Electroforesis de campo eléctrico pulsado en la tipificación molecular de cepas aisladas de un brote de Salmonelosis ocasionado por consumo de queso contaminado con Salmonella Javiana

 Elsa S Toro†¹, Astrid O Miró², Carmen I Ugarte¹ Francisco J Larrea³

1 Departamento de Bacteriología/ División de Diagnóstico/ Gerencia Sectorial de Diagnóstico y Vigilancia Epidemiológica. Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”, Apdo. 60412, Oficina del Este, Ciudad Universitaria. Los Chaguaramos. Caracas. toroaraujo@yahoo.es .

2 Departamento de Microbiología de Alimentos/ División de Control de Alimentos/ Gerencia Sectorial de Registro y Control. Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”, Apdo. 60412, Oficina del Este, Ciudad Universitaria. Los Chaguaramos. Caracas. astridmiro@yahoo.es, amiro@inhrr.gob.ve.

3  Ministerio del Poder Popular para la Salud, Dirección de Epidemiología y Análisis Estratégico. Dirección de Vigilancia Epidemiológica. Caracas.

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue confirmar por Electroforesis de Campo Electrico Pulsado (PFGE) que la Salmonella aislada del alimento implicado en el brote (queso blanco) fue la responsable del evento.La muestra de queso blanco presento elevado recuento de coliformes, E. coli y S. aureus,ademas, presencia de Salmo nella spp., lo que indico condiciones sanitarias inadecuadas y posible contaminacion de origen fecal. Para la confirmacion de las cepas sospechosas de Sal monella spp, aisladas de los pacientes y del alimento, se utilizaron tecnicas bioquimicas  convencionales, la serotipificacion se realizo siguiendo el esquema de White-kauffmann-LeMinor y la sensibilidad a los antimicrobianos (Ampicilina, Trimetroprim-Sulfametoxazole, Ciprofloxacina, Amoxicilina, Ac.Clavulanico, Cloranfenicol, Ceftriaxone y Tetraciclina) por la tecnica kirby-Bauer. Las cepas bacterianas de Salmonella spp aisladas fueron identificadas como Salmonella Javiana [1,9,12:l, z28:1,5] y resultaron sensibles a todos los antibioticos probados.La Tipificacion Molecular de las cepas, se realizo por PFGE, se gun protocolo estandarizado de PulseNet para Salmonella y el analisis de los patrones se estudio utilizando el programa BioNumerics, version 4.0, lo cual mostro que los aisla dos de Salmonella Javiana procedentes tanto de pacientes como del alimento tenian identico patron de restriccion, en tamano y numero de fragmentos. La ocurrencia de un patron unico de PFGE (Coeficiente de similitud 100%) entre los aislados permitio demostrar que el queso contaminado con Salmonella Javiana fue el responsable del brote familiar.

Key words: Salmonella Javiana, molecular subtyping, pulse field gel electrophoresis, molecular epidemiology, food-borne disease, salmonellosis.

Pulse Field Gel Electrophoresis in molecular typification of strains isolated from a Salmonellosis outbreak caused by consumption of Salmonella Javiana contaminated cheese

ABSTRACT

The aim of this work was confirmation through Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) that Salmonella isolated from the food implicated in the outbreak (white cheese) was responsible for the event. The white cheese sample showed a high count of Coli orms,f E. coli and S. aureus. Moreover, Salmonella was pre ent,s which indicated inadequate sanitary conditions and possible fecal contamination. The suspected Salmonella strains isolated from patients and the food sample, were confirmed using conventional biochemical techniques, serotyping according to the White-kauffmann-Le Minor scheme and antibiotics sensibility (Am picillin, Trimetroprim-Sulfametoxazole, Ciprofloxacin, Amoxicillin, Clavulanic Acid, Cloranfenicol, Ceftriaxone and tetraciclin) following kirby-Bauer’s technique. The Salmonella strains were identified as Salmonella Javiana [1,9,12:I, z28:1,5]and were sensitive to all the antibiotics tested. The molecular typing of the strains was performed using PFGE, according to the PulseNet standardized protocol for Salmonella. The pattern analysis was studied using Bionunella merics program, version 4.0, which showed that the Sal monella Javiana isolates from patients as the food sample had an identical restriction pattern in size and fragments number. The incidence of a unique pattern of PFGE (similarity coefficient 100%) between isolates demonstrated that the cheese contaminated with Salmonella Javiana was responsible for the family outbreak.

Palabras clave: Salmonella Javiana, tipificación molecular, electroforesis en campo eléctrico pulsado, epidemiología molecular, enfermedad transmitida por alimentos, Salmonelosis.

