Diagnóstico de Pneumocystis carinii: Estudio comparativo entre la inmunofluorescencia directa y la coloración histológica de Gomori-Grocott

Borelli, K.; Brito, A.; Rivas, G.; Panizo, Ma. M.; Roldán, Y.

Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”, Caracas, Venezuela

Palabras-clave: Pneumocystis carinii, coloración Gomori-Grocott, inmunofluorescencia directa.

Resumen

Se compararon las técnicas de inmunofluorescencia directa (IFD) y de Gomori-Grocott (G-G) para el diagnóstico de Pneumocystis carinii en pacientes inmunocomprometidos con infección respiratoria baja. Se analizaron 30 muestras de esputo; a cada muestra se le practicó IFD y G-G.

Se obtuvo el 12/30 (40%) de positividad, correspondiéndole 9 (30%) a la IFD, 2 (7%) al G-G y 1 (3%) para ambas. Este resultado fue estadísticamente significativo (p<0,05), concluyéndose que la IFD es la prueba más idónea para diagnosticar P. carinii en muestras de esputo.

Abstract

We compared the direct immunofluorescence (DIF) with the Gomori-Grocott (G-G) tests, to diagnose Pneumocystis carinii in immunosuppressed patients with low respiratory disease. We applyed both methods to 30 samples of sputum, obtaining 12/30 (40%) of positiveness: 9 (30%) to DIF, 2 (7%) to G-G and 1 (3%) to both. This result was statistically significant (p<0.05). To conclude, the DIF is the best test to diagnose P. carinii in samples of sputum.

Introducción

Pneumocystis carinii (P. carinii) fue descubierto en 1909 en el estado brasileño de Minas Gerais por el epidemiólogo Carlos Chagas, quien pensó que se trataba de una variante del Trypanosoma cruzi.

Posteriormente, Delanöes (1912-1914) demostró que era de un género y especie distintas, denominándolo P. carinii en honor a Carini, un inmigrante italiano que, trabajando en el Instituto Pasteur de Sao Paulo, sospechó que los quistes eran de un patógeno desconocido, que afectaba preferiblemente los pulmones 1, 2.

Es sólo hasta 1940 que es tomado en cuenta en Europa, por la aparición de neumonía en prematuros y niños malnutridos que provocaba una alta mortalidad, caracterizándose la infección por la presencia de sustancias “espumosas” en los alvéolos, engrosamiento de los tabiques alveolares e infiltrado inflamatorio a predominio plasmocitario 3.

En la década de los 60, P. carinii es reconocido como uno de los causantes de infección respiratoria baja en pacientes inmunocomprometidos, y hasta la aparición del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) era una neumonía bastante rara. Algunos autores consideran que la neumonía por P. carinii es la infección oportunista más común en pacientes con SIDA 4.

Para 1988, en los Estados Unidos se estimaban en unos 150 .000 los casos de neumonía por P. carinii. Actualmente, el centro de Control de Enfermedades (CDC) estima un millón de personas infectadas con el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH), de los cuales, el 80% podrá desarrollar neumonía por P. carinii durante su vida. En nuestro país el panorama es aproximado.

Hay reportes que señalan que la profilaxis contra la neumonía por P. carinii parece retrasar la definición de SIDA de 6 a 12 meses, presentando un contaje de linfocitos CD4 bajo en el momento de diagnóstico 5.

La taxonomía de P. carinii es un tema álgido aún. Recientes estudios sobre su ultraestructura sugieren que se acerca más a un hongo que a un protozoario 6,7; sin embargo, se le consigue en todos los textos de Parasitología y con dificultad (o no se le consigue, como lo demuestra nuestra revisión) en los de Micología. La base de su cambio taxonómico se sustenta en la secuencia del ARNm y la presencia de características estructurales de genes codificados por las enzimas dihidrofolato reductasa y thimidilato sintetasa1,7,8, siendo el factor proteico de elongación de translación en el gen 3EF-3 exclusivo para hongos9. Estas características hacen pensar que P. carinii está más cerca de las levaduras (ascomicetos) que de los protozoarios (Leishmania y Plasmodium)10, 11. La coloración que toma su pared celular (gracias al componente beta-1, 3- glucano, común en muchas levaduras) con methenamina de plata, ayuda a esta conclusión12,13.

