Aislamiento e Identificación por Métodos Convencionales y PCR de Listeria Monocytogenes en Quesos Blancos Frescos Comercializados en Cumana, Venezuela.

 Luz Bettina Villalobos de B. y Rosa E. Martínez N.

Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre, Postgrado en Biología Aplicada Cerro El Medio. Casa 13. Cumaná, Venezuela. E-mail: lbvillalobosb@yahoo.com

 RESUMEN

El queso artesanal es uno de los alimentos que tiene poca supervisión sanitaria durante su elaboración y comercialización. Como se ha visto involucrado en brotes de ETA en Venezuela, y en otros países está asociado a listeriosis, en el presente trabajo se investigó la presencia de Listeria monocytogenes en quesos frescos que se expenden en comercios públicos y municipales de Cumaná. Se analizaron 60 muestras de quesos frescos determinándose los porcentajes de NaCl y pH. El aislamiento y caracterización bioquímica de las cepas de Listeria spp se realizaron según la FDA y API Listeria y molecularmente por PCR Los valores de pH oscilaron entre 3,81 y 7,10 con un promedio de 5,87, el porcentaje de NaCl osciló entre 0,58 y 7,60, con media 2,20. Diez muestras fueron positivas por pruebas bioquímicas convencionales y API Listeria para el genero Listeria. En la confirmación por PCR, se identificaron 2 L. monocytogenes, 2 positivas para el grupo L.welshimeri- L.selligeri-L.ivanovii y 5 cepas identificadas como L. innocua y 1 L.grayi Las dos L. monocytogenes, fueron positivas para gen de la listeriolisina (hly). Los datos aportan evidencia de fallas en la elaboración de los quesos artesanales por la gran dispersión en los valores de NaCl y pH, además con este estudio se confirma que Listeria monocytogenes puede encontrarse contaminando alimentos de alto consumo en el país.

Palabras clave: Queso, Listeria monocytogenes, PCR.

Isolation and Identification by Conventional and PCR Methods of Listeria monocytogenes in Fresh White Cheeses Commercialized in Cumaná, Venezuela.

ABSTRACT

The artisan venezuelan cheese is a food that does not have sanitary supervision during its elaboration and sale. This food has been associated with outbreaks of infections diseases in Venezuela and especially listeriosis in North America and Europe, thereby, it was investigated the presence of Listeria monocytogenes in this kind of cheese that is commercialized in municipal and public markets of Cumaná. Sixty samples of fresh white cheese were analyzed to determine its NaCL content and pH values. The isolation and biochemical characterization were carried out by FDA standars and API Listeria, and the molecular identification by PCR. The pH values were in the range 3.81-7.10, mean 5.87. The NaCl percentages were in the range, 0.58-7.60 mean 2.20. Ten samples of cheese were positive for Listeria spp by biochemical test and API Listeria PCR confirmation were identified 2 Listeria monocytogenes, 2 L. welshimeri- L. selligeri- L ivanovii group, 5 L. innocua and one L grayi. The L. monocytogenes strains were positive for listeriolisin gene (hly). These results show evidence of failures in the elaboration of this artisan cheese due to great dispersion of NaCl and pH values, and confirm the presence Listeria monocytogenes in this kind of food.

Key words: Cheese, Listeria monocytogenes, PCR.

Recibido: 28 / 04 / 2006. Aceptado: 09 / 02 / 2007.

INTRODUCCIÓN

Listeria monocytogenes es un microorganismo que no era considerado como un importante patógeno transmitido a través de los alimentos hasta hace relativamente poco tiempo, y en consecuencia, no había recibido atención por parte de la industria alimentaría. Los índices de listeriosis se habían visto ensombrecidos por otros patógenos más evidentes, como son Salmonella y Campylobacter, sin embargo, los brotes de listeriosis vehiculizados por alimentos al principio de la década de los 80, demostraron la grave naturaleza de la enfermedad, que excepcionalmente cursaba altos índices de mortalidad, en particular en la población más susceptible como son los niños nonatos, los ancianos y los inmunodeprimidos [17, 23, 40].