INTRODUCCIÓN

Salmonella spp es un patógeno importante como agente causal de enfermedades de transmisión alimentaria, puede encontrarse como flora intestinal de aves, reptiles y mamíferos. Se propaga a los seres humanos a través del consumo de alimentos contaminados tales como carnes crudas, pollo, huevos, leche y derivados lácteos, pescados y mariscos, productos de origen vegetal como berros, semillas germinadas, jugos de naranja y manzana no pasteurizados. Característicamente la enfermedad salmonelosis–ocasionada por especies de Salmonella diferentes a S. Typhi, se presenta con dolores y calambres abdominales, diarrea, escalofríos, fiebre, nauseas, vómitos y malestar general 12 a 72 horas después de la infección, la duración de los síntomas normalmente es de 4 a 7 días, en personas débiles con problemas inmunológicos subyacentes, la bacteria puede invadir el torrente sanguíneo y causar infecciones que ponen en peligro la vida.

 En la investigación de brotes de enfermedad transmitida por alimentos (ETA) resulta difícil relacionar los aislados de origen humano, de alimentos y de ambiente por técnicas fenotípicas convencionales de tipificación. El uso de métodos de tipificación molecular se inició en 1980 con el desarrollo de métodos simples de aislamiento de ADN bacteriano y uso de enzimas de restricción. La separación de los fragmentos generados en base al ta-maño “Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis” (RFLP), por electroforesis en gel de agarosa, da lugar a patrones de restricción de ADN característicos para un subtipo particular. Estos métodos tienen mayor poder discriminatorio que los convencionales y han sido empleados con éxito en investigaciones epidemiológicas de brotes de ETA originados por consumo de alimentos contaminados con patógenos como E. coli 0157:H7 (1,2,), Salmonella spp (3, 4, 5), Listeria monocyogenest (6). La técnica de PFGE es considerada actualmente el “gold standard” de los métodos de tipificación molecular (7). El objetivo de este trabajo es confirmar por PFGE que la Salmonella aislada del alimento implicado (queso blanco) ocasiono el brote estudiado.

 MATERIALES Y MéTODOS UTILIZADOS

 Para efectos de Vigilancia Epidemiológica se considera un brote a un episodio en el cual dos o más personas presentan una enfermedad similar después de ingerir alimentos, incluida el agua, del mismo origen y donde la evidencia epidemiológica o el análisis de laboratorio implica a los alimentos o al agua como vehículos de la misma. Cuando este evento ocurre entre personas convivientes se denomina Brote Familiar de ETA.

 Características del Brote: Se inicia el 28-05-05 en el sector Los Pilones, Población de Urraca, Municipio Uracoa, del Estado Monagas, se involucraron 7 personas (2 niños, 3 adultos y 2 ancianos) de un mismo grupo familiar, quienes presentaron un cuadro clínico caracterizado por: fiebre, diarrea, vómitos, dolor abdominal y cealea;f con un período de incubación promedio de 11 horas (7 a 14 horas) posterior al consumo del alimento sospechoso: queso blanco criollo, el cual fue consumido en el hogar de las personas afectadas. El reporte de la ETA fue realizado el 29 de mayo por el Hospital tipo I Uracoa. La muestra del alimento implicado y las cepas aisladas de los pacientes afectados fueron remitidas a los De partamentos de Microbiologia y quimica de Alimen tos, y Bacteriologia, respectivamente, del Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel” para los analisis correspondientes.

Análisis del queso blanco: Para evaluar la calidad sanitaria y detectar presencia de posibles agentes patogenos,se realizaron analisis siguiendo la Norma Venezolana COVENIN correspondiente senalada en cada caso: Recuento de coliformes y de Escherichia coli, como indicadores de calidad higienica y posible contaminacion de origen fecal (No 3276-97 ), Recuentos de Staphylococcus aureus (No 1292-89) y Bacillus cereus (No 1644-93), deteccion de Salmonella spp ( No 1282-89), determinacion de cloruros (No 369-82) y acidez (No 658-97). La determinacion de enterotoxinas estafilococcicas (A-B-C-D) se realizo utilizando el kit RPLA-OXOID y la presencia de sustancias conservadoras siguiendo la metodologia recomendada JAOAC, vol. 52, No 4, 1969.

