Diagnóstico bacteriológico de Gardnerella vaginalis a partir de muestras de endocérvix.

Castellano-González, M.*; Avila-Roo, Y.*; Ginestre-Pérez, M.*; Perozo-Mena, A.**;
Romero-Añez, S.*; Harris-Socorro, B.*** y Rincón-Villalobos, G.

*Cátedra de Microbiología
**Cátedra de Práctica Profesional de Bacteriología
***Cátedra de Bacteriología, Escuela de Bioanálisis, La Universidad del Zulia, Estado Zulia, Venezuela.

Palabras-clave: Gardnerella vaginalis, vaginosis bacteriana, identificación bacteriológica.

Resumen

Gardnerella vaginalis está asociada con vaginosis bacteriana; no obstante, su rol como agente etiológico de esta infección es controversial. En este estudio, se procesaron 147 muestras de secreción endocervical para su diagnóstico bacteriológico. Se realizó examen directo de las mismas (examen al fresco-coloración de Gram) y se inocularon en ASH y CA (incubados a 35-37ºC por 24-48 horas). La identificación bacteriológica se basó en la visualización de células-clave en el examen directo, morfología colonial y celular, betahemólisis difusa, catalasa, oxidasa e hidrólisis del hipurato; 61 (41,49%) muestras resultaron positivas por el examen al fresco, 62 (42,17%) por la coloración de Gram y 73 (49,66%) por el cultivo, lográndose la recuperación de G. vaginalis en un 93,15% (68 cepas) a partir del medio selectivo C.A. y un 67,12% (49 cepas) del A.S.H, recomendándose el uso de ambos medios de cultivo para aumentar las posibilidades de aislamiento de este microorganismo.

Bacteriological diagnosis of Gardnerella vaginalis from endocervical samples

Abstract

Gardnerella vaginalis is associated with bacterial vaginosis; however, its rol as an etiological agent in this infection is a matter of controversy. In this study a total of 147 samples of endocervical secretion were processed. These samples were subjected to direct examination (wet mount and Gram stain) and were inoculated in H.B.A and C.A. (incubated in 5-10% CO2 at 35-37ºC for 24-48 hrs). Bacteriological identification was based on the appearance of clue celIs under direct examination, cellular and colonial morphology, diffuse betahemolysis, catalase, oxidase and hydrolysis of the hippurate; 61 samples (41,49%) were positive in the wet mount, 62 (42,17%) for Gram staining and 73 (49,66%) in the culture, showing positive results for G. vaginalis in 93,15% (66 strains) based on C.A. and 67,12% (49 strains) in H.B.A., thus, the use of both culture media is recommended in order to increase the possibility of isolating this microorganism.

Introducción

La etiología de la vaginosis bacteriana (VB) es compleja y, probablemente, polimicrobiana. Inicialmente, se pensó que Gardnerella vaginalis era el único agente causal de la VB; pero, a pesar de que esta bacteria es virtualmente aislada de todas las mujeres con VB, el microorganismo también se presenta en un 40% de mujeres sin vaginitis y mujeres exitosamente tratadas por VB, por lo que frecuentemente se considera parte de la flora vaginal normal. En las mujeres con VB, la concentración de G. vaginalis y una amplia variedad de bacterias anaeróbicas, fundamentalmente Bacteroides sp. y Peptococcus sp., usualmente sobrepasa 107 UFC/ml de secreción vaginal, mientras que en las mujeres sin VB, G. vaginalis usualmente está en menos de 104 UFC/ml, y los lactobacilos, están notablemente ausentes. Parece entonces como si G. vaginalis y ciertos anaeróbicos actuaran sinergísticamente para producir VB; es decir, G. vaginalis parece ser un componente necesario en la patogénesis de VB; pero los síntomas no ocurren a menos que la ecología vaginal sea también alterada (1,2).

La vaginosis asociada con G. vaginalis es considerada una enfermedad de transmisión sexual en adultos, puesto que: 1) frecuentemente, el microorganismo puede ser recuperado a partir de los compañeros sexuales de mujeres G. vaginalis-positivas; 2) raramente se recupera G. vaginalis a partir de cultivos vaginales de mujeres vírgenes o niñas; 3) está asociada con otras enfermedades transmitidas sexualmente, considerándose, además, como una de las de mayor prevalencia y de las más contagiosas (3).