La incidencia de listeriosis en humanos es muy baja, normalmente alrededor 2 a 8 casos esporádicos anuales por un millón de habitantes, en Europa y los Estados Unidos [22, 29, 30]. Una proporción significante de la población, estimada en un 3%-10%, hospeda Listeria en su tracto gastrointestinal sin mostrar signos de enfermedad [36]. Listeria monocytogenes ocasionalmente causa brotes con síntomas usualmente asociados con enfermedades transmitidas por alimentos, tales como nauseas y diarreas [38]. Listeria está en la tierra, aguas servidas (desagües de fábricas), materia fecal, vegetación, ensilados y entorno de la producción de alimentos, todo esto está unido a las extraordinarias capacidades fisiológicas de la bacteria. Soporta altas concentraciones de sal (10%-12%), las bajas y altas temperaturas (1°C; 45-50°C), el amplio rango de pH (4,3-9,6) [9, 26], y la actividad de agua (aw) mínima para crecer (0,90) [34], son factores que favorecen el desarrollo de este microorganismo en una variedad de alimentos.

La incidencia de Listeria monocytogenes en quesos blandos ha sido reportada en España [12], quienes la encontraron en 11,4% del total de muestras de quesos blandos analizados. En el mismo país [40] reportaron para Navarra una ocurrencia del 8,1% en los quesos suaves muestreados. En una planta de productos lácteos en Minas, Brasil, [38], encontraron que el 16,7% de las muestras examinadas contenían Listeria spp, sólo 1 de ellas fue L. monocytogenes.

En Venezuela en el año 2003, el 45% de los brotes por intoxicaciones alimentarias ocurrieron en escuelas y hogares, de éstos el 33% se originaron por consumo de queso [32] demostrando las deficiencias higiénico-sanitarias en la producción artesanal de este alimento, lo que aunado al alto consumo del producto entre la población de riesgo, conlleva a considerar los quesos blancos frescos como un vehículo potencial para la transmisión de L. monocytogenes. Ante esta consideración se desarrolló el presente trabajo para determinar la presencia del patógeno en los quesos blancos que habitualmente se consumen en Cumaná, mediante el uso de métodos convencionales y moleculares.

MATERIALES Y MÉTODOS

Recolección de las muestras

Se colectaron 60 muestras de 500 g cada una de quesos frescos blancos blandos. Las muestras fueron obtenidas a partir de puntos de ventas del Mercado Municipal, puestos ambulantes y supermercados de la ciudad de Cumaná y se colocaron por separado en bolsas plásticas con cierre hermético en cavas con hielo para su traslado al laboratorio de Microbiología. Una vez en el laboratorio, se tomaron alícuotas de 45 y 50g al azar de cada queso para realizar los análisis de pH, sal y bacteriológicos respectivos.

Concentración de sal

Se realizó por el método de Mohr adoptado por la Association of Official Analytical Chemistry (AOAC) [2].

pH

Para medir el grado de intensidad de la acidez, que influye tanto en el sabor, color, textura, así como en la buena apariencia del producto, se trabajó según la norma COVENIN 1315-7 [11].

Aislamiento de L. monocytogenes por métodos convencionales y PCR

Cada muestra se analizó por separado siguiendo las indicaciones del Manual Bacteriológico Analítico de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (BAM-FDA) [3]) para el aislamiento e identificación convencional de L. monocytogenes, además de las pruebas miniaturizadas rápidas API Listeria (BioMerieux, Gambaro).

Reacción en Cadena de la Polimerasa

Para la identificación de las cepas aisladas por la prueba de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se llevó de acuerdo a lo descrito por Bubert y col. [4, 31] con la utilización de cuatro pares de iniciadores, que permitieron la confirmación molecular de las cepas aisladas. La extracción del ADN cromosómico se realizó con el kit de extracción y purificación de ADN total Wizard- Promega (Madison, Wisconsin EUA). Como cepa control se utilizó Listeria monocytogenes CVCM 446 [10].

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Concentraciones de NaCl y valores de pH

Las fluctuaciones en el contenido de sal en las muestras de quesos oscilaron un mínimo de 0,58% y máximo de 7,60% con media de 2,08%. En cuanto al pH, el valor mínimo observado fue de 5,23 y el máximo de 6,86 con una media de 5,97, considerados ligeramente ácidos. En la TABLA I se detalla el grado de acidez y porcentaje de sal observados en las muestras que fueron positivas para la detección del género de Listeria spp.