Además, existen reacciones cruzadas de P. carinii con anticuerpos monoclonales contra Aspergillus sp., lo que apoya aún más su naturaleza fúngica. Sin embargo, la susceptibilidad frente a los antibióticos, la falta de crecimiento en terrenos para hongos y su morfología general, especialmente la carencia de ergosterol en su membrana citoplasmática, lo vuelven insensible frente a los antifúngicos que actúen inhibiendo la síntesis del mismo14. Todo esto lo sigue asemejando a un protozoo1.

El ciclo vital es igualmente controversial. P.carinii presenta un ciclo sexual y uno asexual. En resumen, el ciclo sexual comienza con la ruptura de los quistes maduros (“ascas”) que miden entre 4 y 6 micras, dejando libres los cuerpos intracitoplasmáticos, transformándose éstos en trofozoitos haploides (“ascosporas”) que miden entre 2 y 8 micras y posteriormente se tornan diploides por conjugación (copulación). Estos últimos formarán nuevos quistes, a través de un complicado proceso (complejo sinaptonemal), luego de progresivas fases de meiosis. Se forman por división sucesiva 4 y 8 núcleos que se envuelven dentro de la membrana plasmática, dando origen al quiste maduro (“asca”), con 8 cuerpos intraquísticos (“ascosporas”).

Además del sexual, se puede desarrollar un ciclo asexual por fisión binaria y endogénesis de trofozoítos haploides y diploides 1, 5, 15. En cuanto a la patogénesis, debemos señalar que P.carinii entra en contacto con la superficie celular del tracto respiratorio (células epiteliales tipo I), y por invaginación de la membrana de estas células penetra, favoreciendo esto su desarrollo 5. Aún son inciertos sa (PCR), aún en vías de estandarización, que permite ampliar fracciones ínfimas del ADN del microorganismo para facilitar su estudio4,25,35. Algunos reportes hechos han confirmado que la IFD podría ser superior a muchas de las técnicas antes mencionadas, aunque hay diversidad de opiniones al respecto. Entre esos reportes, tenemos que:

1. Halford, J.A. y col., en un estudio interesante y muy parecido al presente trabajo, comparan la técnica de IFD con la tinción de methenamina de plata G-G, en 384 muestras de esputo, encontrándose P. carinii en 31 de las de IFD y en 24 de las de G-G; además, 12 muestras positivas con IFD fueron negativas con G-G y, al contrario, 5 positivas con G-G fueron negativas con IFD, concluyendo que la IFD, aunque relativamente costosa, es fácil de realizar y más sensible que el G-G; sin embargo, en muestras de esputo recomiendan el uso combinado de ambas técnicas, para optimizar la sensibilidad de su detección33.

2. Gori, S. y col., en un estudio comparativo de muestras de esputo y de lavado broncoalveolar, procesadas con diversas coloraciones (G-G, Giemsa, azul de toluidina) y con otras técnicas, entre ellas la IFD, encuentran que la coloración de G-G es muy larga y laboriosa y, debido a la gran cantidad de hongos presentes normalmente en la cavidad orofaríngea de los pacientes con SIDA (grave problema diagnóstico), concluyen que la IFD es de gran utilidad, y sugieren que sería el método más indicado cuando se trate de muestras de esputo28.