En 1953, Leopold (4,5) reportó el aislamiento de un bacilo pequeño, pleomórfico, Gram-negativo, en hombres con prostatitis y mujeres con cervicitis, sugiriéndose entonces que se trataba de un miembro del género Haemophilus. Dos años más tarde, Gardner y Dukes (3) reportaron el hallazgo de organismos con similar descripción, asociados con casos de VB. El microorganismo fue denominado Haemophilus vaginalis, y se consideró que era el agente etiológico de la vaginosis. Sin embargo, desde el trabajo original de Gardner y Dukes(3), numerosos estudios contradictorios han sido publicados en relación no sólo con la potencial patogenicidad de H. vaginalis, sino a su clasificación taxonómica. A diferencia de los miembros del género Haemophilus, H. vaginalis, no requiere hemina (factor X), nicotinamida-adenina-dinucleótido (factor V) o ningún otro factor de crecimiento, razón por la cual Zinnemann y Turner (4,6) recomendaron la remoción de H. vaginalis del género Haemophilus y su reclasificación en el género Corynebacterium, denominándose entonces Corynebacterium vaginale, basándose estrictamente en su morfología microscópica y afinidad tintorial, ya que, bajo condiciones óptimas de crecimiento, H. vaginalis se tiñe Gram-positivo y forma gránulos polares, bastos y letras chinas, semejando un Corynebacterium.

Estudios basados en la hibridización del ADN y en la pared celular del microorganismo demuestran que este género no se relaciona con ningún otro taxón; ya que, si morfológicamente es semejante a un Gram-negativo, su composición química (aminoácidos y carbohidratos) es típica de un Gram-positivo (7). Gardner y Dukes(3) reportaron que este microorganismo se comporta como Gram-variable, y no está relacionado con los géneros anteriormente descritos, por lo que propusieron su ubicación en un nuevo género, Gardnerella, el cual contaría con una sola especie, G. vaginalis.

Gardnerella vaginalis es un bacilo Gram-negativo o Gram-variable, pleomórfico, que se encuentra en el tracto genital y urinario del ser humano, no es capsulado, no es mótil, mide de 0,5 a 1,5 µm, es anaeróbico facultativo y no produce catalasa, ni oxidasa (4,7). La naturaleza exigente de G. vaginalis, y el hecho que la mayor parte de las muestras de origen genital están contaminadas con otra flora, hace necesario el empleo de un medio de cultivo selectivo para su aislamiento, debido aque las pequeñas colonias producidas por este microorganismo son frecuentemente enmascaradas por el abundante crecimiento del remanente de la flora vaginal (8).

Patricia Tottem y cols. (9), en 1982, utilizaron un nuevo medio de cultivo, el agar sangre humana selectivo diferencial de dos capas con tween 80 (HBT) o sin tween (HB), para el aislamiento de G. vaginalis, obteniéndose tasas de aislamiento significativamente superiores para esta bacteria que las obtenidas con otros medios previamente utilizados para este propósito: agar gelosa chocolate (GC), agar peptona-almidón-dextrosa (PSD) y agar V. Además, determinaron que la concentración de G. vaginalis, era significativamente mayor en la secreción vaginal de mujeres con VB que en la de mujeres normales.

Numerosas propuestas para la identificación de G. vaginalis han sido sugeridas. Desafortunadamente, no existe un acuerdo en relación al número y selección de pruebas de laboratorio a ser usadas como criterio para la identificación definitiva de este microorganismo (10,11). La identificación presuntiva de G. vaginalis, puede basarse en la típica morfología celular y afinidad tintorial con la coloración de Gram, la betahemólisis con bordes difusos en agar sangre humana (ASH), y en la prueba de catalasa negativa. Cuando se requiere una identificación más exacta, las pruebas de alfa y beta glucosidasa, hidrólisis del hipurato e hidrólisis del almidón, producen un máximo valor discriminativo. Los esquemas tradicionales de identificación de G. vaginalis se basaban en reacciones de fermentación de azúcares, pero éstas son de escaso valor; ya que otros microorganismos de la vagina dan frecuentemente las mismas reacciones que G. vaginalis. Además, las pruebas de fermentación con G. vaginalis son a menudo inconstantes; sin embargo, cuando los aislamientos extragenitales deben ser totalmente caracterizados, se determina la producción de ácido a partir de los hidratos de carbono (7).

