaturado (AGPI)⁽²⁾. Las LDL oxidadas son captadas por receptores denominados "scavenger", los cuales no tienen mecanismo de control por retroalimentación ocurriendo una captación incontrolada de LDL, acumulación de colesterol en macrófagos, y formación de células espumosas, componentes de la placa ateromatosa⁽³⁾. Estudios recientes indican que las HDL pueden ser también modificadas por oxidación in vivo, lo cual disminuye su capacidad de promover el flujo de colesterol celular⁽⁴⁾, y pueden ser reconocidas y captadas por el mismo receptor "scavenger" de los macrófagos que capta las LDL modificadas, con la subsecuente acumulación de colesterol intracelular⁽⁵⁾. Por estas razones, entender los factores que determinan la susceptibilidad de oxidación de las lipoproteínas es esencial para desarrollar estrategias terapéuticas para inhibir este proceso. Siendo el objetivo del presente trabajo estudiar cuales son los AG de los fosfolípidos que se correlacionan con la susceptibilidad a la oxidación de las lipoproteínas LDL y HDL humanas.

Todos los reactivos y solventes empleados en este trabajo son de grado analítico y son productos químicos de Merck (Darsmstad, Germany) y Sigma Chemical Corporation (St. Louis, USA).

Las muestras de sangre de donantes voluntarios sanos (n = 13), normolipidémicos después de 14 horas de ayuno, fue colectada en tubos con 1 mg/mL de EDTA como anticoagulante. El plasma fue separado por centrifugación a 3000 x g por 15 min, a 4°C. Las lipoproteínas LDL (d = 1.019 - 1.063 g/mL) y HDL (d = 1.063 - 1.21 g/mL) fueron aisladas del plasma por ajuste de la densidad con KBr y sucesivas ultracentrifugaciones (40.000 rpm. por 24horas) según procedimiento descrito por Havel, et al⁽⁶⁾ en una ultracentrifuga Beckman L5 - 55, y desalinizadas por filtración a través de una columna Pharmacia PD - 10 empacada con Sephadex G - 25. La concentración de proteínas en las fracciones HDL y LDL fue determinada por el método de Shacterle y Pollack⁽⁷⁾, utilizándo albúmina bovina como estándar.

Las LDL y HDL fueron oxidadas in vitro con CuSO₄ por un periodo de 2,30 horas según el método propuesto por Thomas C, et al⁽⁸⁾. El grado de oxidación de las LDL y HDL fue cuantificado determinando la producción de sustancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico (TBARS), Kosugi H⁽⁹⁾. La cuantificación de TBARS, se realizó en comparación al estándar 1,1,3,3 tetrametoxipropano, y se expresó como nanomoles de malondialdehído por miligramo de proteína (nmoles MDA/mg proteína). Las lecturas fueron realizadas por duplicado.

Los lípidos totales de las LDL y HDL fueron extraídos por el método de Folch, Slees y Sloane⁽¹⁰⁾. Los fosfolípidos son separados por cromatografía de capa fina y transmetilados. Los metil ésteres de los ácidos grasos de los fosfolípidos son analizados por cromatografía de gas/líquido.

Los resultados son expresados como medias ± desviación estándar (± D.E.). Los análisis estadísticos se efectuaron con el programa Gpis y EXCEL de Windows 97 (Microsoft Corporation USA).

El grado de oxidación de las LDL y HDL (n = 13) incubadas por 2,30 horas a 37°C con CuSO₄ (10 µM) se determinó midiendo la formación de TBARS. Los resultados individuales (n = 13) se muestran en las tablas 1 y 2 .

La correlación entre el grado de oxidación de las diferentes fracciones de HDL y LDL con la relación de los porcentajes de los ácidos grasos insaturados de sus fosfolípidos respecto al ácido palmítico (C 16:0), se muestran en las tablas 3 y 4.

Según los resultados de las tablas 3 y 4, la producción de TBARS en ambas lipoproteínas HDL - LDL presentan una correlación positiva estadísticamente significativa con la relación del % de los ácidos grasos docosahexanoico (DHA)/palmítico. Además, se observa que la producción de TBARS en la LDL depende de la relación del % de ácido araquidónico/palmítico mientras que en la HDL de la relación eicopentanoico (EPA)/palmítico de los fosfolípidos. Esta diferencia de los ácidos grasos correlacionados con la producción de TBARS, sugiere que posiblemente existe una diferencia en la ubicación de los ácidos grasos poliinsaturados en los fosfolípidos de la HDL respecto a la LDL. Existen evidencias que el ácido araquidónico se encuentra ubicado en la posición Sn2 de los fosfolípidos de la LDL y que los lípidos biológicamente activos en las LDL oxidadas son fosfolípidos con ácido araquidónico peroxidado y con productos de fragmentación del ácido araquidónico⁽¹¹⁾. Sin embargo, los ácidos grasos de la HDL oxidada que puedan tener efectos biológicos, no han sido reportados. Además, no se observó ningún tipo de correlación estadísticamente significativa entre la producción de TBARS de las HDL y LDL con la relación de otros ácidos grasos.

Esto sugiere que la susceptibilidad de oxidación de las lipoproteínas HDL y LDL está correlacionada positivamente con la relación de ácidos grasos poliinsaturados con más de tres instauraciones respecto al ácido palmítico. Además la susceptibilidad de oxidación de las HDL humanas depende de su relación de ácidos grasos de la serie n - 3 (DHA- EPA)/ácido palmítico.

Trabajo financiado por el CDCH.