1. Cátedra de Bioquímica. Escuela Razetti. Sección de Biomembranas. IME. UCV.
2. Sección de Biomembranas. IME. UCV.
3. Cátedra de Patología General y Fisiopatología. Escuela Razetti. Sección de Biomembranas. IME. UCV.

Las membranas plasmáticas de músculo liso traqueal de bovino presentan una actividad de guanililciclasa dependiente de Mg²⁺, determinada utilizando radioinmunoensayo para GMPc, sobre la cual se estudio el efecto de la toxina pertussis. Se observó un comportamiento bimodal dependiente de la concentración de Mg²⁺: efecto estimulatorio hasta una concentración de Mg²⁺ 2 mM y efecto inhibitorio a concentraciones mayores del ión. El agonista carbamilcolina también mostró un efecto dual sobre esta actividad enzimática: estimulatorio hasta l0^-9 M e inhibitorio a concentraciones mayores. La toxina pertussis produce un efecto bloqueador de la guanililciclasa dependiente de Mg²⁺ y esto permite concluir que dicha actividad es modulada por proteína Go/Gi en forma similar a lo descrito previamente para la actividad guanililciclasa dependiente de Mg²⁺ en la misma fracción de membranas, pero en el caso de la actividad dependiente de Mg²⁺, aparentemente se requiere del componente inhibitorio de la proteína G para ejercer su función.

Palabras Clave: Guanilil ciclasa-Mg²⁺, Músculo liso traqueal, Toxina pertussis, Proteína G.

Plasma membranes from bovine tracheal smooth muscle show a Mg²⁺ dependent guanylyl cyclase activity, which was assayed using radioimmunoassay for cGMP and the effect of pertussis toxin on this cyclase activity was studied. Such enzymatic activity was dependent of Mg²⁺ concentration and reached a maximal activity at Mg²⁺ 2 mM,at higher Mg²⁺ concentration showed an inhibitory effect. The agonist carbamylcholine had a dual effect: stimulatory until 10^-9 M and inhibitory at higher concentration level. The pertussis toxin produces a blocking effect on Mg²⁺ dependent guanylyl cyclase, this fact permits to conclude that this enzymatic activity is modulated by a G protein Go/Gi in similar manner as guanylyl cyclase-Mn²⁺ but apparently for guanylyl cyclase-Mg²⁺ is required the presence of the inhibitor component of G protein.

Key Words: Guanylyl cyclase-Mg²⁺, Tracheal smooth muscle, Pertussis toxin, Go/Gi proteins.

El músculo liso traqueo bronquial de bovino (MLTB), es un sistema contráctil sin actividad rítmica ni automática. El proceso de contracción ocurre por estimulación del Sistema Nervioso Parasimpático y por mediadores químicos, que activan receptores muscarínicos, los cuales existen en una alta densidad en este músculo⁽¹⁾. La activación de estos receptores por agonistas muscarínicos produce aumento en los niveles de Guanosin monofosfato cíclico (GMPc), el cual como segundo mensajero, también ejerce un papel importante en el proceso de relajación de este músculo liso. El GMPc es el producto de la reacción de ciclización del sustrato GTP, catalizada por la guanilil ciclasa (GC) en presencia de un cofactor, catión divalente, el cual puede ser, entre otros, el Mn²⁺, el Mg²⁺ o ambos cationes simultáneamente⁽²⁾.

En el MLTB se ha estudiado en forma intensa la actividad GC dependiente del Mn²⁺ (GC-Mn²⁺)⁽³⁾. También en el MLTB, se ha demostrado la presencia de una actividad GC dependiente del Mg²⁺ (GC-Mg²⁺), la cual se ha caracterizado en los últimos años, analizando su posible regulación y cuyos resultados se han presentado parcialmente en comunicaciones previas⁽⁴⁾.

El objetivo del presente trabajo ha sido, conocer el efecto de la Toxina pertussis (PTX) sobre la GC dependiente del Mg²⁺, en la fracción P₂ obtenida del fraccionamiento sub celular citado en Materiales y Métodos, la cual está enriquecida en marcadores de membrana y posee la mayor actividad GC.

Los siguientes reactivos se adquirieron de las firmas Sigma Chemical Company: Fosfocreatina, creatina fosfo quinasa de músculo de conejo (Tipo I), Guanosina trifosfato (GTP), Guanosina 5´monofosfato (GMP), Ditiotreitol (DTT), etilendiamino tetraacetato (EDTA), Tris – hidroximetil amino metano, Lauril sulfato (SDS), Acido 3- (N-morfolino propano sulfónico (MOPS), Nicotinamida adenil dinucleótido (NAD+), Fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF), Albúmina de suero de bovino (BSA), Sacarosa. Merck (Alemania): Cloruro de sodio, Cloruro de magnesio, Cloruro de manganeso, el Reactivo de Folin Ciocalteau. Amersham (Inglaterra): el radioinmunoensayo para la determinación de GMPc, el líquido de centelleo ACS. List Laboratories INC (USA): Toxina pertussis. Todos los reactivos usados fueron de grado analítico.

