Respuesta inmune en paracoccidioidomicosis

Maldonado Lira, B.
Departamento de Micología, Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", Caracas.

Resumen

    La paracoccidioidomicosis (PCM) es una micosis sistémica profunda causada por un hongo dimorfo térmico, Paracoccidioides brasiliensis (Pb). PCM es una de las micosis más importantes en Latinoamérica. Sus manifestaciones clínicas son aquéllas de una enfermedad granulomatosa que envuelve el pulmón, áreas mucocutáneas y otros órganos. La morfogénesis de la reacción granulomatosa desarrollada en la enfermedad no está bien establecida . La inmunidad mediada por células ha sido descrita como el mecanismo de defensa más importante del huésped contra el hongo, pero las formas agudas están asociados con depresión de la inmunidad celular y altos niveles de anticuerpos específicos. La revisión bibliográfica de los aspectos relacionados con la respuesta inmune en paracoccidioidomicosis (micosis sistémica con áreas endémicas en nuestro país) es relevante para profundizar nuestros conocimientos, entender la patogénesis de la misma y los mecanismos que causan la inmunodepresión en las enfermedades crónicas granulomatosas. Este conocimiento nos podría permitir desarrollar en un futuro terapias más eficientes, las cuales ayudarían a los pacientes en la lucha contra este hongo.

Palabras-clave: Paracoccidioidomicosis (PCM), Paracoccidioides brasiliensis (Pb), granuloma.

Immune response in paracoccidioidomycosis

Summary

    Paracoccidioidomycosis (PCM) is a deep systemic mycoses caused by the thermally dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb). PCM is the most important mycosis in Latin American countries. Its clinical manifestations are those of chronic granulomatous disease with involvement of the lung, mucocutaneous areas and other organs. The morphogenesis of granuloma reaction developed in this disease is not well established. Cell mediated immunity has been describe as the most important host defense mechanism against this fungus, but the acute forms are associated with depressed cellular immune response and high level of specific antibodies. The bibliographic survey of the aspect related with the immune response in PCM (systemic mycosis with endemic areas in our country) is relevant in order to increase our knowledge, understood the pathogenesis of the disease and the mechanisms which caused the immunosuppression in the granulomatous diseases. This knowledge allowed develop new and more efficient therapies which could help the patients in the fight against this fungi.

Introducción

    Paracoccidioides brasiliensis (Pb) es un hongo dimorfo térmico cuya fase parasitaria se presenta como una levadura con alto contenido de quitina y alfa-glucanos. La fase micelial contiene proteínas rígidas y una buena proporción de beta-glucanos (1).

    La enfermedad se adquiere por la inhalación de las esporas que se encuentran en el medio ambiente, por lo cual se localiza principalmente en el aparato respiratorio, produciendo enfermedad pulmonar primaria, a menudo asintomática, o puede diseminarse a la mucosa nasofaríngea y ganglios linfáticos. En algunas ocasiones se extiende al tejido cutáneo, o puede ser generalizada, afectando múltiples órganos y sistemas (1, 2).

    La paracoccidioidomicosis (PCM) es una enfermedad endémica, principalmente de las zonas húmedas tropicales y semitropicales de Latinoamérica, desde México hasta la confluencia de los ríos Paraná y Uruguay, zonas caracterizadas por sus relaciones climáticas y biológicas especiales. Su distribución geográfica está limitada por los trópicos de Cáncer y Capricornio. Los casos observados fuera de esta zona provienen de esta faja intertropical. La zona donde se presenta se conoce como la "reservaria" de paracoccidioidomicosis, entre los 30º de latitud Sur y 34º Norte, con precipitación pluvial de 500 a 2.000 mm y altitud de 500 a 2.000 metros (3) y una temperatura media de 18 a 23ºC. La mayor incidencia de la enfermedad se registra en Brasil, aunque también es frecuente en Argentina Colombia y Venezuela.

    Algunos aspectos de la historia natural de la enfermedad son pobremente entendidos. El nicho ecológico de la fase saprofítica es desconocido. La fase micelial, se presume, crece en el suelo, agua y plantas a temperatura ambiente, y se cree es la forma infecciosa (4). El hombre parece ser resistente a la infección por P. brasiliensis, ya que la enfermedad es usualmente observada como casos aislados entre los miembros de una población que está en contacto directo con la naturaleza ambiental, especialmente agricultores y cortadores de madera.

    De hecho, hay discrepancia entre el número de personas expuestas al hongo en las áreas endémicas y el bajo número de pacientes (5). Muchos individuos expuestos desarrollan la enfermedad de forma asintomática.

Figura. Fase levaduriforme de Paracoccidiodes brasiliesnsis.

    La puerta de entrada del hongo es todavía controversial. Se presume que el hongo entra al cuerpo humano por inhalación de la forma micelial, y luego a los pulmones, debido a la temperatura del cuerpo se diferencia en las formas parasitarias, lo cual es un paso fundamental para el establecimiento de la infección. Las levaduras se multiplican en el parénquima, induciendo una respuesta en el huésped caracterizada por un complejo primario, seguida por la formación de granulomas, los cuales pueden permanecer "inactivos" por años o progresar a enfermedad, dependiendo de la respuesta inmune del huésped (4). En vista de la frecuencia de las lesiones mucocutáneas de la región oral y anal, éstas fueron consideradas las principales rutas para la inoculación directa por material contaminado (madera, hojas de plantas y suelo), más que por inhalación (5).

Formas clínicas de la enfermedad:

    Recientemente, un comité internacional de expertos ha propuesto una nueva clasificación de las formas clínicas de la enfermedad (6):

a) Forma aguda o sub-aguda (tipo juvenil), y
b) Forma crónica (tipo adulto).

    La presentación clínica de la enfermedad, ya sea como una micosis sistémica con curso rápido o una micosis localizada con una evolución crónica, depende de muchos factores asociados con la respuesta del huésped, crecimiento del parásito y del ambiente.