Análisis de las cepas bacterianas: La confirmacion de 6 cepas sospechosas de Salmonella spp, aisladas de coprocultivos de pacientes involucrados en el brote y 1 cepa de Salmonella spp. aislada de queso blanco criollo, fue realizada, por tecnicas bioquimicas convencionales (8). La serotipificacion de los aislados fue realizada en base a reacciones de aglutinacion entre antigenos somaticos O y flagelares H de fase I y II con antisueros especificos (Difco Laboratorios. Detroit. Mi chigan), siguiendo el esquema de White-kauffmann-Le Minor (9). La sensibilidad a los antimicrobianos recomendados para este tipo de microorganismo fue realizada por kirby-Bauer, tecnica de difusión en agar Mueller-Hinton, siguiendo los criterios de interpretacion de la CLSI (Clinical and La boratory Standards Institute 2005) (10).

Tipificación Molecular de las cepas: Se realizo por Electroforesis de Campo Electrico Pulsado (PFGE), se gun pro tocolo estandarizado de PulseNet para Salmonella (11).

Preparación de ADN genómico: Colonias aisladas de cada una de las cepas del brote y de la cepa de referencia fueron crecidas en agar tripticasa de soya durante 24 horas, se preparo una suspension de las celulas en buffer (EDTA 100 mM, Tris 100 mM, pH 8.0), a 20% de tra mitancia en el colorimetro Vitek de BioMeriux, 200 μl de esta suspension bacteriana fueron mezclados con 200 μl de agarosa Seakem Gold de alta resolucion 1%: SDS al 1% en buffer TE y se agregaron 10 μl de proteinasa k (20mg/ml), doscientos microlitros de la mezcla fueron distribuidos con una pipeta en moldes desechables (Bio-Rad laboratorios).

La lisis celular “in situ” fue realizada colocando los bloques de agarosa solidificados en tubos que contenian 5 ml de buffer de lisis (Tris50 mM :EDTA 50 mM, pH 8,Sarcosyl 1%) y 25 μl de proteinasa k (20 mg/ml) e incubados en un baño de agua con agitacion a 54 ºC por 2 h.

Seguidamente los bloques fueron lavados para eliminar los restos celulares, dos veces con agua esteril ultrapura a 50 ºC y ocho veces con TE (Tris10 mM-EDTA 1mM,pH 8) a 50 ºC, durante 15 minutos en baño de agua con agitacion a 50 ºC, quedando el ADN embebido en la agarosa, listo para tratamiento con enzimas de restriccion.

Digestión del ADN con la enzima Xba I: Se realizo en segmentos de bloques de agarosa de 2.0 milimetros con 30 U de la enzima, siguiendo las recomendaciones del fabricante, durante 2 h a 37 ºC. Los bloques digeridos fue ron colocados en un gel de agarose Seakem Gold al 1% en TBE 0,5X (Tris-borato-EDTA, pH 8) y la electroforesis fue realizada utilizando buffer TBE 0,5X, bajo las siguientes condiciones: tiempo inicial 2,2 segundos, tiempo final 63,8 segundos, angulo de 120o, temperatura de 14 ºC, voltaje 6V/cm, con un tiempo total de corrida de 19 ho ras a 14ºC (equipo CHEF-DR III System, Bio Rad). El gel fue tenido con bromuro de etidio (0,001 mg/ml) durante 30 minutos y lavado 6 veces con agua destilada en agitacion suave durante 30 minutos cada vez. La imagen del gel en formato tiff fue obtenida utilizando un equipo de  fotodocumentacion (Gel Doc. Bio-Rad) con luz ultravioleta.

Análisis de los datos: El analisis de los patrones de PFGE fue realizado utilizando el programa computarizado de analisis BioNumerics version 4.0 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium) (12). La cepa de Salmonella Braenderup H9812 fue utilizada como estandar de referencia para normalizar el gel (13). Las bandas fueron asignadas manualmente, el coeficiente de similitud de Dice fue aplicado para comparar los patrones de macrorestriccion.

Para visualizar mejor la relacion existente entre los aislados se construyo un dendograma em pleando el metodo de los promedios aritmeticos no pon derados (UPGMA unweighted pair group method with arithmetic averages) utilizando un parametro de optimizacion de 1,5% y 1,5% de tolerancia en la posicion de las bandas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

 La muestra de queso blanco presentó características organolépticas normales, se obtuvo elevado recuento de coliformes (1,7 x 106 ufc/g) y de Escherichia coli (más de 1,5 x 106 ufc/g), presencia de Salmonella spp, elevado recuento de S. aureus (3,3 x 106 ufc/g) y no se logró demostrar la presencia de enterotoxinas estafilococcicas A,B,C,D. No se detectó presencia de B .cereus. (Menos de 1,0 x 102 ufc/g).