TABLA I

VALORES DE pH Y PORCENTAJES DE SAL (BASE HÚMEDA) OBSERVADOS EN MUESTRAS DE QUESOS BLANCOS FRESCOS COMERCIALIZADOS EN CUMANÁ, VENEZUELA, POSITIVOS PARA LA PRESENCIA DE Listeria monocytogenes Y OTRAS ESPECIES DEL GÉNERO/

pH VALUES AND PERCENTAGES OF SALT (WET BASE) IN WHITE FRESH CHEESES COMMERCIALIZED IN CUMANA, VENEZUELA, POSITIVES FOR Listeria monocytogenes AND OTHERS Listeria SPECIES.

* Las cepas fueron aisladas a partir de Agar Selectivo de Oxford.

Aislamiento e identificación convencional

Se observaron diferencias en el aislamiento a partir de los medios de Oxford y Palcam, lográndose mayor porcentaje de aislamiento de colonias presuntamente positivas a Listeria spp en Agar Oxford, este medio suprimió mejor en este alimento la flora competitiva. De las 60 muestras analizadas 10 (16,6%), fueron positivas para el aislamiento del genero Listeria. Se aislaron 10 cepas que se confirmaron como miembros del género mediante el empleo de API Listeria, observándose que del total de cepas estudiadas fueron L. monocytogenes 2 (20%), L. inoccua 5 (50%); y 10% para L. ivanovii, L. grayi y L. seeligerii, 1 aislado para cada especie.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Para los efectos de los ensayos para PCR, se evaluaron 10 cepas para la identificación especifica de L. monocytogenes, L. inoccua y las especies agrupadas (L.seeligeri, L.ivanovii y L.welshimerii). Una primera combinación de iniciadores (monoA y lis1B) derivados de la secuencia del gen iap, fue utilizado para la identificación específica de L. monocytogenes. La corrida electroforética evidenció que en dos muestras de 10, eran L. monocytogenes al dar un producto de PCR de aproximadamente 660 bp (FIG. 1). La segunda combinación de iniciadores (ino2 y lis1B), se empleó para la identificación específica de L. innocua. Se observaron productos de 870 bp confirmando la identificación de la especie en las 5 cepas amplificadas (FIG. 2) Las especies agrupadas (L. seeligeri, L.ivanovii, L.welshimerii), fueron identificadas usando una tercera combinación de primers (siwil y lis1B). Mostrando productos de PCR aproximadamente 1.200 bp. Los fragmentos amplificados indicaron que las 2 cepas restantes pertenecen a la especie agrupadas de Listeria (L seeligeri, L ivanovii, L. welshimerrii) (FIG. 3). No se observó amplificación del genoma de la cepa identificada bioquímicamente como L. grayi.

PCR en la identificación del gen de patogenicidad (hly) de L. Monocytogenes.

Los productos amplificados mostraron que las cepas identificadas por PCR de L. Monocytogenes, contaban con secuencias de ADN del gen de la Listeriolisina (hly), al observarse bandas de un tamaño molecular de aproximadamente 730 bp, indicando la presencia de cepas patógenas invasivas (FIG. 4). Estas cepas provenían de muestras de quesos tomadas de supermercados.

En Venezuela la fabricación de quesos comienza en la época colonial y prácticamente en las zonas de ganadería el proceso se ha mantenido inalterable, la experiencia y el conocimiento sobre la fabricación artesanal ha pasado de generación en generación y la tecnificación en gran escala aún no es lo habitual en las zonas productoras con algunas excepciones. Es por ello que las deficientes condiciones higiénicas en la fabricación de estos productos han ocasionado que el queso sea considerado como un sustrato óptimo para el desarrollo de los microorganismos y sus toxinas [1, 7, 15, 16]. En este país, entre los años 1996 y el 2000, las enfermedades transmitidas por alimentos se incrementaron en un 63%, a pesar del subregistro que se lleva. En el 2004, para la semana epidemiológica 43 se habían reportado 18.169 intoxicaciones alimentarias con 1 muerte [32]. Los productos lácteos, en especial los quesos, han sido los alimentos más involucrados seguido de los pescados y mariscos.

Uno de los problemas en la producción artesanal de quesos es que no existe uniformidad en cuanto a los contenidos de sal, pH, grado de acidez, calidad de la materia prima, sistemas de conservación y transporte, por lo que es impredecible si pueden tener condiciones para sustentar el desarrollo microbiano.