    Las presentaciones extremas del espectro, definidos como las formas polares de las micosis, incluye las siguientes:

a) Anérgica o forma maligna: Está caracterizada por una enfermedad diseminada, una respuesta celular deteriorada, altos niveles de anticuerpos específicos, débil inflamación granulomatosa con necrosis y gran número de levaduras en las lesiones.

b) Forma benigna o hiperégica: Está caracterizada por enfermedad localizada, adecuada respuesta celular inmune, bajos niveles de anticuerpos, granuloma epitelioide compacto y ausencia o escasez de levaduras en las lesiones. Entre estas dos formas polares de la enfermedad hay un amplio espectro de manifestaciones clínicas e inmunológicas, que reflejan la resistencia del huésped contra el parásito.

    El diagnóstico clínico de la enfermedad está basado en la demostración de la levadura multigemante en los líquidos biológicos o tejidos. Los tests serológicos, entre ellos la inmunodifusión doble en gel de agarosa, así como la clínica del paciente y los hallazgos radiológicos e histológicos, establecen el diagnóstico.

Mecanismos inmunológicos de defensa del huésped en paracoccidioidomicosis:

Morfogénesis del granuloma en paracoccidioidomicosis.

    Desde el punto de vista de la patología, la respuesta inflamatoria granulomatosa, con la formación de granulomas epiteliodes, es asumida como una respuesta biológica efectiva del tejido, para defenderse de un microorganismo. La evidencia directa e indirecta parece indicar que el granuloma causado por Pb está íntimamente relacionado con la respuesta inmune del huésped. El granuloma de PCM puede representar una respuesta inmune específica del tejido del huésped a Pb, para destruir, bloquear y circunscribir el parásito y prevenir su multiplicación (7). Esta inflamación puede ser predominantemente unida a la inmunidad celular y podría, además, ser conceptualmente clasificada como una reacción de hipersensibilidad del tipo granulomatoso. Evidencia indirecta ha sido obtenida de estudios de granulomas de otras enfermedades infecciosas, tales como tuberculosis, sífilis, lepra y otras micosis profundas, para lo cual la naturaleza celular inmune ha sido demostrada (8). Franco et al. (9) usaron un modelo in vitro para estudiar la formación del granuloma. Estos datos pueden ser extrapolados por analogía al granuloma de PCM. Los antígenos fúngicos causan la aparición de linfocitos T sensibilizados en el huésped, y se concentran en el sitio de interacción con el parásito. Una vez estimulados, estos linfocitos comienzan a sintetizar y liberar diferentes linfoquinas mediadoras de la respuesta inmune celular.

    Posteriormente se observan alteraciones, tales como edema local y vasodilatación; activación de los macrófagos, con su diferenciación y maduración a células epitelioides; activación de los fibroblastos, con incremento de la síntesis de colágeno; y multiplicación de los linfocitos locales. Las linfoquinas amplifican la capacidad local para defender mediante la formación de los principales componentes del granuloma epitelioide, incluyendo acumulación de macrófagos activados y células epitelioides; fusión de macrófagos, con formación de células gigantes multinucleadas; fibrosis; e infiltrado de linfocitos (1). Esta respuesta del tejido puede envolver al hongo localizado en el espacio intercelular o en el citoplasma del macrófago dentro del granuloma. La reacción inflamatoria puede ser eficiente y destruir al agente. Si el agente o su antígeno persisten, la inflamación es mantenida y el parásito puede ser encontrado en grandes cantidades en las lesiones. El hongo puede ser también encontrado en el centro del granuloma, o puede superar la barrera inflamatoria y difundir hacia los tejidos circundantes, con la formación de un nuevo foco. Estudios realizados tanto en humanos como en animales, en los cuales se ha producido infección experimental, han señalado que el granuloma paracoccidioidal está relacionado con una respuesta inmunológica del huésped. Fava Netto (10) fue el primero en señalar el hecho, cuando clasificlasificó las formas clínicas de las micosis en dos tipos, usando el criterio de la respuesta inmunológica del paciente. Un tipo era caracterizado por infección benigna localizada, con persistente respuesta celular inmune, y desde el punto de vista histopatológico mostraban un granuloma epitelioide con pocas células fúngicas. La otra forma clínica era representada por una infección maligna anérgica difusa, con pérdida de la inflamación granulomatosa, mostrando extensas áreas de necrosis y gran número de células fúngicas con brotes. Recientemente, estas dos formas clínicas fueron redefinidas y clasificadas como los polos hiperérgicos y anérgicos de la enfermedad, respectivamente (11). Estas dos formas reactivas han sido reproducidas experimentalmente en un modelo animal, hamster, en el cual se observó una aguda correlación inicial entre la enfermedad localizada y la integridad de la respuesta celular y los granulomas compactos conteniendo pocas células fúngicas. 10 a 12 semanas después de la infección se observó diseminación sistémica, depresión de la respuesta inmune celular y granulomas ricos en células fúngicas gemantes (12). Este modelo experimental es relevante en la patogénesis de la enfermedad desde que la inmunocompetencia era demostrada, la cual era normal al comienzo de la infección, y era perdida durante el curso de la enfermedad, a través de un mecanismo desconocido. Este punto es todavía debatido en los humanos, ya que se ha observado que después del tratamiento los pacientes recuperan parcialmente la respuesta inmune celular (13), sugiriendo que ellos desarrollaron primero la micosis a causa de una predisposición, la cual puede estar relacionada con una respuesta celular empeorada genéticamente. La persistencia de la depresión de la respuesta celular inmune después del tratamiento puede favorecer la recaída, la cual es una marca de esta micosis. La correlación entre la respuesta inmune, el patrón de las lesiones granulomatosas en los pulmones y las alteraciones de las estructuras de las células linfoides del bazo fueron estudiadas por Soares et al. (14), inoculando ratones suizos por vía intravenosa con la cepa 18 de Pb . Los animales fueron evaluados a las 24, 48 y 96 horas después de la infección y evaluados semanalmente por 18 semanas, a través de test de inhibición de migración de macrófagos con fitohemaglutinina (PHA) y antígeno de Pb (PbAg), además de la histopatología del pulmón y del bazo.

