Las estatinas afectan la viabilidad de líneas celulares de leucemia y linfoma humanas in vitro

CORRESPONDENCIA: Dr. Juan B. De Sanctis. Instituto de Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad Central de Venezuela.

RESUMEN: Se ha propuesto que las estatinas inducen apoptosis sobre células tumorales. Para probar dicha hipótesis, se analizó el efecto de las estatinas atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pravastatina y simvastatina en el rango de concentraciones de 1 pM hasta 100 μM, sobre la viabilidad de las líneas celulares humanas Jurkat E6.1, Jurkat D1.1 (Linfoma T) , Daudi (Linfoma B), U937 (leucemia monocítica) y HL-60 (leucemia promielomonocítica) in vitro en cultivos de 48 horas, analizados por la técnica de hidrolización del compuesto bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilltetrazolio (MTT). Lovastatina y mevastatina son los más potentes inductores de muerte celular independientemente del tipo celular (Ic 50 entre 12 y 50 μM). Para las otras estatinas se observan diferencias en el Ic50 según la línea celular atorvastatina (38,1 y 48,6 μM Jurkats, 55,3 μM Daudi y 100 μM para las otras líneas), pravastatina (25 μM HL-60, 55,6 y 60,7 μM Jurkats y ≥ 100 μM Daudi y U937), simvastatina (25,1 μM Jurkat D1.1, 50,2 μM Jurkat E6.1, 45,2 μM Daudi y 51,3 μM HL-60, y > 100 μM U937) y para fluvastatina en todos los casos > 100 μM. La disminución de la viabilidad celular se revierte completamente cuando las células son incubadas con 10 μM mevalonato. Se concluye que la lovastatina y mevastatina son las más potentes inductoras de muerte seguida por atorvastatina, pravastatina y simvastatina cuyo efecto depende del tipo de línea celular y la fluvastatina no tiene efectos importantes en la viabilidad de las líneas celulares estudiadas.

La viabilidad celular fue determinada por el ensayo del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5-difenilltetrazolio (MTT) como fue descrito por Mosmann⁽¹¹⁾ y modificada por nuestro laboratorio⁽¹²⁾. El ensayo del MTT se fundamenta en la reducción de la sal de tetrazolio, MTT, por las células viables. Las deshidrogenadas usando NADH o NADPH como coenzimas pueden convertir la forma amarilla de la sal del MTT (soluble en agua) a cristales insolubles de formazan de color púrpura. Después de las 48 horas de incubación con las estatinas, las células fueron incubadas por 4 horas con 50 μl de MTT (0,4 mg/mL en PBS). Posteriormente, las placas son centrifugadas a 1 000 x g por diez minutos, las células lavadas con PBS, centrifugadas y los cristales de formazán son resuspendidos en DMSO. La solución de formazan fue leída espectrofotométricamente a 570 nm. Se realiza con cada ensayo una curva patrón con diferentes concentraciones de células incubadas con MTT. Los resultados fueron expresados como la media ± desviación estándar de viabilidad. La reducción en un 50 % del número de células en relación con los controles (IC₅₀₎ fue determinada de las curvas dosis respuesta usando el programa Graph Pad Prism 4.0.

La Tabla 1 ilustra el efecto de las diferentes estatinas sobre la viabilidad de las diferentes líneas celulares. Los valores de Ic50 fueron calculados para cada fármaco en base a curvas de 12 puntos de concentraciones crecientes desde 1 pM hasta 100 μM (0, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50, 75, 100 μM). Los valores obtenidos son graficados y analizados por la curva matemática no lineal del programa Graph Pad Prism 4 para determinar los Ic50.

A pesar de que las células Jurkat provienen del mismo linaje, hay diferencias importantes en el Ic50 sobre todo cuando las células son tratadas con simvastatina. En el caso de U937 y HL60, estas últimas parecen ser más susceptibles al efecto de la estatina, excepto por lovastatina. Finalmente, las células más resistentes al tratamiento con estatinas son las células Daudi.

En la Figura 1 se ilustra el porcentaje de viabilidad de las diferentes líneas celulares, analizado por el ensayo de MTT, en la concentración más alta de cada una de las estatinas (100 μM). Se observa claramente el efecto de las diferentes estatinas sobre la viabilidad celular de las líneas celulares estudiadas. El efecto de las estatinas sobre la disminución de la viabilidad se puede resumir en mevastatina>lovastatina>simvastatin a>pravastatina=atorvastatina. La fluvastatina no inhibe significativamente la viabilidad celular en la dosis más alta. La concentración de 100 μM corresponde a por lo menos 20 veces la concentración plasmática terapéutica que se observa con dosis de 40 mg vía oral.

Cuando el mevalonato, producto de la reacción de la enzima hidroximetil glutaril coA reductasa, es añadido al cultivo con las estatinas, se observa in incremento en los IC 50 que está representado en la Tabla 2. Mevastatina, En la Tabla 2 se representa el efecto potenciador del mevalonato en todas las curvas correspondientes a las estatinas usadas y representadas en la Tabla 1. En todas las estatinas excepto en la fluvastatina, el mevalonato revierte el efecto inhibidor de la viabilidad celular ilustrado en la Tabla 1. es sin embargo, la única estatina que tiene un efecto moderado sobre la viabilidad de tres tipos celulares.

es capaz de generar una disminución en la viabilidad celular en la mayoría de las células estudiadas a diferencia de las otras estatinas. Lovastatina tiene un comportamiento semejante, pero no tan eficiente y luego simvastatina, pravastatina, atorvastatina tienen menor efecto. Finalmente, la fluvastatina a las dosis ensayadas no afecta la viabilidad celular.

También es interesante analizar el efecto de las diferentes estatinas sobre células provenientes de un solo linaje. Es probable que las estatinas induzcan una respuesta diferente entre células tumorales primarias o las metastásicas según lo sugieren varios autores como lo exponen Hindler y col. ⁽²⁾.

Dado que efecto de las estatinas se revierte con mevalonato, se podría sugerir que las células tumorales in vitro pudieran tener la capacidad de escapar de la inhibición de las estatinas. Varios investigadores han sugerido que las estatinas pudieran tener un efecto sinérgico con otros fármacos antineoplásicos sobre la viabilidad celular ^(2-4); sin embargo, en muchos casos los mecanismos de acción no están dilucidados del todo. A la par, conocen estudios detallados a gran escala, controlados doble ciego, que permita establecer el posible papel de dichas drogas como coadyuvante en el tratamiento antineoplásico. Se presume que estos fármacos pudieran tener un efecto más amplio debido a que las estatinas, dependiendo de las dosis, pueden: 1) inducir una disminución del crecimiento tumoral, por inhibición de la activación de Ras y Rho y la activación de p21 y p27 inhibidoras de la proliferación celular, 2) la activación de caspasa 3, 7, 8, y 9 junto con una disminución de bcl-2, 3) la inhibición de E-selectina y metaloproteinasa 9 en metástasis. Los resultados aquí presentados permitieran sugerir que dependiendo de la estatina, la dosis, los metabolitos y el tipo tumoral se podría observar algunos de los efectos propuestos por estos fármacos. Por ello, se concluye que estudios ulteriores son necesarios para poder evaluar el papel de las estatinas en el tratamiento antineoplásico.

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