Los límites de crecimiento para Listeria monocytogenes se han establecido para un rango temperatura entre 2,5°C – 44°C, pH 4,5-9,5, y cloruro de sodio de 2%, aunque puede crecer en concentraciones de 10% de sal y sobrevivir por cinco días a concentraciones de 20 a 30% de NaCl a temperatura de 4°C [18]. Los aislamientos de las distintas especies de Listeria en este trabajo, no mostraron una afinidad en especial para alguna concentración de sal o pH ya que se observaron aislamientos, tanto a concentraciones de 0,99% como a 7,60% de sal y pH entre 3,81 a 7,10. L. monocytogenes es capaz de desarrollarse en presencia de 10% e incluso del 12% de sal a pesar de su preferencia por una actividad de agua de 0,97, valor que puede estar presente en aquellos productos con mínimo contenido de sal [26]. Al comparar estos datos con los reportados en el presente trabajo, se puede inferir que, el porcentaje promedio de sal se ubicó dentro de los rangos óptimos para el crecimiento y supervivencia de L. monocytogenes, puesto que brindó una disponibilidad de agua suficiente para su crecimiento. Se ha reportado que la concentración de sal óptima para que crezca Listeria spp a temperaturas inferiores de 10°C, es de 2-2,5% [9].

En cuanto al pH se ha establecido que Listeria spp. puede soportar condiciones ácidas mínimas de 4,5, se ha demostrado el incremento en la supervivencia de cepas de Listeria monocytogenes adaptadas a condiciones ácidas, especialmente en alimentos que contienen ácido láctico (pH 4,71), acido cítrico (pH 3,65) o acido acético (pH 3,0), lo que explicaría la tolerancia a la baja acidez en el proceso de maduración de quesos duros [14, 37]. Resultados similares en el presente estudio fueron reportados en quesos blancos en Turquía [21] y en quesos portugueses [22]. Según lo referido, se puede establecer que el pH junto con la concentración de sal y la temperatura de refrigeración, guardan una estrecha relación con la supervivencia de L. monocytogenes en los quesos estudiados, denotando que la mayoría de las muestras analizadas se expendían a temperatura ambiente que favorece el crecimiento de la bacteria.

Los resultados experimentales mostraron una mayor sensibilidad del medio de Oxford para el aislamiento de Listeria spp. en muestras de queso fresco. El medio de Palcam no fue eficaz al permitir el crecimiento de cepas competitivas como Staphylococcus y Streptococcus, que por las condiciones de elaboración del estos productos son miembros constantes de la flora autóctona, opacando a los microorganismos listéricos que pudiesen estar presentes. La sensibilidad de detección observada por el método BAM-FDA, ha estado cercano al 90%. Basado en estos resultados, muchos de los laboratorios de las industrias alimentarias, utilizan con más frecuencia estos protocolos [19, 24], indicando mayor eficiencia de los medios Palcam y Oxford para la recuperación de L. monocytogenes en alimentos, aunque su grado de recuperación varíe en función del tipo de alimento. Otros autores han utilizado el Agar Oxford para el aislamiento de Listeria a partir de leche y de productos lácteos [13]. Lo que concuerda con los resultados observados, los cuales la totalidad de las cepas aisladas provinieron de medio de Oxford. Recientemente, otros autores también advierten sobre la superioridad del medio Oxford sobre Palcam como medio de aislamiento para Listeria monocytogenes [20, 43].

El resultado de la aplicación de las pruebas miniaturizadas API Listeria para la confirmación de las cepas aisladas de los quesos frescos, fue excelente, obteniendo un perfil de aceptabilidad entre el 98 al 99% en la identificación de las 5 especies histéricas: L, monocytogenes, L seeeligeri, L.innocua, L. grayi y L.ivanovii. La utilización de esta prueba redujo el tiempo de identificación bioquímica tradicional de 4 días a 24 horas, una vez realizado el aislamiento [36].