Debido a que G. vaginalis puede ser parte de la flora vaginal normal, el examen directo de la secreción vaginal se usa más frecuentemente para el diagnóstico de VB que el cultivo. Este examen tiene como objetivo la búsqueda de células-clave, cuya presencia es, a menudo, significante (8). Estas pueden ser fácilmente observadas, colocando una pequeña cantidad de secreción vaginal en solución salina fisiológica (SSF), con la finalidad de que las células epiteliales se separen. Igualmente, las células clave pueden ser identificadas en extendidos coloreados siguiendo la técnica de Gram(8,12).

El presente trabajo tiene por finalidad comparar la efectividad del examen al fresco, coloración de Gram y el cultivo para el diagnóstico bacteriológico de G. vaginalis. Así mismo, se compara la efectividad del medio CA con el medio convencional ASH utilizado para el aislamiento de G. vaginalis, y de esta manera implementar una metodología fácil con un alto porcentaje de sensibilidad que permita la identificación de dicha bacteria.

Materiales y Métodos

Se estudiaron 147 muestras de secreción endocervical provenientes de pacientes, seleccionadas mediante una técnica de muestreo probabilístico aleatorio simple. Las muestras se obtuvieron con un hisopo de algodón estéril, que se colocó en el medio de transporte Cary & Blair, para su posterior inoculación en los medios de cultivo.

A partir de las secreciones endocervicales, se realizó un examen al fresco (montaje húmedo) y un extendido para ser coloreado por la técnica de Gram; ambas con el propósito de visualizar las células-clave (también llamadas, células delatoras, células indicadoras o clue cells), que no son más que células epiteliales con aspecto granuloso, de bordes indefinidos como resultado de la adherencia de gran cantidad de bacilos a la superficie celular (8).

Las muestras fueron inoculadas en los medios de ASH y CA; este último contiene 19,5 g de Columbia agar base, 5% de sangre humana estéril y un suplemento selectivo para G. vaginalis, constituido por sulfato de gentamicina (4mg/L), ácido nalidíxico (30mg/L) y anfotericina B (2 mg/L). Los medios fueron incubados en atmósfera microaerofílica, a 35-37ºC, durante 24-48 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, se seleccionaron de ambos medios colonias características de G. vaginalis, las cuales son de 0,3 a 0,5 mm de diámetro, convexas, opacas y grises, productoras de betahemólisis difusa. A partir de las colonias compatibles con G. vaginalis, se procedió a realizar un extendido coloreado con Gram. Si se observaban bacilos Gram-variables, pleomórficos, se realizó la prueba de oxidasa por el método de Kovacs(13), la prueba de catalasa (7) y la prueba rápida de hidrólisis del hipurato, modificada por Hwang y Ederer (14).

Resultados

Los resultados obtenidos del análisis comparativo entre el examen al fresco y la coloración de Gram se evidencian en la tabla 1.

Examen al fresco	Coloración de Gram
	Positiva	Negativa
	N° %	N° %
Positivo	56 38,10	5 3,40
Negativo	6 4,08	80 54,42

Tabla 1. Detección de células-clave. Análisis comparativo entre el examen al fresco y la coloración de Gram.

De las 147 muestras procesadas, en 56 (38,10%), se detectó la presencia de células-clave, tanto por el examen al fresco como con la coloración de Gram; en 6 muestras (4,08%) las células-clave fueron observadas únicamente con la coloración de Gram, y en 5 (3,40%) con el examen al fresco; mientras que en 80 (54,42%) dichas células no se detectaron por ninguna de las dos técnicas utilizadas.

En el gráfico 1 se observa que, del total de muestras procesadas, se obtuvo un 49,66% de cultivos positivos para G. vaginalis (73 cepas); mientras que en el resto de las muestras el cultivo resultó negativo para esta bacteria.