    Adicionalmente, un grupo de animales era irradiado (radiaciones g) e infectados en las mismas condiciones y evaluados por el patrón de las lesiones granulomatosas del pulmón y las estructuras linfoides del bazo a las 24, 48 y 96 horas después de la infección. Durante la primera semana de infección, los animales no radiados presentaron una respuesta positiva a PHA y PbAg, se observaron granulomas compactos en el pulmón e hiperplasia de la pulpa blanca del bazo. Sin embargo, a partir de la segunda a quinta semana después de la infección se observó depresión de la inmunidad mediada por células (IMC) para responder a PHA y PbAg en asociación con granulomas, los cuales sólo presentaron gran cantidad de células mononucleares, careciendo ambos de células gigantes, y un halo pequeño de células mononucleares. Este patrón de formación de granuloma era similar a los vistos en los animales radiados cuyas células envueltas en la IMC estaban ausentes.

    Después de la semana 7, los animales no irradiados mostraron granulomas caracterizados por la presencia de células gigantes y un pequeño halo periférico de células mononucleares. Este tipo de granuloma era formado al mismo tiempo que se recuperaba la IMC y las estructuras linfoides del bazo. Estos resultados mostraron una correlación entre la composición del granuloma de grandes células mononucleares hipoplasia del tejido esplénico y una deteriorada IMC. Esta correlación observada también indicó que la morfogénesis del granuloma per se no depende de la activación de la IMC. Esta respuesta es importante para estadíos posteriores durante la modulación de la composición celular de los granulomas.

    El granuloma de Pb contiene diferentes células efectoras: células naturales asesinas, células T citotóxicas, neutrófilos activados, macrófagos activados, células epitelioides, células gigantes y células B. Sin embargo, existe controversia acerca del papel de los eosinófilos como células efectoras. Para algunos autores, los eosinófilos (Eo) sí son considerados células efectoras, las cuales, en presencia de un anticuerpo o el complemento, son capaces de matar parásitos y han sido asociados con la defensa inmune contra helmintos. El rol de los eosinófilos en la respuesta inmune a hongos no ha sido bien estudiado. Los Eo contienen varias proteínas catiónicas, incluyendo la proteína básica mayor (MBP), neurotoxina derivada de los Eo (EDN), proteína catiónica eosinófila (ECP) y peroxidasa eosinófila (EPO). La proteína básica mayor es tóxica para los helmintos y células de mamíferos y bacterias in vitro, y es capaz de activar basófilos, mastocitos y plaquetas. Wagner et al. (15) postularon la hipótesis de que los infiltrados eosinofílicos y la degranulación ocurrían en tejidos de pacientes con PCM, y usando una técnica de inmunofluorescencia estudiaron las biopsias de tejidos de nueve pacientes, los cuales habían sido tratados con diferentes antifúngicos y habían respondido bien al tratamiento. Usando anticuerpos monoclonales y policlonales contra la MBP, todas las biopsias mostraron un infiltrado intacto de MBP, junto con la presencia de Pb. Además, usando anticuerpos policlonales contra MBP, las nueve biopsias reportaron depósitos extracelulares de MBP. Estas observaciones permitieron soportar la hipótesis de que los Eo, a través de los gránulos proteicos tales como MBP, participan en la patogénesis de PCM.

Respuesta inmune celular y humoral en paracoccidioidomicosis:

    Aunque muchos investigadores han descrito la participación de la inmunidad mediada por células como el mecanismo más importante en la defensa contra el hongo, las formas agudas de la enfermedad están asociadas con una depresión de la respuesta inmune celular, altos niveles de anticuerpos específicos (9) y disfunción de las células asesinas naturales (NKC).

    La respuesta humoral a la estimulación antigénica es producir anticuerpos específicos; estos anticuerpos son muy útiles en el diagnóstico de la enfermedad, así como también para monitorear la evolución de la enfermedad en respuesta al tratamiento. Ha sido reportado en la literatura que los pacientes con paracoccidioidomicosis no tienen deficiencias en la producción de anticuerpos, encontrándose altos niveles en el suero de IgG, IgE e IgA, lo cual caracteriza una activación policlonal del sistema. Por otra parte, ha sido demostrado que los niveles de IgE e IgG están incrementados en las formas clínicas severas de la enfermedad o en la formas diseminadas. Los anticuerpos específicos contra P. brasiliensis muestran el mismo patrón de conducta, interpretándose como resultado de una deficiencia en los mecanismos inmunorreguladores, representados por una hiporeactividad de las poblaciones de células T (16).

    Los anticuerpos contribuyen a la protección del organismo contra el parásito, a través de mecanismos tales como la opsonización y la inhibición de la adherencia del parásito a las células del huésped. Niveles elevados de anticuerpos parecen estar relacionados con un incremento de la actividad de los neutrófilos asociados con la fagocitosis del hongo.

    El mismo fenómeno ha sido observado con los macrófagos peritoneales en el ratón. Esta actividad era observada en suero inactivado por calor (ausente de complemento), pero más intensa en suero fresco. Estos resultados indican claramente que los anticuerpos ejercen una importante acción de opsonización, lo cual es potenciado por el sistema del complemento. Estos datos indican que los anticuerpos circulantes atacan in vitro las formas levaduriformes del hongo, activando el sistema del complemento y precipitando la muerte de la célula fúngica.