La utilización de la PCR, permitió la confirmación en la identificación de las cepas de L .monocytogenes aisladas por el método convencional. Esto permitió igualmente, al utilizar un segundo par de iniciadores (ino2 y lis1B), la diferenciación de L. innocua y L. monocytogenes, las cuales comparten el mismo hábitat ecológico, requerimientos fisiológicos y pueden crecer perfectamente en los medios selectivos corrientes para Listeria, desarrollando colonias que morfológicamente son indistinguibles. La confirmación de las otras especies agrupadas (L. seeligeri, L ivanovii, L.grayi) se logró con la combinación de los iniciadores siwi1 y lis1B obteniéndose la identificación de los mismos. Estos resultados confirman lo reportado por Bubert y col. [4] quienes utilizaron 5 iniciadores diferentes para detectar y diferenciar especies de Listeria, con un único ensayo de PCR múltiplex; los resultados indicaron la superioridad de la técnica sobre los métodos convencionales. Los resultados del presente trabajo con PCR concordaron con la identificación convencional, demostrando que el uso de los métodos convencionales y las técnicas moleculares para esta bacteria son altamente sensibles en la detección e identificación de Listeria spp y Listeria monocytogenes. La utilización de pruebas confirmatorias por métodos moleculares podría emplearse si se requiere alguna información genética de los aislados. En esta comparación, se ha referido que la principal ventaja entre un método y otro, en el PCR es la accesibilidad de los resultados, fácilmente detectable en 4 horas seguido del proceso de incubación, mientras que el cultivo convencional, requiere un mínimo de 8 días para el diagnóstico definitivo de Listeria spp. [5, 12, 25, 27, 39].

La ocurrencia de Listeria spp. en el presente trabajo fue de 16,66%, el cual está por encima de los valores reportados en quesos frescos en Paraná, Brasil [33] donde se reportó que el 6,89% de las muestras analizadas fueron positivas para Listeria ssp., al igual que en un estudio en alimentos en Chile [13], donde se observó un 0,8% de positividad para Listeria spp en los quesos analizados; por el contrario, en quesos industrializados de humedad media en Río Grande del Sur en Brasil encontraron el 11% de las muestras positivas para Listeria spp. y de éstas el 8% fueron positivas para L. monocytogenes, [8].En España se encontró que el 11,4% de las muestras de quesos suaves analizados contenían L. monocytogenes [41]. Valores similares se observaron en quesos frescos comercializados en Perú [42], donde reportaron que el 17,30% de las muestras estaban contaminadas por Listeria spp. y de éstas, el 38,8% fueron confirmadas como L. monocytogenes. Recientemente, en un estudio realizado en plantas productoras de queso blanco fresco al estilo latino en Estados Unidos, L. monocytogenes se detectó en el 6,3% de los quesos analizados [28]. En Venezuela, un trabajo presentado por Carrillo y Zambrano [6] en quesos blancos en el estado Táchira reportó un 9,5% de aislamientos para el género Listeria spp, por el método TECRA® UNIQUE™LISTERIA, pero no se logró identificar ninguna cepa como perteneciente a la especie L. monocytogenes.

El nivel de L.monocytogenes tolerado en los países es muy variable, va de cero en 25 gramos en Estados Unidos, hasta permitir la presencia de 100 UFC/g en algunos países de la Unión Europea. Los expertos internacionales que participaron en la reunión informal de trabajo de la Organización Mundial de la Salud sobre Listeriosis, llegaron a la conclusión de que no es posible la eliminación total de L.monocytogenes de todos los alimentos, más bien, el punto crítico no es cómo prevenir la presencia de L. monocytogenes en los alimentos, sino cómo controlarla para minimizar sus niveles en los mismos [35]. En Venezuela no hay reglamentación al respecto, pero en este trabajo se demuestra que L. monocytogenes se encuentra en estos alimentos y es necesario seguir algunas de las legislaciones vigentes, sobre todo en alimentos que deseen participar en el comercio internacional.

CONCLUSIONES

Las muestras de quesos analizadas mostraron gran variabilidad en cuanto a su contenido de sal y pH, indicando que no hay uniformidad en el proceso de producción quesera artesanal del país.

El 16,6% de las muestras analizadas fueron positivas para la presencia del género Listeria.

Listeria monocytogenes se encontró contaminando un producto de alto consumo nacional.

Las cepas de Listeria monocytogenes aisladas se revelaron como virulentas por medio de la técnica de la reacción en Cadena de la Polimerasa.

La identificación convencional por medio del sistema API Listeria, fue comparable al PCR para la identificación del género y especie.

La técnica del PCR, es útil cuando se requiere diferenciar L innocua de L .monocytogenes y verificar la virulencia de la cepa.

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