Evaluación de un ensayo inmunoenzimático para la detección de Helicobacter pylori en muestras de heces

Evaluation of an immunoenzymatic assay for the detection of Helicobacter pylori in stool samples

Urrestarazu, M. I.¹; Serrano, N.¹; Uzcátegui, A.²; Díaz, L.³; Avila, M.⁴; Lunar, M.⁵; Piñero, R.² y Cavazza, M. E.⁴

1. Sección de Microbiología, Instituto de Biomedicina, MSDS-UCV. 

2. Servicio de Gastroenterología, Hospital Vargas de Caracas. 

3. Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Vargas de Caracas. 

4. Sección de Histoquímica, Instituto de Biomedicina, MSDS-UCV. 

5. Servicio de Patología Caracas, Hospital de Clínicas Caracas.

Resumen

    El propósito de este estudio fue evaluar la utilidad de un ensayo inmunoenzimático (HpSA) para la detección de Helicobacter pylori en heces. Se estudiaron 80 pacientes del Servicio de Gastroenterología del Hospital Vargas de Caracas, con indicación de endoscopia digestiva superior, a quienes se tomó muestras de mucosa gástrica para histología, prueba rápida de ureasa, cultivo y sangre para serología. Se consideró infectado cuando el cultivo ó 2 de las otras pruebas eran positivas. Se determinó la presencia de antígenos de Helicobacter pylori en heces mediante la prueba de HpSA, y los resultados se compararon con el criterio de positividad, observándose una sensibilidad de 100% y especificidad de 79%. Estos resultados sugieren que la prueba HpSA es un método no invasor, de fácil realización aunque costoso, útil para el diagnóstico primario de infección por Helicobacter pylori.

Palabras-clave: Helicobacter pylori, heces, ensayo inmunoenzimático, diagnóstico.

Abstract

    The purpose of this study was to evaluate the usefulness of an enzyme immunoassay (HpSA) for detection of Helicobacter pylori in stools. Eighty patients from the Gastroenterology Service of the Vargas Hospital at Caracas with indication of upper digestive endoscopy were studied, taking samples from gastric mucosa for histology, rapid urease test, culture and blood for serology. They were considered infected when the culture or 2 of the other tests were positive. Presence of Helicobacter pylori antigens in stool samples were determined through the HpSA test and the results compared with the positivity determination, finding 100% sensitivity and 79% specificity. These results suggest that the HpSA test, even though expensive, is a non-invasive method, easy to perform and useful for the primary diagnosis of Helicobacter pylori infection.

Introducción

    Helicobacter pylori (H. pylori) es considerado el agente causal de la gastritis crónica, un importante factor en el desarrollo de la úlcera gástrica y duodenal; además, ha sido reconocido como un agente cancerígeno gástrico del grupo I.(1,2,3) En la actualidad se dispone de una variedad de métodos, invasores y no invasores, para el diagnóstico de la infección por H. pylori, cada uno con sus ventajas y desventajas.(4-8) Se ha dado mucha importancia al desarrollo de pruebas no invasoras para el diagnóstico de infección activa que puedan ser usadas en niños, a gran escala, en estudios epidemiológicos, así como también que permitan el seguimiento de pacientes después del tratamiento, para confirmar la erradicación de la bacteria sin recurrir a la endoscopia. La prueba del aliento es una técnica no invasora, tiene alta sensibilidad y especificidad, permite el diagnóstico de infección activa y es útil para comprobar erradicación a las 4 semanas después de terminar el tratamiento; sin embargo, consume tiempo, requiere personal entrenado para la recolección de las muestras, contenedores especiales y equipo costoso para de determinación del C13 o C14, por lo que no está disponible para su uso rutinario.(9-11) La serología es un método sencillo y económico, excelente herramienta para estudios epidemiológicos en población asintomática, pero no es útil para control post tratamiento, por la demora en la caída de los anticuerpos una vez erradicada la bacteria (6 meses a 1 año).(12-14) En los últimos años ha surgido una prueba que investiga la presencia de antígenos de H. pylori en heces; se trata de un ensayo inmunoenzimático (EIE, Premier Platinum HpSA; Meridian Diagnostics Inc., Cincinnati, Ohio, USA), que utiliza anticuerpos policlonales de conejo anti-H. pylori adsorbidos a los micropozos como anticuerpos de captura.(15-17)

    El objetivo de este trabajo fue evaluar la utilidad de la prueba HpSA para el diagnóstico de infección por H pylori, comparándola con histología, prueba rápida de ureasa, cultivo y serología.

Pacientes, Materiales y Métodos

    Se incluyeron en este estudio pacientes que consultaron al Servicio de Gastroenterología del Hospital Vargas de Caracas y tenían indicación de endoscopia digestiva superior para diagnóstico.

    A cada paciente se le tomaron dos fragmentos de mucosa gástrica a nivel del antro, uno para estudio histológico por hematoxilina y eosina y coloración de Giemsa, y otro para la Prueba Rápida de Ureasa mediante agar urea de Christensen preparado en el laboratorio. A un subgrupo se le tomó un tercer fragmento para la realización del cultivo en agar chocolate enriquecido y agar sangre selectivo. En el momento de la endoscopia se tomaron 5 mL de sangre venosa para el estudio serológico, el cual se realizó mediante un ensayo inmunoenzimático cuantitativo (Pyloriset EIA-G, Orion Diagnostica, Espoo, Finland).