    Estudios realizados seleccionando ratones que produjeran niveles bajos y altos de anticuerpos permitieron estudiar el rol de los anticuerpos en las defensas del organismo. Los ratones fueron inoculados por vía intraperitoneal. En aquéllos que producían bajos niveles de anticuerpos se observó diseminación de la enfermedad y un 30% de aumento en la rata de mortalidad. El número de sobrevivientes se elevó cuando les fue transferido líquido ascítico rico en anticuerpos (3). La combinación de los anticuerpos con antígenos específicos, tanto a nivel de la circulación como en el intersticio, facilita la neutralización y eliminación del hongo; sin embargo, estos complejos antígeno-anticuerpo formados pueden no ser deseados, ya que se depositan en los tejidos y pueden causar daño, por activar el complemento (hipersensibilidad a complejos tóxicos) o por actuar como inmunosupresivos. Estos complejos han sido detectados en el suero de pacientes con paracoccidioidomicosis, con correlación positiva entre los niveles de complejos inmunes, la actividad de la enfermedad y la depresión de la inmunidad celular. La función inhibitoria de los complejos sobre los linfocitos T puede ser directa, a nivel del sistema efector, o indirecta, por la supresión de células efectoras.

    Cuando el hongo invade los tejidos, los antígenos del hongo interactúan con el sistema inmune del huésped, y causan una respuesta inmune, la cual tiene una influencia fundamental sobre el resultado de la infección. Aún cuando la respuesta inmune celular y humoral tiene funciones específicas e independientes, su interacción garantiza la supervivencia del huésped.

    El principal componente antigénico de P. brasiliensis es una glicoproteína de 43 Kd (gp43). GP43 se une a la pared y participa en la adhesión, invasión y patogénesis del hongo (17). Anticuerpos (anti-gp43) dirigidos contra este antígeno son detectados en el suero de todos los pacientes con paracoccidioidomicosis (15). Jerne (18) postuló la hipótesis de que los anticuerpos idiotípicos podrían tener influencia en la inmunorregulación. De acuerdo a la hipótesis de Jerne, los receptores de antígeno de los linfocitos (Igs, o células B y receptores células T) expresan determinantes antigénicos, los cuales son potencialmente inmunogénicos. Ejemplo: la respuesta celular y humoral en un individuo puede ser inducida contra los receptores antigénicos expresados por los linfocitos en un mismo individuo. Estos determinantes antigénicos son conocidos colectivamente como idiotípicos. La teoría de Jerne predijo que los anticuerpos antiidiotípicos (Ab2) llevan la imagen interna del correspondiente antígeno y son capaces de inducir inmunidad para el antígeno original en huésped no expuestos con anterioridad (19, 20, 21). Ha sido sugerido que la respuesta inmune puede ser modulada a nivel de reconocimientos de determinantes de idiotipo vía idiotipo-antiidiotipo. Hay evidencia sustancial que indica que los anticuerpos antiidiotípicos son componentes normales de la respuesta inmune; su significado y su regulación no están claros todavía. Los anticuerpos antiidiotipos (anti-IdAB2) están presentes también en el suero de ratones inoculados con Pb, como fue demostrado por Souza et al. (17).

Souza y colaboradores demostraron que:

a) los anticuerpos anti-idiotípicos (Ab2) pueden ser detectados en el suero de pacientes con altos títulos de anti-gp43;

b) los anticuerpos Ab2 tienen una función moduladora, y reconocen específicamente el idiotipo de algún anticuerpo monoclonal de murino anti-gp43, pero no otros;

c) los títulos de Ab2 están relacionados con las formas clínicas de la enfermedad. La mayoría de los pacientes con formas agudas de PCM tienen altos títulos de Ab2 (88%; n=8); sin embargo, entre los pacientes con las forma crónicas multifocal de la enfermedad, sólo el 29% (n=14) tienen altos títulos de Ab2; el 70% (n=10) de pacientes con la forma crónica unifocal tiene bajos títulos de Ab2.

d) La correlación entre los títulos de Ab2 y los anti-gp43 era observada antes y durante el tratamiento antimicótico. Estos resultados sugieren que los anticuerpos anti-idiotípicos están relacionados con la severidad de la PCM en humanos.

    Recientes estudios han demostrado que el curso de la PCM está bajo el control genético, y que un gen autosómico dominante controla la resistencia o la susceptibilidad a la enfermedad. Se asume que los ratones resistentes podrían llevar un gen resistente (Pbr). La respuesta inmune es dirigida a la activación de Th1, el cual subsecuentemente resolverá la enfermedad. Por otra parte, los ratones susceptibles, los cuales llevan un gen Pbs, podrían incrementar la respuesta inmune tipo Th2, llevando a la enfermedad progresiva (7,8) . Ratones A/Sn inoculados por vía intraperitoneal son resistentes a la infección fúngica, mientras que los ratones B10.A son sensibles, y la infección resulta en una enfermedad fatal.

    Vilani-Moreno et al (23) estudiaron la PCM pulmonar, reproduciendo la enfermedad en ratones susceptibles (adultos suizos) y resistentes (BALB/c) a la PCM, a través del análisis del lavado broncoalveolar. La infección pulmonar era progresiva en los ratones suizos y regresiva los ratones BALC/c. Éstos presentaron una infección activa en la fase inicial, lo cual indicó que estos animales sentaban tempranamente mecanismos de resistencia.