El tratamiento se centra en la utilización del trimetoprim-sulfametoxazol (TMP-SMZ) como droga de elección, a dosis de TMP: 20 mg/kg/d + SMZ: 100 mg/kg/d TID ó QID x 21 días. No obstante, con su uso profiláctico prolongado a bajas dosis en pacientes inmunocomprometidos se ha observado el desarrollo de resistencia. En estos casos, y en aquéllos con intolerancia al TMP-SMZ, existe una segunda línea de medicación a base de pentamidina, pero que también produce efectos adversos.

Una alternativa equivalente a la droga de elección sería la combinación de TMP y diaminodifenilsulfona (DDS), aparentemente una terapia segura, efectiva y bien tolerada, a pesar de los inconvenientes de hemólisis que produce el DDS, usándose dosis de TMP: 20 mg/kg/d TID + DDS: 100 mg/día x 21 días. Otras alternativas son: atovaquona (hidroxinaftoquinona), clindamicina, primaquina, trimetrexate (antifolato), leucovorin, etc. Los corticosteroides se reservan para aquellas neumonías severas con P02<70 mm Hg, únicamente durante las primeras 72 horas de terapia5. Se recomienda que, si el paciente no ha mostrado mejoría en la primera semana de inicio del tratamiento, debe rotarse hacia la combinación arriba señalada u a otras alternativas. Se dice que si no responde a la primera línea de tratamiento, la mortalidad oscila entre el 75 y el 100%19. En cuanto al desarrollo de una vacuna que prevenga la neumonía por P. carinii, aún no se ha podido elaborar, debido a que los antígenos expresados en la superficie de su membrana celular están continuamente cambiando, y no se han logrado identificar por el control inmunológico que ejercen los macrófagos alveolares23. Aunque ensayos recientes, inoculándose intranasalmente antígenos solubles de P. carinii + la fracción beta de la toxina del bacilo del cólera (Ag Pc-CTB) a modelos animales (ratones) en quienes se había reproducido experimentalmente IRB por P. carinii, pudo eliminarse la totalidad de los microorganismos del pulmón en unas 5 semanas. Se comprobó que proteínas de 55 y 60 Kda del antígeno fueron reconocidas por la IgA del lavado bronquial e IgG del suero, concluyéndose que la inmunización intranasal originaba respuesta celular y humoral con niveles elevados de inmunoglobulinas en relación a los controles (p<0,01)37.

En base a todo lo anteriormente expuesto, y aunque la clasificación y ciclo vital de este microorganismo sean aún inciertos, es hora de dejar de hacer diagnósticos presuntivos y comenzar a hacerlos confirmatorios cuando sospechemos infección por P. carinii. Por esto decidimos comparar dos técnicas, que son polos opuestos entre ellas:

• La tradicional y laboriosa, pero poco costosa coloración de G-G vs.

• La moderna y rápida, pero relativamente costosa IFD.

Materiales y Métodos

Consistió en un estudio doble ciego y comparativo de dos métodos de diagnóstico para P.carinii: la IFD y la coloración de G-G.

Se analizaron 30 muestras de esputo de pacientes inmunocomprometidos con IRB, con edades comprendidas entre 18 y 69 años, 23 hombres y 7 mujeres, procedentes de tres hospitales del Area Metropolitana de Caracas: 12 pacientes del Hospital Universitario de Caracas (Servicio de Medicina Interna, de Neumonología y de Infectología), 17 del Hospital José Ignacio Baldó (consulta de pacientes con SIDA) y 1 paciente del Hospital Domingo Luciani. Las muestras fueron recolectadas durante los meses de julio, agosto y septiembre de 1999.

Criterios de inclusión:

• Pacientes de cualquier edad y sexo, con diagnóstico de SIDA u otro tipo de inmunosupresión.

• Pacientes con sintomatología de pneumocistosis.

• Pacientes recibiendo o no terapia profiláctica para P. carinii.

Toma de la muestra: Por expectoración espontánea. A cada paciente se le instruyó para que recolectara una muestra de esputo en envase estéril de boca ancha (urolab), recomendándole lavarse bien la boca y hacer gargarismos con agua antes de expectorar.

