1. Sección de Investigaciones Cardio-Renales. I.M.E.-U.C.V. Caracas.

Los fantasmas de glóbulos rojos (FGR) humanos obtenidos de sujetos sanos muestran actividad de la Na⁺/K⁺-ATPasa de 1,68 ± 0,08 nmoles Pi/mg proteína x min (n=65; edad: 30 a 60 años). No hubo diferencias entre sexos, tampoco entre muestras obtenidas en ayuno o postprandiales. Comprobamos que la sangre debe mantenerse en frío (0°C) si no es procesada de inmediato. Obtenidos los FGR a 0°C, la actividad enzimática no varía entre el momento de la toma y las 4 h; pero si varía significativamente a las 24 y 48 h. Los FGR conservados a -40°C, mantienen la actividad por 48 h. En dos voluntarios sanos tratados con digoxina por una semana observamos una disminución en la actividad enzimática el primer día (17% y 22% del control, respectivamente). Los niveles de digoxina en suero no mostraron paralelismo con la actividad enzimática y fueron siempre menores de 0,7 ng/ml. Conclusión: Se dan las pautas metodológicas para obtener muestras útiles en clínica.

Palabras Clave: Actividad de Na/K-ATPasa, Digital, Fantasmas de glóbulos rojos humanos.

Red cell ghosts (RCG) obtained from humans (n=65; age: 30 a 60 years) showed a Na⁺/K⁺-ATPase activiy of 1,68 ± 0,08 nmoles Pi/mg proteína x min. There was no difference due to sex or between samples obtained during fast or after a normal meal. If the blood is not processed inmediately it has to be kept at 0°C. Once the RCG are obtained (0°C), the enzyme activity is mantained during 4 hours; however, it decreases significantly 24 or 48 hours later. The RCG stored at -40°C mantained the enzimatic activity during 48 hours. In two subjects receiving digoxin during one week we saw a decrease in the enzyme activity since the first day (17% and 22% less than control). There was no correlation between the plasma concentrations (always below 0,7 ng/ml) and the Na⁺/K⁺-ATPase activiy. Conclusion: we propose a clinically useful method to determinate the activity of the Na⁺/K⁺-ATPase in human red blood cells.

Key Words: Na/K ATPase activity, Digital, Human red cell ghost.

El seguimiento del paciente tratado con digoxina debe ser meticuloso debido al estrecho margen de seguridad de la droga y porque existe una diferencia en la respuesta que presentan los pacientes a una misma concentración plasmática. En este sentido, en nuestro laboratorio encontramos en cobayos (Cavia porcellus) un paralelismo entre la inhibición producida por la digoxina sobre Na⁺/K⁺-ATPasa en miocardio y en eritrocitos; entonces, se planteó que la inhibición medida en Fantasmas de Glóbulos Rojos (FGR) de pacientes tratados con esta droga podría utilizarse como una indicación más directa del efecto digitálico⁽¹⁾.

Matteucci, et al (1995), compararon métodos utilizados en los últimos 10 años para la obtención de FGR y encontraron gran variabilidad en cuanto a las condiciones de obtención y la actividad de la enzima⁽²⁾. Además, existen diferencias étnicas y escasa información en cuanto al efecto de la edad, el sexo y el estado de ayuno sobre este parámetro. Es por esto que nos planteamos como objetivo establecer las pautas para determinar la actividad de la Na⁺/K⁺-ATPasa en FGR.

Con 2 ml de sangre total heparinizada de pacientes sanos de ambos sexos y una edad comprendida entre 10 a 80 años se obtuvieron los FGR por dilución, centrifugación por gradiente y eliminación de la hemoglobina por hemólisis. La cantidad de proteínas se determinó por el método de Bradford modificado y la actividad enzimática se realizó por el método de Obando, et al 1987⁽³⁾. Los resultados se expresaron como nmoles de Pi liberados/mg de proteína x min.

