Factores de virulencia e inmunidad en criptococosis
Dolande Franco, M.

Departamento de Micología, Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", Caracas.

Resumen

    La patogénesis de la criptococosis se asocia a múltiples factores de virulencia, como la cápsula y la producción de melanina principalmente. El polisacárido capsular contiene un alto porcentaje de glucuronoxylomanan (GXM), lo que impide la fagocitosis y la migración de leucocitos, y genera supresión de la proliferación de linfocitos T. La producción de melanina evita la producción de factor de necrosis tumoral (TNF) por macrófagos, y éste es necesario para generar una respuesta inmune celular protectora. Por los estudios revisados se puede concluir que el punto de virulencia de Cryptococcus neoformans es multifactorial, y depende de las diferencias cuantitativas en la expresión de los numerosos factores, como también de las características que regulan las distintas vías de estos factores. Todavía queda mucho por investigar para realmente establecer los mecanismos de defensa que ayudarían a inactivar la enfermedad, y así conocer más profundamente el hongo y poder vencerlo.

Palabras-clave: Criptococosis, virulencia, inmunidad.

Virulence and immunity factors in cryptococosis

Abstract

    The pathogenesis in cryptococosis is associated to multiple virulence factors of which capsule and melanin production are the most important. The polysacaride capsule has a high amount of glucuronoxylomannan (GXN) which impedes phagocytosis, migration of leucocytes and suppresses T-linfocytes proliferation. Melanin blocks the production of tumoral necrosis factor (TNF) by macrophages, necessary to induce the protective immune cellular response. A number of studies have concluded that C. neoformans' virulence is produced by several factors and is dependent on the quantitative differences in their expression and also the characteristics that regulate these factors pathways. Much research should be made in the future to have a better knowledge of this fungus to enable us to establish the mechanisms of defense that contribute towards the control and resolution of the disease.

Introducción

    La criptococosis es una enfermedad micótica, que se adquiere por inhalación de blastosporas disecadas, afectando los pulmones; en algunos casos la enfermedad es subclínica o se autolimita. El agente etiológico es Cryptococcus neoformans.

    Cerca del 10% de los individuos afectados sufren criptococosis pulmonar primaria; el hongo entra al torrente sanguíneo para diseminarse a otros tejidos. Este organismo tiene predilección por el sistema nervioso central (SNC) y, por tanto, la enfermedad es diagnosticada en la mayoría de los casos como criptococosis meníngea. Usualmente en los pacientes se detectan niveles de antígeno polisacarídico capsular de Cryptococcus en suero o líquido cefalorraquídeo (LCR). La envoltura celular de este hongo se compone de una pared celular rígida, constituida principalmente por glucanos; un polisacárido capsular GXM conteniendo manosa, xilosa, ácido glucurónico y o-acetil; y al menos dos carbohidratos antigénicos menores, galactoxylomannan (GalXM) y mannoproteínas (MP). GXM es un polisacárido viscoso, que junto a GalXM y MP constituyen cerca del 88 y 12% respectivamente, de la masa capsular. Los tres compuestos son antígenos serológicamente distintos, y al menos dos de éstos, GXM y MP, tienen efectos separados sobre el sistema inmune (1). Probablemente, cuando un individuo se expone a la inhalación del hongo la mayoría de los microorganismos que entran a los pulmones son eliminados por mecanismos de resistencia natural mediados por leucocitos polimorfonucleares (LPMN) y células asesinas naturales (NK) y, en menor grado, por macrófagos alveolares; sin embargo, cuando la dosis infectiva inicial de criptococos es alta, la defensa celular natural no es capaz de eliminar completamente los organismos de los pulmones, y el huésped contará con mecanismos de inmunidad celular efectivos en la eliminación del hongo. Cabe destacar que diversas investigaciones indican que la capacidad de la célula fagocítica para eliminar la infección pulmonar por este hongo está directamente relacionada con el tamaño y la composición de la cápsula. La fagocitosis de levaduras encapsuladas está inhibida por el tamaño de la misma.

    En la mayoría de los individuos inmunocompetentes infectados con C. neoformans la erradicación de éstos resulta de la combinación de los mecanismos de resistencia naturales y efectivos (2).