Metodos

Procesamiento de la muestra: una parte del esputo obtenido de cada paciente se destinó a la técnica de IFD, y la otra a la coloración histológica de G-G.

Técnica de IFD: A través del test de Merifluor Pneumocystis de Meridiam Diagnostic modificado, que consiste en:

Preparación de las muestras de esputo:

• Los esputos deben ser diluidos 1:10 con PBS en tubos de centrífuga graduados, con tapa de rosca (de preferencia). Se toma 1ml del esputo y se le añaden 9 ml del PBS a cada tubo. Se agitan manualmente o en vórtex, hasta homogeneizar.

• Centrifugar a 6.000 rpm por 10 minutos.

• Descartar el sobrenadante y realizar 2 lavados sucesivos adicionales con PBS. Descartar el sobrenadante del último lavado y conservar el sedimento.

Procedimiento de la coloración:

• Tomar 1 gota del sedimento y colocarlo en un pocillo de la lámina especial para inmunofluorescencia. Dejar secar completamente a temperatura ambiente.

• Agregar 1 ó 2 gotas de acetona a la muestra, para fijarla, y dejar secar de igual forma.

• Colocar 1 gota (50 microL) del reactivo de detección (isotiocianato de fluoresceína) marcado con anticuerpos monoclonales dirigidos contra la pared celular y antígenos principales de los quistes (“ascas”) y trofozoítos (“ascosporas”) de P. carinii, con azul de Evans como colorante de contraste y azida de sodio en cada pocillo. Guardar la lámina en cámara húmeda e incubar por 1 hora 15 minutos, a temperatura de 35-37°C.

• Eliminar el exceso de reactivo mediante enjuague con PBS, utilizando una botella de lavado.

• Enjuagar con agua destilada, utilizando botella de lavado.

• Dejar secar completamente la lámina.

• Añadir a cada pocillo 1 ó 2 gotas de líquido de montaje (glicerina) y colocar encima una laminilla, evitando la formación de burbujas de aire.

• Observar al microscopio de fluorescencia a 40X, con longitud de onda de 490-500nm y filtro de 510-530.

Los resultados: observar la presencia de quistes (“ascas”), trofozoítos (“ascosporas”) y células respiratorias, con apariencia de panal de abeja o cluster de trofozoítos (“ascosporas”), que se evidencian por una fluorescencia color verde manzana brillante, sobre un fondo negro y naranja.

Grafico 1. Pacientes Inmunocomprometidos. Distribución por sexo.

Técnica de Coloración Histológica de G-G:

• Se hacen extendidos en lámina de las muestras de esputo y se fijan por calor.

• Fijar con alcohol de 95°.

• Oxidar con una solución fresca de ácido crómico al 4%, durante 1 hora.

• Lavar con agua durante unos pocos segundos.

• Colocar en solución de bisulfito de sodio durante un minuto para remover todo el residuo de la solución de ácido crómico.

• Lavar con agua corriente de 5 a 10 minutos.

• Enjuagar con agua destilada, 3 ó 4 veces.

• Colocar en una mezcla fresca de nitrato de plata-metenamina (preparar antes de usar; si está turbia, no usarla) en el horno a temperatura de 58°C a 60°C, durante 50 a 60 minutos.

• Enjuagar con agua destilada, 6 veces.

• Matizar con la solución de cloruro de oro, de 2 a 5 minutos.

• Enjuagar con agua destilada.

• Colocar en la solución de tiosulfato de sodio, de 2 a 5 minutos.

• Lavar bien con agua.

• Contrastar con la solución diaria verde claro de malaquita, durante 30 a 45 segundos.

• Deshidratar y aclarar a través de alcohol etílico al 95%, alcohol etílico absoluto y xileno, 2 cambios cada uno, 2 minutos cada uno.

• Montar con un medio resinoso.