    Souto et al (24) investigaron el rol del IFNg el y factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a) en la resistencia a P. brasiliensis. Para ello infectaron con la fase levaduriforme de Pb ratones GKO (presentan homológa disrupción del IFN-g), ratones P55KO (receptores de TNF-a) y ratones silvestres. Los ratones GKO y los P55KO sucumbieron a la infección en los días 16 al 90 después de la infección, respectivamente, mientras los ratones silvestres no sucumbieron. Granulomas inflamatorios típicos fueron encontrados sólo en los ratones silvestres. Por el contrario, los ratones knockout presentaron un infiltrado inflamatorio compuesto de pocos neutrófilos, células mononucleares, epitelioides y células gigantes multinucleadas, formando granulomas incipientes en los ratones GKO y sin formación de granuloma en los ratones P55KO. Por otra parte, ambos grupos de ratones knockout exhibieron un número elevado de levaduras, de acuerdo al contaje de las UFC en los órganos. Comparados con los ratones silvestres, los esplenocitos de los ratones GKO cultivados con la fracción F1 del Pb produjeron bajos niveles de TNF-á, mientras que los leucocitos de los ratones P55KO produjeron cantidades similares de TNF-a, pero altos niveles de INF-g. Sin embargo, los esplenocitos de los ratones silvestres infectados produjeron altos niveles de óxido nítrico, resultando en una baja respuesta proliferativa de células T a Con A, a diferencia de los ratones silvestres no infectados o a los GKO o P55KO. Por el contrario, la adición de IFN-ã a los esplenocitos de los ratones GKO infectados resultaron en una alta producción de óxido nítrico y una baja proliferación de células T. Estos descubrimientos sugieren que le TNF-a endógeno, actuando a través del receptor P55 y el IFN-g, media la resistencia a la infección con Pb e induce la producción de óxido nítrico, que determina células T marcadas insensibles.

    González et al (25) han señalado la importancia de la producción de ON por macrófagos estimulados por linfoquinas. El sistema fagocítico mononuclear constituye un importante mecanismo efector en la respuesta inmune natural y adaptativa contra muchos patógenos. Kashino y colaboradores (26) sugirieron que los macrófagos juegan un papel fundamental en la resistencia a Pb. Estudios previos han demostrado que los macrófagos peritoneales de murinos activados por el INF-g ejercen un efecto fungicida, tanto en la fase levaduriforme como en la fase micelial de Pb. Estos descubrimientos también sugieren que las citoquinas, especialmente INF-g juegan un papel importante como mecanismo de resistencia en la PCM. Macrófagos activados por IFN-g , TNF-a o lipopolisacáridos producen dos tipos de productos reactivos, caracterizados por su actividad citotóxica: intermediarios reactivos del oxígeno e intermediarios reactivos del nitrógeno (RNI) (27, 28). El óxido nítrico, uno de los más importantes RNI, es generado por la oxidación de uno de los nitrógenos en el aminoácido L-arginina. La sintetasa oxido nítrico inducida (iNOS) es responsable por la producción de óxido nítrico, y está envuelta en la inflamación y en la infección (29). No hay evidencia de que los macrófagos iNOS puedan ser expresados sin la intervención previa de las citoquinas, tales como el INF-g y productos microbianos tales como lipopolisacáridos. Modelos experimentales han demostrado que el ON es responsable del efecto citotóxico ejercido sobre una variedad de hongos como C. neoformans, H. capsulatum y la fase micelial de C. albicans; sin embargo el óxido nítrico no parece estar envuelto en la actividad fungicida de los macrófagos alveolares humanos o murinos contra otros hongos, tales como las conidias de A. fumigatus. González et al (30) estudiaron la participación del óxido nítrico como mecanismo fungicida por macrófagos activados con INF-gamma. En su estudio demostraron que las citoquinas inducen a la producción de óxido nítrico por macrófagos, los cuales inhibieron la transformación de conidias a levaduras.

    También demostraron que la adición de anticuerpos monoclonales anti-INF-g revertían este efecto inhibitorio, resultando en un bloqueo de la producción de óxido nítrico, además de que los macrófagos activados por el INF-g recombinante ejercían una importante actividad fúngica contra Pb, como fue demostrado por una reducción significativa de las UFC, en comparación con el control de macrófagos no activados. Por otra parte, el tratamiento con cualquiera de los inhibidores del óxido nítrico y bloqueadores de la síntesis del mismo revierten la inhibición de la transformación de conidias a levaduras. Los resultados obtenidos por González et al. (30) permitieron confirmar el papel fundamental del IFN-g en la PCM, como ha sido demostrado por otros grupos (31, 32). Las citoquinas parecen ser el mayor mediador de la respuesta contra las infecciones de Pb en ratones, promoviendo la actividad fúngica de los macrófagos a través de la producción de óxido nítrico. En humanos y en la PCM experimental, muchos descubrimientos sugieren que los macrófagos activados por las células T juegan un importante rol en la resistencia del huésped a Pb. Cuando el hongo ingresa al huésped, éste tiene que interactuar con varias células efectoras (macrófagos, leucocitos polimorfonucleares y monocitos), y colonizará al huésped si resiste los mecanismos microbicidas.

    Muchos investigadores han estudiado la interacción de células efectoras humanas y de murinos con las fases tanto levaduriforme como micelial de Pb. Sobrenadantes de células de bazo estimuladas con un mitógeno (ConA) o rIFN-g, y que contenían linfoquinas, activaron los macrófagos peritoneales y presentaron una potente actividad fúngica contra Pb. Así mismo, la actividad fungicida de monocitos humanos tratados con citoquinas, sobrenadantes de células mononucleares estimuladas con ConA, y cocultivadas con el Pb; éstos inhibieron la multiplicación del hongo, no así el control de monocitos.

    Bocca et al. (33) también demostraron que la producción de óxido nítrico por macrófagos activados actuaban en contra el Pb, lo cual sugirió que el ON es importante para la eliminación del hongo. Sin embargo, ha sido reportado que durante el curso de la infección con Pb, el ON induce inmunodepresión, manifestado por depresión de la respuesta proliferativa de las células del bazo y una disminución de la expresión antigénica Ia, lo cual también ha sido reportado por Macmicking et al. (29), quienes determinaron que el ON influye sobre los macrófagos de ratón, restringiendo la expansión de células T, lo cual es importante para determinar si in vivo el ON juega un rol de protección en PCM.