    La respuesta inmune humoral de C. neoformans ha sido estudiada en ambos modelos, humano y animal. Los anticuerpos anti-criptococos aparecen tempranamente en la enfermedad en pacientes con criptococosis no meníngea y ocasionalmente después de una terapia exitosa. Aunque los anticuerpos anti-criptococos no son de tectables en la mayoría de los pacientes con criptococosis, cuando éstos son detectables en títulos crecientes es una señal de resultado favorable. Estas observaciones parecen sugerir que los anticuerpos anti-criptococos juegan un papel en la protección, pero es controversial en los estudios en animales, donde el resultado no es igual; no hay soporte consistente en este aspecto. Los estudios indican, al parecer, que la producción de anticuerpos anti-criptococos está controlada por un marcador genético del huésped, por mecanismos de inmunorregulación, o por ambos (3).

    La inmunidad mediada por células (IMC) es la mayor defensa contra la diseminación de la criptococosis; ambas subpoblaciones linfocitarias (CD4+ y CD8+) han demostrado ser importantes en la eliminación de la levadura cuando se encuentra localizada. Existen dos funciones fundamentales en la efectividad de la IMC: la linfoproliferación y la liberación de citoquinas, para neutralizar o eliminar a los microorganismos. La respuesta inmune específica está determinada por un set de citoquinas producidas por células TCD4+ (Th). Las Th1 secretan IFN-g e IL-2, las cuales impulsan la respuesta inmune celular por activación de células T y estimulación de fagocitos mediados por las defensas del huésped, y las Th2 secretan IL-4 e IL-10, las cuales inhiben la función de macrófagos. La IL-4 también estimula células B productoras de anticuerpos. Una respuesta Th en perfecta concordancia parece ser necesaria para la resolución exitosa de la infección. De allí la importancia de que el individuo cuente con un sistema inmune competente, capaz de eliminar cualquier agente extraño que ingrese al cuerpo humano.

Criptococosis

    Es una micosis oportunista causada por una levadura encapsulada, Cryptococcus neoformans, de origen exógeno. Se adquiere por vía inhalatoria, iniciando la infección pulmonar en el 90% de los casos (4, 5), la cual puede cursar de forma sintomática o asintomática, y puede afectar, además, cualquier víscera, músculo, hueso, piel y mucosas, pero tiene afinidad particular por el sistema nervioso central (SNC). La evolución es aguda, subaguda o crónica. La diseminación ocurre en paciente debilitados o con inmunodeficiencias (6).

    Es una enfermedad cosmopolita; se presenta en un 6 a un 13% de los pacientes con infección por VIH en los EE. UU., y aquí en Venezuela hasta en un 13% de los pacientes con SIDA. No tiene predilección por sexo, edad, ni raza; afecta mayormente a individuos con enfermedades neoplásicas, leucemia, diabetes, SIDA y/o colagenopatías, así como a pacientes bajo tratamiento con antibióticos, glucocorticoides, inmunosupresores o transplante de órganos. La mortalidad es del 15 al 30%. Es más frecuente en personas expuestas a excremento de palomas (7).

    El agente causal es una levadura encapsulada, no micelial (C. neoformans), cuyo estado perfecto o teleomorfo es Filobasidiella neoformans, que tiene dos variedades: neoformans y gattii. Se han descrito cuatro serotipos y dos variedades biológicamente distintas: C. neoformans var. neoformans (serotipos A, D y AD) y C. neoformans var. gattii (serotipos B y C). Casi todos los organismos aislados de infección humana son tipo A o D, lo cual se ha reportado en todo el mundo. La variedad gattii tiene distribución geográfica restringida, prevalece en regiones tropicales y subtropicales, y se ha aislado particularmente en California y Australia.

    La cápsula está constituida por polisacáridos como xilosa, manosa y ácido glucurónico, que determinan su virulencia por medio de deterioro en la fagocitosis. Las levaduras acapsuladas producen enfermedad, especialmente cuando hay inmunodeficiencia. El hongo se encuentra como saprófito en frutas o jugos, productos lácteos, de madera, suelo, pasto y, sobre todo, en excremento de aves como palomas (Columba livia); en éstas pasa por el tubo digestivo pero no causa enfermedad, quizás por su alta temperatura corporal de 42ºC.