Grafico 2. Pacientes masculinos. Distribución según grupo etario.

Los resultados: Los hongos se ven perfectamente delineados en color negro, la mucina luce gris oscura, micelio e hifas son color rosado grisáceo y el fondo de color verde.

Tabla Nº 2. Pacientes femeninos. Distribución según grupo etario.

Grupo Etario	Mujeres
	Nº	%
15-19	1	14.3
20-24	0	0
25-29	2	28.5
30-34	1	14.3
35-39	0	0
40-44	3	42.8
45-49	0	0
50-54	0	0
55-59	0	0
60-64	0	0
65-69	0	0
Total	7	100.0

Análisis estadísticos: Se utilizo la Prueba de Mc. Nemar para la significancia estadística.

Resultados

Se estudió a 30 pacientes, de los cuales 23 (77%) eran hombres y 7 (23%) mujeres (gráfico 1), con edades comprendidas entre 18 y 69 años (edad promedio: 36,5) En 12/30 (40%) fue positiva la prueba para diagnosticar P. carinii, correspondiéndole a la IFD 9 (30%), al G-G 2(7%) y a ambas 1(3%). La comparación entre ambas técnicas se expresa mejor a continuación:

Grafico 4. Comparación de las Técnicas de IFD y GC para el DX de Pneumocystis cariniii en pacientes con terapia profiláctica.

• 1/30 (3,3%) fue positivo para ambas técnicas.

• 9/30 (30%) fueron positivos para IFD y negativos para G-G.

• 2/30 (6,7%) fueron positivos para G-G y negativos para IFD.

• 18/30 (60%) fueron negativos para ambas.

Esto indica que hay discordancia o diferencia entre las dos técnicas, siendo esta discordancia estadísticamente significativa ( p<0,05 ).

Del total de pacientes estudiados, 25 (83,33%) recibieron antibioticoterapia profiláctica con TMPSMZ ó clindamicina (en el caso de presentar intolerancia a las sulfas) y sólo 5 (16,66%) no la recibieron. De los 25 pacientes tratados, comparando ambas técnicas, obtuvimos los siguientes resultados

Casos	IFD	GC
0	+	+
8	+	-
5	-	+
15	-	-

Tabla Nº 4. Comparación de las técnicas IFD y GC para el DX de Pneumocystis carinii con terapia profiláctica

Grafico 5. Comparación de las técnicas IFD y GC para el DX de Pneumocystis carinii con terapia profilactica )

• Ninguno fue positivo para ambas técnicas.

• 8/25 (32%) fueron positivos para IFD y negativos para G-G.

• 2/25 (8%) fueron positivos para G-G y negativos para IFD.

• 15/25 (60%) fueron negativos para ambas, lo que no fue estadísticamente significativo (p>0,05). De los 5 pacientes sin tratamiento obtuvimos lo siguiente

Casos	IFD	GC
1	+	+
1	+	-
0	-	+
3	-	-

Tabla 5. Comparación de las técnicas IFD y GC para el DX de Pneumocystis carinii sin terapia profilactica,

Grafico 6. Comparación de las técnicas IFD y GC para el DX de Pneumocystis carinii sin terapia profilactica

• 1/5 (20%) fue positivo para ambas técnicas.

• 1/5 (20%) fue positivo para IFD y negativo para G-G.

• 3/5 (60%) fueron negativos para ambas.

Esto tampoco fue estadísticamente significativo (p>0,05).

Discusión

En este estudio comparamos las técnicas de IFD y de G-G para diagnosticar P. carinii. La muestra estaba constituida por un 77% de hombres, con una edad promedio de 36,75%

Grupo Etario	Hombres
	Nº	%
15-19	0	0
20-24	1	4.3
25-29	3	13
30-34	5	22
35-39	6	26
40-44	2	8.6
45-49	1	4.3
50-54	1	5.3
55-59	0	0
60-64	0	0
65-69	4	17.4
Total	23	100.0

Tabla Nº 1. Pacientes masculinos. Distribución según grupo etario.