Gráfico 1. Porcentaje de aislamiento de Gardnerella vaginalis a partir de muestras de endocérvix.

La tabla 2 establece la relación entre el examen al fresco y el cultivo para la investigación de G. vaginalis, apreciándose que en 119 muestras (80,95%) hay concordancia entre los resultados del examen al fresco y el cultivo, correspondiendo el 36,05% (53 muestras) a los resultados positivos y el 44,90% (66 muestras) a los negativos. El 13,6% (20 muestras) resultó negativo en el examen al fresco y positivo por cultivo; mientras que en 8 muestras (5,4%), el fresco fue positivo y el cultivo negativo, obteniéndose un 19,05% de discrepancia entre ambos métodos.

Examen al fresco	Coloración de Gram
	Positiva		Negativa
	N°	%	N°	%
Positivo	53	36,05	8	5,44
Negativo	20	13,61	66	44,9

Tabla 2. Análisis comparativo entre el examen al fresco y el cultivo bacteriológico.

La recuperación de G. vaginalis a través del cultivo bacteriológico, comparada con la visualización de las células-clave mediante la coloración de Gram, puede observarse en la tabla 3. De las 147 muestras estudiadas, 58 (39,46%) resultaron positivas y 70 (47,62%), negativas por ambos métodos; sólo en el 12,92% (19 muestras) se observó disparidad en los resultados. El 10,20% (15 muestras) se correspondió con la ausencia de células clave en el Gram y positividad para el cultivo, y en el 2,72% (4 muestras) se detectó la presencia de células clave en la coloración de Gram, pero el cultivo bacteriológico fue negativo.

Examen al fresco	Coloración de Gram
	Positiva		Negativa
	N°	%	N°	%
Positivo	58	39,46	4	2,72
Negativo	15	10,2	70	47,62

Tabla 3. Análisis comparativo entre la coloración de Gram y el cultivo bacteriológico.

La efectividad de los medios de cultivo utilizados (ASH y CA) para el aislamiento de G. vaginalis puede apreciarse en el gráfico 2. De 73 cultivos positivos, 44 cepas (60,27%) se recuperaron a partir de ambos medios de cultivo, 24 (32,88%) crecieron únicamente en CA, y 5 (6,85%) sólo en ASH.

Gráfico 2. Aislamiento de Gardnerella vaginalis. Análisis comparativo entre los medios de cultivo ASH y CA.

El análisis comparativo de los resultados obtenidos del estudio bacteriológico: examen directo (examen al fresco y coloración de Gram) y cultivo, permitió observar que 73 muestras resultaron positivas en el cultivo (49,66%); 61 en el examen al fresco (41,49%) y 62 en el Gram (42,17%). 52 muestras (35,37%) resultaron positivas y 66 (44,90%), negativas por los tres métodos empleados. En 21 de las muestras restantes (14,29%), el cultivo bacteriológico fue positivo, y sólo en 7 de ellas (4,76%) se detectó la presencia de células clave (6 por el Gram y 1 por el examen al fresco). El 5,44% (8 muestras) resultó negativo por cultivo, y en todas se detectó la presencia de células clave por el examen al fresco, mientras que con la coloración de Gram se detectaron sólo en 4 de ellas (2,72%).

Discusión

En este estudio, se procesaron 147 muestras de endocérvix, a partir de las cuales se logró aislar G. vaginalis en 73 (49,66%). Estos resultados coinciden con los reportados por otros autores, lo que nos hace pensar, al igual que otros autores (7, 11, 15), que este microorganismo se aísla por igual de mujeres sanas que de mujeres enfermas (1).

Con la técnica de Gram se detectó la presencia de células-clave en 62 muestras (42,17%) y con el examen al fresco en 61 muestras (41,49%); esto es coincidente con lo reportado por Márquez Dávila y cols.(12), quienes encontraron dichas células en un 47%, discrepando de los resultados de otros autores (16,17), al encontrarlas en un 52% y 54%, respectivamente.

