1. Sección de Biomembranas. Instituto de Medicina Experimental. Facultad de Medicina. Universidad Central de Venezuela. Caracas.

Se estudió el papel que pueden ejercer los diferentes intermediarios glicolíticos sobre la regulación de la V-ATPasa presente en las membranas plasmáticas del músculo liso traqueobronquial de bovino. Las fracciones de membrana (P₁) obtenidas se sometieron a una extracción con KCl siguiendo la metodología descrita en nuestro laboratorio. La actividad de ATPasa fue cuantificada mediante la determinación del Pi liberado, como ha sido descrito previamente. Al medio de incubación se añadió en ausencia de KCl los compuestos: 3-Fosfoglicerato (3-FG); 2-Fosfoglicerato (2-FG); Gliceraldehido-3-Fosfato; Glicerol-3-Fosfato y el Fosfato de Dihidróxiacetona. Los resultados indican que la posición del grupo fosfato en la estructura de la triosa es fundamental para estimular la actividad ATP ásica, siendo la concentración de 3-Fosfoglicerato (0.1 mM) la que produjo mayor estimulación, la cual ocurre a través de una V-ATPasa debido a que fue inhibida por la Bafilomicina A₁ 100 nM.

Palabras Clave: V-ATPasa, Glicólisis, Músculo liso, Membrana plasmática.

ABSTRACT:

The effects of different glycolytic intermediates were evaluated for V-ATPase activity associated with a plasma membrane fraction isolated from tracheal smooth muscle. Plasma membranes were prepared and extracted with KCl following a technique described in our laboratory. V-ATPase activity was assayed by quantities of Pi released as previously described.

In the absence of KCl, the following compounds were assayed: 3-phosphoglycerate (3-PG), 2-phosphoglycerate (2-PG), 3-phosphoglyceraldehyde, glycerol-3-phosphate and dihidroxyacetone phosphate. Our results showed that a phosphate group in 3-position of triose carbon structure is crucial for V-ATPase stimulation. In this sense, (0.1 mM 3-PG) showed the maximal activation being sensitive to Bafilomycin A₁ indicating the V-ATPase involvement.

Key Words: V-ATPase, Glycolytic intermediates, Plasma membranes, Smooth muscle.

Las V-ATPasas pertenecen a una familia de enzimas que funcionan como una bomba de protones dependiente de ATP, con diferentes estructuras y funciones. Ellas son complejos multiméricos compuestos de multisubunidades diferentes en el sector catalítico y de membrana, que integran los dos dominios funcionales el V1 y el Vo. El sector V1 contiene sitios de enlaces al ATP, dicho sector está unido al sector de membrana denominado Vo por un bulbo central donde ocurre la interacción entre los dos sectores los cuales funcionan perfectamente acoplados^(1-2). Están presentes en Archaebacterias y en el sistema vacuolar de células eucariotas, son sensibles al inhibidor específico Bafilomicina A1 y funcionan sin intermediario fosforilado. Ellas son responsables de la acidificación de compartimentos intracelulares en células eucariotas y energizan una gran variedad de organelas y membranas⁽³⁾. En estudios realizados en la sección de Biomembranas, se ha caracterizado bioquímicamente la actividad de una Mg²⁺ -ATPasa, presente en la membrana plasmática del músculo liso traqueobronquial de bovino⁽⁴⁾. Teniendo en cuenta el comportamiento frente a inhibidores específicos, se demostró que se trataba de una V-ATPasa, la cual es estimulada por ion cloruro (Cl^-) a un pH óptimo entre 6.9-7.0. Indirectamente se demostró que esta V-ATPasa debe estar asociada a una bomba de protones (H⁺), la cual envía protones desde el interior celular hacia el medio extra celular, para mantener el pH en rango fisiológico después de la activación metabólica celular. Poco se sabe del papel y de la regulación de esta V-ATPasa en estas células, Pacheco, et al⁽⁵⁾ propusieron que esta V-ATPasa puede participar en el transporte impulsado de cloruros desde el interior celular hacia el medio extracelular. Simultáneamente la hidrólisis de ATP genera grandes cantidades de ADP que es capaz de estimular la glicólisis. En este sentido decidimos evaluar el efecto de los diferentes metabolitos de la glicólisis sobre la regulación de la V-ATPasa presente en el músculo liso de las vías aéreas.