    A cada paciente se le pidió una muestra de heces, que fue recolectada en los 3 días siguientes a la endoscopia y fue mantenida a -20°C hasta su procesamiento.

    Criterio de positividad: Se consideraron infectados por H. pylori aquellos pacientes que presentaron el cultivo positivo o dos de las otras pruebas positivas.

    El análisis de las heces mediante la prueba HpSA se llevó a cabo siguiendo las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se colocaron 50 µL de la muestra previamente diluida en los pocillos correspondientes, se agregó 1 gota del anticuerpo conjugado y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. Luego de 5 lavados se añadieron 2 gotas del sustrato a cada pocillo y se incubó por 10 horas a temperatura ambiente; la reacción se detuvo con 2 gotas de solución de parada.

    Se realizó lectura visual y espectrofotométrica a 450 nm. El punto de corte usado fue: <0,140 negativo; 0,140 a 0,159 equívoco y >0,160 positivo. De acuerdo a las recomendaciones del fabricante, los casos equívocos deben ser repetidos, y si persiste el resultado se debe obtener otra muestra. En este estudio los muestras equívocas no se repitieron, de manera que esos pacientes fueron excluidos para el cálculo de sensibilidad y especificidad.

    Todos los pacientes fueron informados y dieron su consentimiento de participar en el estudio.

    Análisis estadístico: La Sensibilidad, Especificidad, Valor Predictivo Positivo y Negativo y su Intervalo de Confianza fueron calculados por métodos estándar.

Resultados

    Entre abril y diciembre de 1999 se estudiaron 80 pacientes (26 M y 54 F), con edades comprendidas entre 24 y 87 años (x47 a). Del total de 80 pacientes estudiados, 64 (80%) fue positivo para H. pylori, de acuerdo a los criterios preestablecidos en este trabajo. En el estudio de antígenos de H. pylori en heces, en 74 muestras se obtuvieron resultados claros de positividad o negatividad, mientras que 6 muestras cayeron en el rango de equívocas (Gráf. 1). El rango de DO de los pacientes positivos fue de 0,144-2,821 (x 0,793), y en los negativos de 0,085-1,303 (x0,110).

    Al comparar los resultados de la prueba HpSA con los verdaderos positivos y negativos, de acuerdo al criterio preestablecido, se observa que HpSA dio 3 falsos positivos y no mostró falsos negativos, siendo la sensibilidad de 100%, la especificidad de 79%, el valor predictivo positivo de 95%, valor predictivo negativo de 100%, con un Intervalo de Confianza de 95% (cuadro 1). Los 3 pacientes falsos positivos por la prueba HpSA presentaron en la serología títulos altos de anticuerpos anti-H. pylori.

    Para confirmar la validez de la lectura visual se comparó ésta con la lectura espectrofotométrica, encontrando una correlación del 99 %.

Cuadro 1. Comparación de la prueba HpSA con los métodos diagnósticosdel criterio de positividad.

* Excluidos para los cálculos.

Sensibilidad: 100%; Especificidad: 79%; Valor Predictivo Positivo: 95%; Valor Predictivo Negativo: 100%; Intervalo de Confianza: 95%

Discusión

Diversos trabajos muestran que el ensayo inmunoenzimático HpSA Premier Platinum es un método no invasor, rápido, fácil de realizar, con alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico primario de infección por H. pylori; no ocurre así para el seguimiento de pacientes después del tratamiento, donde las opiniones son contradictorias.(16-19) En este trabajo se evaluó el kit HpSA para el diagnóstico de infección por H. pylori, encontrándose una sensibilidad y especificidad de 100 y 79%, respectivamente. Esta sensibilidad concuerda con resultados de otros investigadores; sin embargo, la especificidad es ligeramente menor a la reportada en la mayoría de los trabajos publicados (18-23).

A pesar de que hubo tres pacientes falsos positivos, de acuerdo a los criterios de positividad preestablecidos en este trabajo, llama la atención que los 3 pacientes presentaron títulos altos de anticuerpos anti-H. pylori, lo que podría deberse a que por la distribución en parche de la bacteria en la mucosa gástrica, ésta no fue evidenciada por los métodos invasores o a que los pacientes hayan ingerido antibióticos antes a la endoscopia y por la prueba HpSA se detectaron antígenos de bacterias muertas.

La evaluación de la lectura visual mostró un 99% de correlación con la espectrofotométrica, lo cual es importante, ya que podría ser utilizada en laboratorios que no dispongan de lector de ELISA sin pérdida significativa de sensibilidad ni especificidad.

Gráfico 1. Resultados de la prueba HpSA en pacientes infectados y no infectados por H. Pylori.

    Una desventaja de este método, en nuestro medio, es su elevado costo, lo que limita su uso en pacientes de bajos recursos, quienes son los que tienen mayor riesgo de infección.

    En conclusión, consideramos que el HpSA es un método útil para el diagnóstico de infección por H. pylori y que, en la medida que baje su costo, podrá ser ampliamente recomendado. La lectura visual representa una alternativa válida.

    Se requieren estudios para aclarar la utilidad de este método diagnóstico en el seguimiento de pacientes después de tratamiento.

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