Cifras que se correlacionan con la mayoría de los estudios.

Utilizando estas dos técnicas, observamos que los resultados son comparables con los reportados en la literatura, ya que indican que la IFD es más sensible que el G-G cuando se trata de muestras de esputo27-32

Casos	IFD	GC
1	+	+
9	+	-
2	-	+
18	-	-

Tabla Nº 3. Comparación de las técnicas IFD y GC para el DX de Pneumocystis carinii.

No fue estadísticamente significativo el hecho de estar o no recibiendo antibioticoterapia, lo que implica que el tratamiento profiláctico no impide el hallazgo del microorganismo. Es importante determinar si el tiempo de duración de la terapia profiláctica influye en la detección de P. carinii, pero no obtuvimos esta información. Generalmente el tratamiento se indica, pero depende del paciente el cumplimiento del mismo. El hecho de que 2 de los 25 pacientes en tratamiento fueran positivos para G-G y negativos para IFD, podría deberse a que:

• la muestra de esputo no era representativa en calidad y cantidad.

• el tratamiento prolongado podría influir en la viabilidad del microorganismo.

Es posible que la positividad de G-G hubiera sido mayor si se hubiesen tomado esputos seriados a cada paciente; pero, en general, nuestros pacientes se encontraban en condiciones generales tan delicadas que la única muestra proporcionada por ellos fue lograda con dificultad. En este punto, aceptamos que el lavado broncoalveolar es el ideal, pero la infraestructura de nuestros hospitales difícilmente cuenta con un equipo disponible para estos pacientes en exclusividad.

Por otra parte, de los 25 pacientes que se encontraban recibiendo antibioticoterapia, 8 persistieron positivos con la IFD, lo que demuestra que es una técnica muy útil y segura para diagnosticarlo, ya que actualmente todos los pacientes con SIDA reciben sulfa profiláctica.

Al comparar la técnica de IFD con la de G-G, encontramos que la primera es relativamente costosa, pero de fácil realización (tiempo estimado: 3 horas), mientras que la segunda, si bien más económica, es muy laboriosa (tiempo estimado: 24 horas); por lo que pensamos que la relación costo/beneficio, tanto para el paciente como para el personal que realiza la técnica, se inclina a favor de la IFD.

Conclusiones

1. La técnica de IFD es la prueba más idónea para diagnosticar P. carinii en muestras de esputo. Aunque relativamente costosa, es de fácil y rápida realización.

2. El G-G es una técnica muy larga y laboriosa. La relación costo/beneficio no es acorde con la necesidad y rapidez que requiere el diagnóstico de P. carinii en los pacientes con SIDA.

3. Para diagnosticar P. carinii a través de la IFD no es necesario excluir a los pacientes con tratamiento profiláctico, pero se debería evaluar el tiempo de duración de la terapia y correlacionarlo con el diagnóstico.

Recomendaciones

• Sería importante realizar el mismo estudio, comparando el tiempo de duración de la terapia profiláctica aplicada a estos pacientes, con la habilidad de la técnica para seguir detectando al microorganismo.

• Poseer información sobre datos paraclínicos importantes, como niveles de CD4 y LDH, y compararlos con la capacidad diagnóstica de la técnica para establecer si hay correlación o no entre los niveles de CD4 y LDH en estos pacientes y la presencia de IRB por P. carinii.

• Los resultados comparativos entre ambas técnicas para el diagnóstico de P. carinii que se reportan en la literatura, sugieren que para el diagnóstico de pneumocistosis se utilicen ambas técnicas. Sería aconsejable realizar el presente estudio con mayor número de pacientes y comparar los resultados.

• Se sugiere que a todo paciente inmunocomprometido con diagnóstico clínico de IRB se le realice de rutina determinación de P. carinii por IFD.

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