No se encontró presencia de sustancias conservadoras, los valores obtenidos de cloruro de sodio (1,61 g/100g) y acidez (8,93 ml de NaOH 1N/100g, 0,80 g acidolactico/100g) están dentro de los límites normales establecidos para este tipo de productos según Norma Venezolana COVENIN Nº 3821-03 “queso Blanco”.

La presencia de Coliformes en el queso blanco revela inadecuadas condiciones a las cuales pudo estar ex puesto el alimento, insuficiencia en la pasteurización de la leche o ausencia de la misma, contaminación durante o luego del proceso de elaboración. Los elevados niveles de Escherichia coli indican posible contaminación de origen fecal. Varios autores señalan que el alto valor de S. aureus está relacionado con la concentración inicial del microorganismo en la leche utilizada para la elaboración del queso, fallas en la actividad de los cultivos lácticos utilizados (en caso de ser agregados) e inadecuadas con diciones sanitarias durante la elaboración y comercialización del producto, la cantidad de S. aureus encontrada en el queso blanco representa un riesgo para los consumidores por la posible producción de en terotoxinas (14).

En quesos blancos fabricados en el País se ha reportado una incidencia de Salmonella spp de 2,1% (14), la presencia de este microorganismo no se permite en alimentos para consumo humano, según lo establecido en las Normas Venezolanas COVENIN y la ICMSF. Estos resultados indican calidad higiénica deficiente del alimento y riesgo para la salud de los consumidores por la presencia de estos patógenos.

Las cepas bacterianas de Salmonella spp aisladas de pacientes y del alimento implicado en el brote fueron dentificadas por métodos convencionales como Salmone la Javiana [1,9,12:l, z28:1,5] y resultaron sensibles a todos los antibióticos utilizados (Ampicilina, Trimetro-prim-Sulfametoxazole, Ciprofloxacina, Amoxicilina, Ac. Clavulánico, Cloranfenicol, Ceftriaxone y Tetraciclina).

 La tipificación molecular de las cepas por PFGE mostró que los aislados de Salmonella Javiana procedentes tanto de pacientes como del alimento tenían idéntico patrón de restricción, en tamaño y número de fragmentos (Figura 1).

 Figura 1: Electroforesis de Campo Eléctrico Pulsado (PFGE) del ADN cromosomal de las cepas de Salmonella Javiana aisladas de pacientes (casos) y del alimento implicado (queso blanco), digeridos con la endonucleasa de restricción Xba I. Cepas de casos brote familiar de ETA; carriles 2, 3, 4, 6, 7 y 8. En los carriles 9, 11, 12, 13 se observan aislados analizados en este gel que corresponden a otros brotes. Cepa de Queso blanco (alimento) brote familiar, carril 14. Marcador “universal” de Referencia Salmonella Braenderup (H9812) digerida con XbaI, carriles 1, 5, 10, 15.

 La ocurrencia de un patrón único (Coeficiente de similitud 100%) de PFGE entre los aislados del alimento implicado y los aislados de pacientes permitió demostrar que el queso contaminado con Salmonella Javiana fue el responsable del brote familiar (Figura 2), brotes de ETA causados por este serovar también fue reportado por George Harvey y col (1998)(3).

 Durante la investigación del brote se evidenciaron algunas limitaciones del Sistema de Vigilancia de las ETA no pudiéndose identificar los factores que contribuyeron a la pérdida de la inocuidad del alimento, la fuente de infección, ni otros casos que pudieran estar asociados al consumo del queso. Este brote ejemplariza la necesidad de incluir dentro del sistema de vigilancia de las ETA, la investigación de patógenos que pueden utilizar alimentos como vehículos de transmisión, de ahí la importancia del desarrollo de una red de laboratorios de bacteriología integrados a la red de subtipificación molecular, como parte de la red de vigilancia nacional para las ETA. Adicionalmente, un brote de ETA se debe considerar una emergencia epidemiológica, de notificación inmediata. Es necesario realizar la investigación de éste tipo de brotes, a la brevedad posible con la integración de los equipos de Epidemiología, Higiene de los Alimentos y el Laboratorio de referencia.

Figura 2: Dendograma de la imagen tiff del gel mostrando el análisis de los aislamientos de Salmonella Javiana procedentes de pacientes y del alimento implicado (queso blanco). El análisis de los patrones de PFGE fue realizado utilizando el programa computarizado BioNumerics versión 4.0 (Applied Maths), aplicando el coeficiente de similitud de Dice.

AGRADECIMIENTOS

 A la Gerencia Sectorial de Diagnóstico y Vigilancia Epidemiológica, Gerencia Sectorial de Registro y Control del Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”, Contraloría Sanitaria y Dirección de Higiene de los Alimentos, Maturín, Edo. Monagas.

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