En la Figura 1 se presentan los datos obtenidos cuando las muestras de sangre se mantuvieron a 0°C; y se midió a la actividad enzimática a las 0, 4 y 24 horas de obtenida la muestra. Se observó diferencia significativa entre las 0 y 24 horas. Por otro lado, al obtener los FGR y almacenarlos a -40°C, la actividad enzimática se mantuvo estable hasta por 48 horas. El valor promedio de actividad fue de 1,68 ± 0,08 nmoles de Pi/mg de proteína x minuto, el cual coincide con el reportado por otros autores^(4,5).

Se evaluó la actividad enzimática en sujetos de ambos sexos y en tres rangos de edad como lo muestra la Figura 2. No encontramos diferencias significativas entre estos grupos. Otro aspecto revisado fue si la condición de ayuno afectaba o no la actividad enzimática y encontramos que tampoco había diferencia significativa, como lo reportó Beutler, et al 1983⁽⁶⁾.

Dos sujetos de 40 y 27 años se sometieron a digitalización lenta por 8 días y se determinó la actividad enzimática por 5 días consecutivos y luego de retirado el tratamiento para evaluar el "lavado" del efecto. Las Figuras 3 y 4 muestran la respuesta de cada individuo. En el primer sujeto observamos una tendencia a la disminución de la actividad enzimática que no se relaciona con los niveles plasmáticos de digoxina. Luego de siete días de lavado la enzima no recupera el valor inicial de actividad. Por su parte, en el segundo sujeto, de 27 años, la inhibición de la actividad enzimática fue moderada (Figura 4); con la suspensión del tratamiento, el valor alcanzó los niveles control. Por último, se realizó la digitalización rápida en un voluntario sano de 50 años. En la Figura 5 observamos que en la primera hora, luego de la administración iv de 0,5 mg de digoxina hay un aumento de la concentración plasmática de la droga con una inhibición de la actividad enzimática del 71%. Luego de 0,5 mg vo durante dos días y de 0,25 mg/día por otros tres días, los niveles plasmáticos del fármaco disminuyen y encontramos que la actividad de la enzima se mantuvo baja, por lo menos durante 48 horas después de suspender el tratamiento.

Figura 1: Actividad de la Na+/K+-ATPasa a las 0, 4 y 24 horas de obtenida la muestra de sangre mantenida en hielo (n=15) *p<0,05 (entre el valor de 0 y 24 horas).

Los FGR han sido ampliamente estudiados en diferentes líneas de investigación y se han utilizado diversos métodos para determinar la actividad de la Na⁺/K⁺-ATPasa⁽²⁾; existe además información variada sobre como es afectada su actividad por ciertos parámetros. Es por esto, que definimos las condiciones de obtención de la muestra, la condición de los pacientes y la variación de la actividad enzimática en voluntarios sanos al administrar dosis usuales de digoxina.

Demostramos que con sólo 2 ml de sangre se puede obtener FGR donde se puede evaluar la actividad enzimática en un proceso rápido y pudiéndose desarrollar en un laboratorio clínico. Este método tiene una variabilidad entre 4 y 10%. Además, la condición ideal para realizar el procedimiento es una temperatura de 0°C y hacer la determinación de la actividad ATPásica en las primeras 4 horas luego de tomada la muestra de sangre total. Esto nos indica que en el caso de obtener la muestra fuera del laboratorio, debe transportarse en hielo para asegurar su conservación. En caso de no poder hacer la determinación de la actividad el mismo día, se debe por los menos obtener los fantasmas, los cuales se mantiene estables conservándolos -40°C.

Por otra parte, nuestros resultados muestran, a diferencia de otros autores^{(7, 8)} que ni la edad ni el sexo afectan el valor de actividad enzimática.

Se ha tratado de hacer evaluaciones de la Na⁺/K⁺-ATPasa comparando grupos control con grupos tratados con glicósidos cardíacos^(9,10). Sin embargo, nuestros resultados preliminares nos llevan a establecer, en cambio, que cada individuo debe ser considerado como su propio control para poder hacer el seguimiento del comportamiento de la actividad ATPásica durante el tratamiento con digoxina, esto junto a la evaluación clínica y electrocardiográfica permitirá un mayor control en la terapéutica con este fármaco.

Este trabajo fue realizado con la subvención del Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CDCH-UCV) Nº 334240-1998.