    Estos estudios han revelado que macrófagos murinos activados con INF-g eliminan las conidias de Pb a través del mecanismo oxidativo del ON dependiente de la L-arginina, demostrándose que el efecto de reversión de conidia a levadura no se producía cuando se inhibía la síntesis de ON por adición de arginasa, sal de Ng-monometil-L-arginina acetato (LNMMA) o sal de aminoguanidina hemisulfato (AG). A nivel de los alvéolos pulmonares, el ON no parece estar envuelto en la actividad fungicida contra las conidias de Pb (34). Los resultados sugieren que, aunque el ON es importante para eliminar el hongo, la activación de la producción de ON en la infección por Pb contribuye a la aparición de la inmunosupresión observada durante el curso de la infección.

    Kashino et al. (35) investigaron, durante la infección intraperitoneal de ratones susceptibles (B10.A) y resistentes (A/Sn) con Pb, la secreción de INF-g, (IL-2), IL-4, IL-5, e IL-10 por células nodo linfoide, estimuladas por antígeno, maduración de Eo y los isotipos de Ac. Células del nodo linfoide de ratones resistentes produjeron tempranamente niveles sostenidos de INF-g e Il-2, mientras que los animales susceptibles secretaron bajas cantidades o no detectables de este tipo 1 de citoquinas. Ambas cepas de ratones presentaron tardía y transitoriamente producción de IL-4, mientras que la IL-10 era producida constantemente a través del curso de la enfermedad. Los animales resistentes produjeron niveles altos de IL-5 en la fase crónica de la infección (a partir de la semana 8), mientras que los animales susceptibles mostraron 2 picos de producción de IL-5, a la primera y en la semana 12 . Sólo los ratones susceptibles presentaron concomitantemente eosinofilia esplénica y medular y un aumento de la producción de IL-5. En los ratones resistentes, los niveles de anticuerpos de IgG2a fueron significativamente más altos que aquéllos observados en los ratones susceptibles, los cuales preferencialmente secretaron isotipos IgG2b e IgA. Estos resultados demuestran que la producción sostenida de INF-g e IL-2, y la secreción predominante de anticuerpos IgG2a, están asociados con resistencia a Pb. En contraste, la producción de niveles bajos de INF-g, secreción temprana de altos niveles de IL-5 e IL-10, eosinofilia e IgA caracterizan la enfermedad progresiva en los animales susceptibles. Kashino y colaboradores determinaron que la resistencia a la infección a Pb está unida a una respuesta inmune preferencial Th1, mientras que la susceptibilidad está asociada a la ausencia de producción de INF-g .

    Gesztesi et al. (36) estudiaron los ratones susceptibles (B10.A) y resistentes (A/Sn), inoculándolos por vía subcutánea con Pb, con la finalidad de estudiar la respuesta inmune y la respuesta inflamatoria y determinar si la evolución de la infección por vía subcutánea estaba bajo control de los neutrófilos. En ambos ratones, los eventos celulares tempranos estuvieron caracterizados por un marcado infiltrado neutrofílico, que resultó ser más prominente en los ratones B10.A. Una característica peculiar de los ratones modelos fue que las inoculaciones subcutáneas del hongo, tanto en la cepas resistentes (A/Sn) como en los susceptibles (B10.A), no fue diseminada. Por otra parte, la respuesta inmune específica de estos ratones a los Ag fúngicos también presentó diferencias relevantes. Los ratones A/Sn produjeron bajos niveles de Ab específicos y una exuberante DTH a los Ag fúngicos, mientras los ratones B10.A respondieron con altos títulos de Ab específicos y una reacción DTH baja a los Ag. Otra de las observaciones realizadas por Gesztesi et al. fue que la depresión de los neutrófilos antes de la infección influyó directamente en el curso de la respuesta inflamatoria en ambos ratones, pero no modificó el tamaño de las lesiones.

    En ambas cepas de ratones se observó una depresión neutrofílica, disminución de la respuesta DTH y un incremento en el número total de títulos de anticuerpos gp4. El incremento significativo de la carga fúngica en las lesiones vistas en los ratones nude indica que la lesión misma limitada evocada por la inoculación fúngica vía subcutánea es un fenómeno dependiente de las células T.

    Cano et al. (37) estudiaron el rol de los linfocitos CD8+ en el curso de la PCM, usando como modelos los ratones sensibles B10.A y resistentes A/Sn, y tratando a ambos con anticuerpos monoclonales anti-CD8+, lo cual causó una depresión selectiva de células CD8+ en el pulmón y en el bazo. A nivel del pulmón, el número de células CD4+ y células inmunoglobulinas positivas era independiente del número de células CD8+. En los ratones susceptibles, la pérdida de las células CD8+ por un tratamiento in vivo con anticuerpos monoclonales anti-CD8+ empeoró el clearence de levaduras de los pulmones e incrementó la diseminación fúngica en el hígado y en el bazo. El mismo tratamiento en los ratones resistentes incrementó la diseminación fúngica a los tejidos extrapulmonares, pero no alteró la carga fúngica pulmonar. Además, la depresión de las células CD8+ no modificó las reacciones de DTH en los ratones resistentes, pero incrementó estas reacciones en los ratones sensibles. La producción de anticuerpos específicos contra Pb en los ratones susceptibles y resistentes con depresión de células T CD8+ era similar a los ratones control de anticuerpos. Histopatológicamente, la depresión de células T CD8+ no desorganizó las lesiones granulomatosas focales desarrolladas por ambas cepas de ratones.

    Varios estudios han mostrado que el rol de los linfocitos T CD8+ en la respuesta inmune puede ser de protección, supresión o justamente inocuo, dependiendo del organismo infectado y de las características genéticas del huésped. Estos resultados indican que las células T CD8+ son necesarias para el clearence óptimo del hongo en los tejidos de los ratones infectados con Pb, y demuestra una actividad de protección y control de la diseminación del hongo a los tejidos extrapulmonares en ambas cepas de ratones. Estas células parecen jugar un rol en suprimir las reacciones de DTH en los ratones susceptibles, pero muestran un efecto insignificante en el patrón de las lesiones pulmonares, así como también en la producción de anticuerpos específicos para ambas cepas de ratones.