    Después de la exposición, el hongo penetra por inhalación, y en el 90% se limita a los pulmones, generando infección subclínica que se autolimita; pocas veces entra por ingestión, y la inoculación cutánea es rara y controvertida. La diseminación hematógena ocurre en el 10% de los afectados, principalmente en sujetos debilitados y con inmunodeficiencia, especialmente en pacientes con SIDA. C. neoformans, puede afectar cualquier órgano, con preferencia cerebro y meninges; se cree que esta afinidad se debe a la baja respuesta fagocitaria y presencia de factores nutricionales en esos órganos, o a la ausencia de factores inhibitorios séricos. En las últimas etapas de fungemia puede haber criptococomas en pulmones y cerebro. Las lesiones en piel pueden preceder hasta dos a ocho meses a las manifestaciones sistémicas.

    Los criadores de palomas tienen infección demostrada por las concentraciones elevadas de anticuerpos, más no la enfermedad. La afección pulmonar por lo general es asintomática; a veces hay tos con expectoración, hemoptisis y fiebre.

    Se disemina a cualquier órgano, en especial hígado, riñón, próstata, huesos o articulaciones. En el SNC se manifiesta por cefalea frontotemporal y retroocular (75%), náuseas y vómitos (10%), confusión mental, psicosis, visión borrosa, fotofobia, nistagmo; después hay rigidez de nuca y signos positivos de Kernig y Brudzinski (50%). El diagnóstico de laboratorio es bastante fácil y sencillo, y se establece mediante la detección de antígeno polisacarídico capsular en líquido cefalorraquídeo o suero, además de tinciones, examen directo con tinta china y siembra en cultivos para la obtención del microorganismo (8).

    Los principales factores de virulencia de Cryptococcus neoformans que han sido estudiados independientemente son: la cápsula, producción de melanina, tipo de apareamiento y producción de manitol (9). El polisacárido capsular de C. neoformans contiene mayormente glucuronoxylomanan GXM); es un factor de virulencia prominente, porque el tamaño de la cápsula impide la fagocitosis. También exhiben heterogeneidad estructural y ésta puede ser demostrada dentro de un simple serotipo. El polisacárido capsular intravascular soluble impide la migración de leucocitos en el sitio de inflamación aguda o crónica, causado por neutrófilos y linfocitos que desprenden de la superficie L-selectina e inducen respuesta inmune; esa inmunidad es de baja regulación.

    La patogénesis de la enfermedad se asocia con múltiples factores de virulencia. Existen investigaciones donde se estudiaron dos aislados de Cryptococcus neoformans, los cuales eran altamente divergentes en su nivel de síntesis capsular in vivo y en su virulencia para los ratones. El aislado altamente virulento (NU-2) produce más cápsula que los aislados débilmente virulentos (184-A) in vitro, bajo condiciones de cultivo de tejido, e in vivo. Estas investigaciones se realizaron para determinar si hubo diferencias entre los dos aislados, entre otros factores que pudieran contribuir también a la virulencia (10). La proporción de crecimiento no fue un factor para N U-2, el cual creció más lentamente que 184-A. Basados en identificación por PCR, los dos aislados fueron genéticamente diferentes, proporcionando una oportunidad para examinar los múltiples rasgos o toques de virulencia. Análisis cuantitativos revelaron que los N U-2 expresaron significativamente más melanina y manitol que los 184-A, aunque los aislados expresaron el mismo quimiotipo capsular. N U-2 produce adicionalmente una estructura reportada como grupo (SRG) bajo condiciones de tejido celular, que no estaba presente cuando crecieron en medio basal con sales, glucosa y urea (GSU).

    El polisacárido capsular (SRG) de 184-A fue natural o inafectado por los cambios en las condiciones de crecimiento en GSU a condiciones de tejido celular. Los resultados sugieren que la patogénesis de C. neoformans está dictada por la expresión cuantitativa de cepas con rasgos de virulencia combinada, reguladores de la expresión de estos genes, por lo que pueden jugar un rol importante en la virulencia. También existen estudios que avalan la regulación diferencial de la respuesta inmune en los aislados de C. neoformans de alta y débil virulencia; para ello se estudió la respuesta inflamatoria temprana, respuesta de hipersensibilidad retardada (DTH) y perfil de citoquinas en ratones infectados por vía pulmonar con aislados altamente virulentos (N U-2) y débilmente virulentos (184-A) de C. neoformans; después de la infección N U-2 permanece en los pulmones, y la cápsula se vuelve más pronunciada durante las primeras 24 horas, mientras que 184-A induce reacción inflamatoria inmediata y es rápidamente eliminado de los pulmones. El antígeno criptocócico (GXM) aparece en suero tempranamente después de la infección con N U-2 y el incremento sobre el período de observación total. El GXM no fue detectable en suero de los ratones infectados con 184-A; ambos aislados de C. neoformans inducen respuesta inmune celular anticriptocócica, pero la respuesta tuvo un perfil diferente. La hipersensibilidad retardada en ratones infectados con N U-2, aparece por el día 15 después de la infección y disminuye hacia el día 21, mientras que la hipersensibilidad retardada en ratones infectados con 184-A se presentó por el día 5 y continuó incrementándose (11).