Se realizó el fraccionamiento subcelular del músculo liso traqueobronquial de bovino, siguiendo el procedimiento descrito por Alfonzo, et al^(6-7). Las fracciones P1 se sometieron a una extracción bajo agitación a 4ºC, durante una hora con un medio que contenía KCl 0,6 M (solo el control), TRIS-HCl 20 mM (pH = 7.2), sacarosa 0,3 M, DTT 0,5 mM a fin de remover proteínas periféricas. Luego se centrifugó a 150.000 x g durante 30 min. El sedimento fue lavado dos veces con un buffer que contiene: Sacarosa 0,3 M, DTT 0,5 mM, y TRIS-MES 20 mM (pH = 7.2) con el objeto de remover trazas de KCl y fue suspendido en un pequeño volumen del último buffer (~1 ml).

La determinación de la actividad ATPásica, se realizó en un medio que contenía a concentración final: TRIS-MES 30 mM (pH = 6,8), MgCl₂ 5 mM, y ATP 5 mM. A este medio de incubación se añadió (en ausencia de KCl) los compuestos cuyo efecto se quiere estudiar: 3 - Fosfoglicerato (3-FG); 2-Fosfoglicerato (2-FG); Gliceraldehido -3- Fosfato; Glicerol -3- Fosfato y el Fosfato de Dihidróxiacetona. El volumen final del ensayo fue de 1 ml. La reacción se inició agregando entre 25 - 50 µg de proteínas, se incubó a 37ºC durante 1 minuto y se termina al añadir 0.1 ml a 4ºC de Tricloroacético al 50%.

La actividad enzimática de la V-ATPasa fue cuantificada por medir la cantidad de fósforo liberado (Pi). Para ello se usó el procedimiento de Fiske-Subarrow⁽⁸⁾, modificado en cuanto a tiempo y temperatura por Alfonzo, et al en 1981.

Al estudiar los efectos de los intermediarios glicolíticos sobre la V-ATPasa, se puede observar en los datos del Fosfato de Dihidroxiacetona (Tabla 1), que este metabolito provocó un estímulo del 13% en la actividad ATP ásica a la concentración de 2.5 mM. Por otra parte en la Figura 1, observamos el efecto del Gliceraldehido -3- Fosfato (G-3F), donde se obtuvo un estímulo en la actividad ATP ásica del 20% a la concentración en G-3F = 0.5 mM. Luego en la Figura 2, podemos observar el efecto del 3-Fosfoglicerato sobre la V-ATPasa, donde se obtuvo un estímulo del 30% en la actividad ATP ásica a la concentración de 3-FG = 0.1 mM. Dicha estimulación ocurre a través de la V-ATPasa porque fue inhibida en presencia de 100 nM de Bafilomicina A1. Tanto el Glicerol-3-Fosfato como el 2-Fosfoglicerato no tuvieron ningún efecto en la actividad ATP ásica en las concentraciones estudiadas (datos no mostrados).

Estos resultados sugieren que los metabolitos de la glicólisis pueden ejercer un efecto modulador sobre la V-ATPasa, donde el efecto del 3-Fosfoglicerato a la concentración 0.1 mM parece ser específico, por ser el único capaz de estimular a esta baja concentración.

En el ámbito molecular se puede especular que se necesitan ciertos requerimientos químicos de estas triosas para poder estimular a la V-ATPasa, como son: la posición de los grupos funcionales (aldehido, carboxilato, etc), debe estar apropiadamente alejada del grupo fosfato; y la ubicación del grupo fosfato en posición 3, parece ser de primordial importancia.

Al analizar los experimentos se puede concluir, que la posición del grupo fosfato en la estructura de la triosa es fundamental en la posición 3 de la cadena carbonada para provocar estímulo en la actividad ATP ásica; y además debe existir una carga parcial negativa en los grupos funcionales unidos al carbono⁽¹⁾ para poder estimular a la V-ATPasa.

Este trabajo fue financiado por proyecto CDCH # 09-33-4259-2000.