Conclusiones

    Se han revisado trabajos relacionados con la respuesta inmune, utilizando como modelo animal el ratón. Ratones nude, B10.A , A/Sn, sensibles y resistentes a la infección con Pb respectivamente, ratones silvestres, knockout y otros han sido empleados para estudiar la respuesta inmune en la Paracoccidioidomicosis. Está bien establecido que, en los ratones, la resistencia o la susceptibilidad a la enfermedad está bajo estricto control genético.

    Como ha sido conocido desde hace mucho tiempo, la ruta de inoculación influye en el resultado de la respuesta inmune; los mecanismos básicos que determinan esta diferencia son pobremente entendidos. Basados en esta premisa, la investigación de la infección del Pb por diferentes rutas de inoculación puede proveer información que podría clarificar los mecanismos que refuerzan las condiciones de adaptación, los cuales pueden o no resultar en el estado de parasitismo. He aquí el porqué los investigadores han empleado diversas vías de inoculación: intratraqueal, subcutánea, intraperitoneal, nasal y otras. Como en otras micosis profundas, la inmunidad mediada por células ha sido descrita como el mecanismo de defensa más importante contra Paracoccidioides brasiliensis; sin embargo; las formas agudas de la enfermedad están asociadas con una depresión de la respuesta inmune celular, altos niveles de anticuerpos específicos y disfunción de las células asesinas naturales (NKC).

    Como fue mencionado anteriormente, la inmunidad a Pb parece ser estrictamente un fenómeno mediado por células. Las células fagocíticas son importantes, pero parecen no ser capaces de eliminar el Pb, a menos que sean activados por el INF-g. La típica formación del granuloma, con células T formando un manto periférico alrededor de agregados de macrófagos, como es observado en otras enfermedades donde la protección conocida es mediada por células, es vista en secciones patológicas de paciente inmunocompetentes. Los macrófagos centrales son rápidamente transformados en células epitelioides. Citoquinas, TNF y enzima convertidora de angiotensina han sido detectadas en altos niveles en la sangre de pacientes con PCM. Lípidos u otros componentes citoplasmáticos de Pb pueden ser responsables de iniciar los granulomas.

    Es claro que la inmunidad mediada por células (IMC) es una parte integral del proceso de la enfermedad durante las infecciones crónicas en humanos o en modelos animales. Una serie de anormalidades, no todas directamente relacionadas con la IMC, han sido descritas en pacientes con esta enfermedad.

    Éstas incluyen: incremento del número de células CD8+ y células naturales asesinas (NKC); activación de células policlonales B, permitiendo un incremento de los niveles de IgG, IgE e IgA; reducción del número total de linfocitos T; anergia cutánea a los antígenos de Pb; y, finalmente, deterioro de la habilidad de los linfocitos de responder a ensayos in vitro .

    Si conocemos los mecanismos de comunicación y regulación del sistema inmune, y se toman en consideración la respuesta inmune positiva y negativa, podrían desarrollarse útiles modificaciones de la respuesta inmune biológica. Estos modificadores podrían alterar la respuesta del huésped durante la infección (inmunoterapia) o inducir una respuesta protectiva (inmunoprofilaxis).

Bibliografía:

1. Rippon, W. J.: Tratado de Micología Médica. Editorial Interamericana Mc Graw-Hill. 3ª. Edición, 1990.        [ Links ]

2. Edouard K.: Editor. Marcel Dekker, Inc, New York and Basel, 1989.        [ Links ]

3. Arenas, R.: Micología Médica Ilustrada. 1ª Edición. Editorial Interamericana McGraw-Hill, 1993.        [ Links ]

4. Franco, M.: Host-parasite relationship in Paracocccidioidomycosis J. Med and Vet. Mycology. 25: 5-18, 1986.        [ Links ]

5. Domer et al.: Immunodulation in the mycosis. J. Med and Vet. Mycology. Supplement 1: 159-161, 1992.        [ Links ]

6. Montenegro, M. R. G.: Formas clínicas da Paracoccidioidomicosis . Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo.28: 203-204, 1986.        [ Links ]

7. Brito T. and Franco M.F.: (Granulomatous inflammation. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, 36: 185-192, 1994.        [ Links ]

8. Adams, D. O: The granulomatous inflammatory response. American Journal of Pathology. 84: 164-191, 1976.        [ Links ]

9. Guimares Franco, M. V.; Miranda Goes, A.; Cota Kouri, M.: Model of in vitro granulomatous hypersensitivity in humans Paracoccidioidomycosis. Mycopathologia, 137:129-136, 1977.        [ Links ]

10. Fava Netto: Contribuicão ao estudio inmunológico da blastomicose de Luzt (blastomicose sud-americana). Revista do Instituto Adolfo Luzt. 21: 99-194, 1961.        [ Links ]

11. Lacaz , C. S.; Zamith,V. A.; Del Negro, G. e Siquiera, A. M.: Aspectos clinicos gerais. Formas polares da paracoccidioidomicose. Particularidades clìnicas infanto-juvenis Paracoccidioidomicose. Edit. Fiorillo: 141-147, 1982.        [ Links ]

12. Peracoli, M. T. S.; Mota, N. G. S. and Montenegro, M. R.: Experimental Paracoccidioidomycosis in the Siriam hamster. Morphology and correlations of lesions with humoral and cell-mediated immunity . Mycopathología. 79, 7-17, 1982.        [ Links ]

13. Restrepo,A.; Restrepo, M. and Restrepo, F.: Immune Response in Paracoccidioidomycosis. A controlled study of 16 patients before and after of treatment. Sabouradia, 16: 151-163. 1978.        [ Links ]

14. Soares, M. T. C.; Peracoli and R. R. Dos Santos: Correlations among immune response, morphogenesis of the granulomatous reactions and spleen lymphoid structure in murine experimental Paracoccidioidomycosis. Medical Mycology. 38: 371-377, 2000.        [ Links ]

15. Wagner, J. M. and Franco, M.: Localization of Eosinophil granule mayor basic protein in Paracoccidioidomycosis lesions. 59(1): 66-72. American Journal Trop. Med. Hygiene. 59(1): 66-72, 1998.