    Los Th1 y citoquinas (IL-2 y g-INF) fueron producidas por células del bazo tempranamente, después de la infección con uno u otro aislado. Los ratones infectados con N U-2 perdieron la capacidad de producir estas citoquinas, pero los infectados con 184-A la conservaron. Las citoquinas IL-4 y Th-2 no fueron detectadas en ratones infectados. La citoquina IL-10 regulatoria fue tempranamente producida por las células del bazo, pero no más tarde después de la infección con aislados de alta virulencia, y no es producida por las células esplénicas de los ratones infectados con 184-A. La deficiencia de IL-10 en ratones que sobrevivieron a la infección con N U-2 es significativamente más larga que en los ratones tipo silvestre, lo que sugiere que la IL-10 es importante en la protección de la respuesta inmune de baja regulación. La inducción de anergia parece ser responsabilidad de la incapacidad de los ratones infectados con N U-2 para controlar la infección por C. neoformans (11, 12).

    Existe una gran variedad de estudios que soportan la relación estrecha con la inmunidad celular. La inmunidad celular es crítica para la defensa del huésped ante la infección por C. neoformans, como se demostró por numerosos estudios en animales y la prevalencia de la infección en pacientes con SIDA (13). Estudios previos han establecido que la cápsula polisacarídica contribuye a la virulencia de C. neoformans, por supresión en la proliferación de linfocitos T, la cual refleja una expansión clonal de linfocitos T que es una marca de contraste de la inmunidad celular (14, 15). Otras investigaciones señalan que la identificación de mecanismos mayores por los cuales la proliferación de linfocitos daña el polisacárido, debido a que el polisacárido capsular tiene el potencial de afectar el desarrollo de la respuesta del linfocito T por estimulación en la producción de IL-10, inhibición de la fagocitosis e inducción de la eliminación de receptores de la superficie celular. Teniendo establecido que el polisacárido deteriora la fagocitosis, se efectuaron estudios para determinar si la opsonización con suero humano o anticuerpos anticapsulares puede revertir este efecto. La proliferación de linfocitos que fueron inducidos por polisacáridos puede ser aumentada a través de la opsonización con anticuerpos monoclonales de suero humano, sugiriendo que los anticuerpos antipolisacarídicos pueden mejorar la defensa del huésped por restablecimiento de la cantidad de organismos y presentación subsecuente de linfocitos T. Estos estudios soportan el potencial terapéutico para estimular la inmunidad celular a C. neoformans con anticuerpos anticapsulares (16, 17).

    El segundo rasgo de virulencia de Cryptococcus neoformans es la melanina; ésta actúa como un antioxidante, que protege al hongo de la destrucción intracelular por las células fagocíticas. Además, la melanina evita la producción de factor de necrosis tumoral (TNF) por los macrófagos (18), y éste es necesario para generar una respuesta inmune celular protectora. El mecanismo por el cual el tipo de apareamiento afecta la virulencia no está definido todavía. La capacidad de la levadura para producir manitol ha sido implicada en la virulencia, por la capacidad del manitol de recoger los radicales libres, y de este modo se inactivan los mecanismos de muerte intracelular (19, 20).