Se usó el MLTB. Para la preparación de las fracciones sub celulares, se siguió el procedimiento descrito por Lippo de Becemberg, et al⁽⁵⁾.

La actividad guanilil ciclasa (EC 4.6.1.2) fue determinada según lo descrito por Lippo de Becemberg, et al 1982⁽⁶⁾, en presencia de MgCl_2, 2 mM y GTP 1 mM. La activacion de la toxina pertussis y las reacciones de ADP ribosilación se realizaron como lo describe Woolkalis, et al⁽⁷⁾ con algunas modificaciones. Así, en el momento de detener la reacción de ADP ribosilación, se hizo pasando la mezcla de reacción por una columna de Sephadex G 50-80. En el líquido de elución se determinó la actividad GC. El efecto que causa la toxina sobre la activación por el agonista Carbamil colina se determinó, agregando la concentración estudiada de este agonista a los medios de incubación para la determinación de la GC. La determinación del GMPc formado se hizo según el método de Steiner, et al⁽⁸⁾. La determinación de la concentración proteínas se hizo según el método de Lowry.

La actividad GC dependiente del Mg²⁺ fue analizada en presencia de este ión en un rango de concentración entre 0,05 mM y 5 mM y se encontró un comportamiento de tipo campana, con un efecto estimulatorio hasta 2 mM y un efecto inhibitorio a concentraciones mayores de este catión (Figura 1). Este comportamiento no varió en presencia de NaCl 154 mM (Datos no mostrados).

La actividad GC se determinó como se describe en Materiales y Métodos, en presencia de GTP 1 mM, a concentraciones de MgCl₂ entre 0 y 5 mM.

Cuando se estudió el efecto de la ADP ribosilación causada por la Toxina pertussis (PTX), sobre la actividad GC- Mg^2+, se observó una disminución de 50% de la actividad tanto en el efecto estimulatorio como en el inhibitorio como puede verse en la misma figura 1. Puede observarse además, que una muestra de P₂ sometida al tratamiento de pre activación pero que no se trata con PTX tiene un comportamiento similar a la GC de la P₂ nativa (Control PTX). El efecto del agonista CC sobre la GC-Mg²⁺ nativa, se estudio entre una concentración entre 10^-9 y 10^-5 M. Se observó un efecto dual estimulatorio hasta 10^-9 M e inhibitorio a concentraciones mayores de agonista (Figura 2). Al estudiar el efecto de la ADP ribosilación sobre la GC-Mg²⁺ modulada por el agonista CC, se encontró que la GC-Mg²⁺ tiene una muy pobre actividad a la concentración del máximo efecto de la CC, como puede verse en la misma figura 2.

La actividad GC se determinó como se indica en Materiales y Métodos con GTP 1 mM y MgCl₂ 2 mM. El efecto de la CC se estudió entre 10^-10 y 10^-5 M

DISCUSIÓN

Nuestros resultados de la actividad GC-Mg²⁺ son un hallazgo original en cuanto a haber obtenido una activación y una inhibición dependientes de la concentración del catión, las cuales no han sido citadas en la literatura. Esta actividad enzimática alcanza valores de alrededor del 15% cuando se compara con la actividad GC- Mn²⁺. Además tienen la importancia de observarse a concentraciones fisiológicas del Mg²⁺(1-5 mM). De la observación de los resultados analizados del efecto de la PTX puede concluirse que: la actividad GC particulada dependiente del Mg²⁺ del MLTB, es modulada por proteína Go/Gi, en forma similar a lo reportado para la actividad GC-Mn²⁺. En cuanto al efecto de la CC, el comportamiento dual observado es semejante, a los resultados descritos para la GC-Mn²⁺ del MLTB. Para esta ultima actividad, se ha postulado que está modulada por proteína G, la cual inhibe el efecto inhibitorio pero no, el estimulatorio. Además se sabe que existen dos tipos de receptores muscarínicos diferentes⁽⁹⁾. En relación a este último aspecto, para la GC-Mg²⁺, podría pensarse, que el componente estimulatorio requeriría de la presencia del componente inhibitorio para ejercer su función. Esta apreciación deberá ser sometida a próximas investigaciones.

De nuestros resultados, al tratar nuestras preparaciones con PTX se puede concluir un efecto modulador a través de proteínas Go/Gi. Si bien el efecto inhibitorio tanto en el caso del efecto del Mg²⁺ como en el del efecto de la CC, se ve afectado por la ADP ribosilación, también se observa, a diferencia de lo observado para la GC-Mn²⁺ que se afecta el componente estimulatorio.

Financiado por proyecto CDCH 09.33.3276-94.