16. Arango, M. and Yarzábal, L.: T-cell dysfunction and hyperimmunoglobulinemia E en Paracoccidioidomycosis. Mycopathologia. 79: 115-124, 1982.        [ Links ]

17. Souza, A. R.; Gesztesi, J. Z.; Moraes, C. R. B.; Cruz, J.; Sato, M.; Mariano, M. and Lopes, J. D.: Evidence of idiotypic modulation in the immune response to gp43, the major antigenic component of Paracoccidioides brasiliensis in both mice and humans. Clin Exp. Immunol, 114: 40-48, 1998.        [ Links ]

18. Jerne, N. K.: Towards a network theory of the immune response. Ann. Immnunology. 125: 373-389, 1974.        [ Links ]

19. Gleich, G. J.; Frigas, E.; Loegering, D.A.; Wasson, D. L. and Steinmuller, D.: Citotoxic properties of the eosinophil major basic protein. Journal Immunology 123: 2925-2927, 1979.        [ Links ]

20. Lehrer, R. I.; Szklarek, D.; Barton, A.; Ganz, T.; Hammann, K. J. Gleich.: Antibacterial properties of eosinophils cationic protein (ECP). Journal immunology 142: 4428-4434. 1989.        [ Links ]

21. Souza, A. R.; Gesztesi, G. M. et al.: Anti-idiotypic Antibodies in Patients with Different Clinical Forms of Paracoccidioidomycosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 175-181, 2000        [ Links ]

22. Paracoccidioidomycosis. J. Med. and Vet. Mycology. Supplement 1: 59-71, 1992.        [ Links ]

23. Vitali-Moreno, F.; Fecchio, D. et al.: Study of Pulmonary experimental Paracoccidioidomycosis by analysis of bronchoalveolar lavage cells: Resistant vs. Susceptible mice. Mycopathología 141: 79-91, 1998.        [ Links ]

24. Souto, T. J.; Figueiredo, A.; Pfeffer, K. et al.: Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha determine resistence to Paracoccidioides brasiliensis. American Journal of Pathology. 156: 1811-1820, 2000.        [ Links ]

25. González, A.; De Gregory, W. et al.: Nitric Oxide participation in the Fungicidal Mechanism of Gamma Interferon-Activated murine Macrophages against Paracoccidioides brasiliensis Conidia. Infection and Immunity. 2546-2552, 2000.        [ Links ]

26. Kashino, S.; Fazioli, R.; Moscardi-Bacchi, M.; Franco, M.; Singer-Vermes, L.; Burger, E. and García, V.: Effect of macrophage blockade on the resistance of inbred mice to Paracoccidioides brasiliensis infection. Mycopathología 130: 131-140, 1995.        [ Links ]

27. Drapier, J.; Wietzerbin, J. and Hibbs, Jr.: Interferon-gamma and tumor necrosis factor induce the L-arginine-dependent cytotoxic effector mechanism in murine macrophages. Eur. Journal Immunology. 18: 1587-1592, 1998.        [ Links ]

28. Nathan, C. F.: Secretory products of macrophages. J. Clinical Investg. 79: 319-326, 1987.        [ Links ]

29. MacMicking, J.; Xie, Q. and Nathan, C.: Nitric Oxide and macrophage function. Annu. Rev. Immunology.15: 323-350, 1997.        [ Links ]

30. González,A.; De Gregory, W.; Vélez, D.; Restrepo, A. and Cano,L.: Nitric Oxide participation in the Fungicidal Mechanism of Gamma Interferon-Activated murine Macrophages against Paracoccidioides brasiliensis Conidia. Infection and Immunity. 2546-2552, 2000.        [ Links ]

31. Cano, L.; Kashino, S.; Arruda, D.: Protective role of gamma interferon in experimental pulmonary Paracoccidioidomycosis. Infection and Immunity. 66: 800-806, 1998.        [ Links ]

32. Michaliszyn, E.; Senechal, S.; Martel, P.: Repentigny Lack of involvement of nitric oxide in killing of Aspergillus fumigatus conidia by pulmonary alveolar macrophages. Infection Immunity 63: 2075-2078, 1995.        [ Links ]

33. Bocca, A.; Hayashi, E.; Pinheiro, A.; Furlanetto, A. et al.: Treatment of Paracoccidioides brasiliensis-infected mice with a Nitric Oxide inhibitor prevents failure of cell-mediated immune response. The Journal of Immunology. 3056-3062, 1998.        [ Links ]

34. Castañeda, E. and Brummer, E. et al: Chronic pulmonary and disseminated Paracoccidioidomycosis in mice: quantitation of progression and chronicity. J. Med. Vet. Mycol. 25: 377, 1987.        [ Links ]

35. Kashino, S.; Fazioli, R. A.; Cafalli-Favati, et al.: Resistance to Paracoccidioides brasiliensis infection is linked to a preferencial Th1 immune response,whereas susceptibility is associated wtih absence of IFN-gamma production. Journal of interferon and cytokine research.20(1): 89-97. 2000.        [ Links ]

36. Geztesi, J. L.; Amorin Dias, M.; de Souza, A.; Almeida, S. and Lopes, J. D.: Paracoccidioides brasiliensis induces a peculiar pattern of inflammatory and immune response. Mycopathologia 145: 7-14, 1999.        [ Links ]

37. Cano, L. E.; Arango, R. et al.: Killing of Paracoccidioides brasiliensis conidia by pulmonary macrophages and the effect of cytokines. J. of Medical and Veterinary Mycology 30, 161-168, 1992.        [ Links ]