    La capacidad de C. neoformans para sintetizar melanina polimerizada in vitro ha sido asociado con la virulencia, pero no está claro si este hongo sintetiza melanina polimerizada durante la infección. El estudio en cuestión se basó en dos aproximaciones: 1) involucra la generación de anticuerpos monoclonales de melanina, para usarlos en estudios inmunohistoquímicos de C. neoformans en roedores infectados en el otro (2), busca la melanina fúngica de los tejidos infectados. La digestión de la melanina in vitro de células fúngicas con proteasas desnaturalizantes y ácidos concentrados calientes produce partículas de melanina que se mantienen en la superficie del hongo y anteriormente era llamada melanina fantasma. Ratones Balb/C fueron inmunizados con melanina fantasma y dos inmunoglobulinas M (IgM) anti melanina fueron producidas por el bazo de uno de los ratones. Análisis por inmunofluorescencia de tejidos pulmonar y cerebral de roedores infectados con melanina tipo silvestre producida (Mel+) por cepas de C. neoformans demostró la unión de anticuerpos antimelanina a la pared celular del hongo. La desunión fue observada cuando la infección se efectuó con cepas de C. neoformans mutantes albino (Mel-). Partículas con similitud sorprendente a la melanina fantasma fueron recubiertas después de la digestión por Mel+ en tejidos de pulmón y cerebro de roedores infectados y fueron reactivos con los anticuerpos anti melanina. Otros elementos recubrieron los tejidos infectados con C. neoformans de Mel. Las cepas de C. neoformans Mel+ crecieron homogéneamente en pulmones y cerebro y en agar convierten un pigmento ligero; además producen partículas similares a la melanina fantasma por digestión, proporcionando evidencias adicionales que los tejidos de pulmón y cerebro, contienen substrato para la melanización de C. neoformans. Estos resultados demuestran que C. neoformans sintetiza melanina polimerizada durante la infección, la cual tiene implicaciones importantes en la patogénesis y desarrollo de drogas antifúngicas (21).

Discusión y Conclusión

    La cápsula de C. neoformans está compuesta principalmente por glucuronoxylomanan (GXM), y en menor proporción de galactoxylomanan (GALXM). La mayor proteína de la pared celular es la manoproteína (MP). Todos estos componentes son serológicamente distintos, y al menos dos de éstos (GXM y MP) tienen efectos por separado sobre el sistema inmune. Las propiedades inmunosupresivas de GXM han sido documentados exhaustivamente (22, 23), y a la MP se le ha adscrito un papel de inmunopotenciación antigénica, que involucra la respuesta inmune celular; sin embargo, el rol de las MP en la patogénesis de la criptococosis está todavía pobremente caracterizada (24). El origen celular de la secreción de MP no está claro todavía y las moléculas manoproteínas antigénicas con actividad inmunomoduladora no han sido identificadas. La MP está asociada con la pared celular de C. neoformans, la cual tiene un rol en la linfoproliferación de células T, proporcionando una MP criptocócica complicada en el desarrollo de la IMC; existen estudios recientes que demuestran la presencia de otras proteínas en la pared y membrana celular, dotadas con propiedades antigénicas probablemente mitogénicas distintas a la MP y que son capaces de estimular la linfoproliferación.

    Se presume que la protección contra la criptococosis es dependiente, con respecto al desarrollo de células T antígeno-reactivas; sin embargo, la exacta identidad de antígenos criptocócicos responsables de la estimulación de la inmunidad permanece incierta.

    En la mayoría de los estudios donde se analizó y comparó al menos dos cepas de C. neoformans, se demostró la capacidad que tienen para producir por lo menos tres de los principales factores de virulencia, como son la cápsula, producción de melanina y manitol. Igualmente, estos tres factores se produjeron más abundantemente en aislados con alta virulencia. La melanina y el manitol inactivan los mecanismos de muerte intracelular. Además, la melanina impide la producción de TNF-a por macrófagos; estos dos factores de virulencia producen una gran cantidad de cepas de C. neoformans selectivas mejoradas como organismos virulentos. Se reportó que, por la alta producción de melanina en los aislados criptocócicos, éstos fueron más virulentos que los aislados con baja producción de melanina (25).

    Por los estudios revisados se puede concluir que la virulencia de C. neoformans es multifactorial, y depende de las diferencias cuantitativas en la expresión de los numerosos factores, como también las características que regulan las distintas vías de estos factores. Todavía queda mucho por investigar para realmente establecer los mecanismos de defensa que ayudan a inactivar la enfermedad, así como para conocer más profundamente el hongo y de esta manera poder vencerlo. Sin duda, siempre han de existir dos factores fundamentales en el establecimiento de una infección y posterior enfermedad, que son: las condiciones inherentes al huésped (si está inmunocompetente o no) y las características propias del agente, así como ruta de inoculación y la cantidad del mismo; cuando se rompe algún eslabón en esta cadena, que ha de estar en equilibrio con el medio, siempre se producirá la enfermedad.

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