Eschenbach y cols.(2) en su reporte, indican que la identificación de células clave se logra más fácilmente con el montaje húmedo que con la Coloración de Gram, lo cual no se corresponde con este estudio, dado que dichas células se visualizaron en un mayor porcentaje con Gram que con el examen al fresco. A diferencia del examen al fresco, la coloración de Gram permite una mejor evaluación de la flora vaginal, incluyendo morfología microscópica, afinidad tintorial, disposición de las bacterias, una mejor visualización de células-clave y la conservación de los preparados para un examen posterior, demostrando con esto la eficiencia de la coloración de Gram en la identificación de estas células (18).

Varios autores (1, 2, 7, 8, 11, 15) han señalado que el hecho de determinar la presencia de células-clave en muestras provenientes del tracto genital no es indicativo para el diagnóstico de G. vaginalis, y que el examen directo no tiene suficiente sensibilidad y especificidad para sustituir al cultivo en la identificación de dicha bacteria. Compartimos este criterio, debido a que en este estudio se detectó en 14 muestras (9,53%) G. vaginalis por el cultivo, y no se observaron las células-clave, y en 4 muestras (2,72%) no se aisló la bacteria y se detectaron las células. Esto puede ser explicado por las afirmaciones de algunos autores (8,15), quienes afirman que la investigación de células clave produce resultados falsos positivos y negativos. Los falsos positivos se deben a que otras bacterias, además de G. vaginalis, principalmente lactobacilos, pueden adherirse a las células epiteliales, y los falsos negativos pueden resultar de la inhibición de la adherencia de las bacterias a las células epiteliales, provocada por la IgA. Márquez Dávila y cols. (12), reportan un 18,50% de falsos positivos y un 10% de falsos negativos con la coloración de Gram, en tanto que en esta investigación se obtuvo un 2,72% de falsos positivos y un 10,20% de falsos negativos con la misma técnica. Con el examen al fresco, se obtuvo un 5,44% de falsos positivos y un 13,61% de falsos negativos.

El medio CA inhibe totalmente el crecimiento de los bacilos Gram-negativo, parcialmente levaduras, estafilococos y difteroides; mientras que los lactobacilos no son inhibidos. Este medio permitió el aislamiento de G. vaginalis en un 93,15%, es decir, 68 cepas, lo cual es coincidente con lo reportado por Eschenbach y cols.(2), al aislar el microorganismo en un 95% utilizando el medio de cultivo selectivo HBT. La diferencia entre estos dos medios de cultivo es que la colistina que contiene el HBT es sustituida por sulfato de gentamicina en el CA.

El valor del ASH, en general, puede ser mínimo, debido a que G. vaginalis ha sido aislada tan frecuentemente del GC como del ASH en pacientes con vaginosis sintomática. Además, el crecimiento de este microorganismo en ASH no tiene un alto valor predictivo para el diagnóstico de vaginosis; por lo que el uso del ASH para el aislamiento primario e identificación de G. vaginalis no es crítico (19). Discrepamos de este reporte, por el hecho de haber recuperado, en ASH, 49 (67,12%) de las 73 cepas de G. vaginalis aisladas en este estudio. De éstas, 5 cepas (6,84%) se aislaron del ASH. De no haberse utilizado este medio, no habría sido posible lograr el 100% de los aislamientos de este microorganismo.

Al discutir los resultados de los aislamientos obtenidos en el CA y en ASH, se observó una discrepancia en 29 cepas (39,73%), de las cuales 24 (32,88%) se recuperaron únicamente del CA y 5 (6,84%) del ASH. Esta diferencia puede deberse a que algunas cepas de G. vaginalis son inhibidas por los agentes antimicrobianos que contiene el CA.

Debido a la superioridad de la coloración de Gram con respecto al examen al fresco en la visualización de células clave, se recomienda su uso en aquellos casos donde el cultivo bacteriológico no puede realizarse.

Un resultado negativo del examen directo (Fresco y Gram) en la investigación de células-clave no siempre es indicativo de ausencia de G. vaginalis, y un resultado positivo no siempre indica la presencia de dicha bacteria (12, 20, 21); por lo tanto, es conveniente realizar el cultivo bacteriológico, por ser éste el método diagnóstico de mayor sensibilidad y confiabilidad. Se recomienda utilizar un medio selectivo para aumentar las posibilidades de aislamiento de este microorganismo.

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